MỞ ĐẦU Biến đổi khí hậu Toàn cầu đi kèm với suy thoái tài nguyên, ô nhiễm môi trƣờng làm thay đổi toàn diện, sâu sắc các hệ sinh thái tự nhiên, dẫn đến sự thay đổi nhiều bệnh đã biết cũng nhƣ sự xuất hiện của nhiều bệnh mới. Đây là những thách thức lớn nhất của nhân loại trong thế kỷ 21. Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là một Hội chứng hay gặp ở ngƣời trƣởng thành - lứa tuổi phải chịu nhiều áp lực từ công việc lao động, xã hội và gia đình cũng nhƣ dễ nhiễm những thói quen sinh hoạt có hại cho sức khỏe nhƣ hút thuốc lá, nhậu nhẹt và rƣợu chè. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, cả những ngƣời 20 tuổi cũng bị chảy máu dạ dày.
Nguyên nhân sự dịch chuyển về tuổi tác của Hội chứng chƣa đƣợc xác định. Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là đợt tiến triển cấp tính của viêm dạ dày mạn tính, có thể biểu hiện bất ngờ và gây ảnh hƣởng nặng nề đến khả năng lao động cũng nhƣ chất lƣợng cuộc sống của ngƣời bệnh. Hội chứng có tỷ lệ tái phát cao sau khi điều trị. Nguyên nhân chính gây viêm dạ dày cấp tính chảy máu vẫn đang còn là vấn đề tranh cãi [6], [30].
Mối liên quan giữa các bệnh lý viêm loét dạ dày và biến chứng chảy máu dạ dày với vi khuẩn Helicobacter pylori đã đƣợc thừa nhận. Các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu đƣợc điều trị khỏi nhờ liệu pháp kháng sinh. Tuy nhiên thực tế y học lâm sàng đã xác nhận, có nhiều trƣờng hợp bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu không nhiễm H. pylori, nhƣng khi phác đồ điều trị có kháng sinh thì mang lại kết quả tốt.
Vấn đề đặt ra là, ngoài H. pylori trong dạ dày ngƣời còn có thể có các loài vi khuẩn nào khác liên quan mà khoa học chƣa biết? Hiện tại, trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về viêm dạ dày cấp tính chảy máu và vì thế có ít thông tin về thành phần 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh. Sự hạn chế này có thể ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu quả điều trị – theo dõi diễn biến bệnh cho bệnh nhân. Xuất phát từ nhu cầu hiểu biết và phục vụ công tác chẩn trị các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ở Việt Nam", với mục tiêu là góp phần tìm hiểu thêm về các vi khuẩn có mặt Microbiota dạ dày của nhóm bệnh nhân này.
Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1. Phân lập các loại vi khuẩn từ bệnh phẩm dạ dày chảy máu ở điều kiện kị khí. Xác định tỷ lệ nhiễm H. pylori của các bệnh nhân.
Định tên các vi khuẩn bằng phƣơng pháp giám định gen 16S rARN. Tham khảo các đặc tính của các vi khuẩn đƣợc phân lập qua các dữ liệu trên Internet. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI Microbiota đƣợc định nghĩa là quần thể vi sinh vật sống trong cùng một ổ sinh thái hoặc ở một giai đoạn địa lý riêng biệt.
Trong cơ thể ngƣời, các Microbiota gồm khoảng 1000 loài khác nhau. Số lƣợng vi khuẩn trong các ổ sinh thái cộng lại khoảng 1014 tế bào vi khuẩn, có khối lƣợng khoảng 2 kg, nhiều gấp 10 lần số tế bào cơ thể ngƣời. Microbiota đƣợc hình thành trong quá trình phát triển của con ngƣời, đạt cao điểm ở tuổi trƣởng thành và thoái hóa ở tuổi già. Nhƣ đã biết, sự ra đời của trẻ sơ sinh gắn liền với sự hình thành nhanh chóng của hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa với số lƣợng lên tới 1011 vi khuẩn trên một gram phân: chỉ 24 tiếng sau khi sinh, các loài vi khuẩn nhƣ Enterobacteriaceae, Enterococcus, Lactobacillus, vi khuẩn gây thối Clostridium và Staphylococcus đã xuất hiện trong phân của trẻ.
Hình 1 giới thiệu sự khác biệt của các Microbiota ở ngƣời trẻ và ngƣời già trên 100 tuổi [24]. Thành phần các vi sinh vật trong các Microbiota có thể thay đổi dẫn đến bệnh tật [24]. Chẳng hạn, các bệnh nhân bị tiểu đƣờng tuýp 2 có Microbiota đƣờng ruột bị thoái hóa. Các vi khuẩn sản xuất butyrate, đóng vai trò quan trọng trong cung cấp năng lƣợng cho các tế bào biểu mô và điều khiển các đáp ứng của tế bào chủ giảm đáng kể, trong khi đó các vi khuẩn gây bệnh mang chức năng khử sulphate và kháng với stress oxy hóa lại tăng [54].
Còn rất nhiều điều chƣa biết về thành phần các Microbiota của ngƣời, do khoảng 99% các loài vi khuẩn không thể nuôi cấy đƣợc trong các phòng thí nghiệm [12]. Hiện nay, các nhà khoa học đang áp dụng Metagenomic kết hợp với Genomic, Tin sinh học để tiếp cận thế giới vi sinh vật. Metagenomics cho phép xác định các loài vi sinh vật có trong quần thể vi sinh vật Microbiota phức tạp không cần nuôi cấy chúng. Phân tích Metagenomic cho thấy, mặc dù các Microbiota có thể khác nhau về thành phần do các chế độ ăn uống, nhƣng mỗi ngƣời đều mang một số vi khuẩn đặc trƣng và không thay đổi theo thời gian, bao gồm 400 loại ở ngƣời khỏe mạnh [36].
4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ngƣời trẻ 24-40 tuổi Ngƣời Ngƣời trăm trăm tuổi tuổi 99-104 99-104 tuổi tuổi Một số Một số vi vi Nhiều vi khuẩn tạo khuẩn tạo khuẩn butyrate và butyrate và tạo loại gây loại gây butyrate bệnh bệnh Hình 1. Sự khác biệt giữa các Microbiota của ngƣời trẻ và ngƣời già [24] Các Microbiota đƣợc chia thành hai loại dựa theo tiêu chí, liệu chúng có gây hại hay không đối với con ngƣời: - Các Microbiota bản địa, bao gồm các vi sinh vật cộng sinh cƣ trú thƣờng xuyên ở mắt và da, đƣờng hô hấp trên, đƣờng tiêu hóa trên và dƣới, đƣờng tiết niệu và sinh sản của phụ nữ và nam giới, dịch cơ thể và máu. - Các Microbiota bệnh, bao gồm các vi sinh vật cơ hội gây hại cho ngƣời. Các loài vi khuẩn sống trong các Microbiota có thể là loài cƣ trú thƣờng xuyên, loài vãng lai và loài đi ngang qua ổ sinh thái.
Trong một số điều kiện đặc biệt, các vi sinh vật cơ hội có thể xuất hiện. Các Microbiota bản địa Microbiota của ngƣời khỏe mạnh hay còn đƣợc gọi là bản địa bao gồm các vi 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sinh vật không gây bệnh, chủ yếu là vi khuẩn và một vài loại nấm, prostist sống ở khoang miệng, thực quản, đƣờng tiêu hóa, mũi, họng, da và vùng gần quanh mắt. Các loài vi sinh vật này giúp đỡ bảo vệ cơ thể ngƣời chống lại các loài vi sinh vật gây bệnh do: i. ganh đua gắn với các tế bào biểu bì hoặc tế bào niêm mạc của ngƣời.
tranh giành vị trí sinh thái. tranh giành thức ăn để sống. iv, tiết ra các chất giết các loài gây bệnh. Các vi sinh vật trong quần thể Microbiota bản địa gồm (i) các loài vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên không gây hại và có mối quan hệ tƣơng hỗ với ngƣời; (ii) các vi sinh vật vãng lai bao gồm các vi sinh vật chỉ tồn tại một thời gian ngắn từ một vài ngày đến vài tuần trong cơ thể ngƣời do không thể cạnh tranh với các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, bị hệ miễn dịch của chủ tấn công và các điều kiện ở mới thích hợp cho sự phát triển của chúng; (iii) các vi sinh vật đi ngang qua một Microbiota đến một Microbiota khác.
Các Microbiota bệnh Trong điều kiện bình thƣờng, các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh vật vãng lai cũng nhƣ các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota bản địa không gây tác hại cho con ngƣời. Tuy nhiên khi Microbiota bản địa thay đổi do nhiều lý do nhƣ bị tổn thƣơng trong các trƣờng hợp viêm nhiễm và các bệnh tự miễn (bệnh Crohn, bệnh loét ruột kết, bệnh viêm khớp, bệnh tiểu đƣờng loại 1, bệnh đa khớp, bệnh béo phì.), một vài trong số các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh vật vãng lai và ngay đến các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota có thể trở thành vi sinh vật cơ hội gây bệnh. Theo y học hiện đại, các nguyên nhân dẫn đến sự hình thành Microbiota bệnh mang các vi sinh vật cơ hội gây bệnh gồm ba khả năng: 1. Hệ miễn dịch của con ngƣời làm việc sai lệch, các quần thể bản địa có thể phát triển vƣợt và chuyển đến các vùng khác của cơ thể.
Ví dụ Escherichia coli thƣờng sống 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com trong ruột non, một khi đi vào bàng quang sẽ gây các bệnh đƣờng tiết niệu. Sự mất cân bằng của các vi sinh vật bản địa xảy ra khi các bệnh nhân dùng kháng sinh phổ rộng. Các vi sinh vật bản địa di dời vào vùng trƣớc kia chúng không ở nhƣ trƣờng trong các vết thƣơng phẫu thuật. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA 1.
Phƣơng pháp cổ điển Để nghiên cứu một hệ vi sinh vật, phƣơng pháp tiếp cận đầu tiên thƣờng đƣợc sử dụng là nuôi cấy và phân lập các vi sinh vật, sau đó dựa trên các đặc điểm kiểu hình cũng nhƣ đặc điểm hình thái, các đặc tính sinh lý, sinh hóa… mà định tên và sắp xếp chúng vào các nhóm [38]. Trong y học, nuôi cấy thành công đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng để xác định sự có mặt của một loài vi khuẩn nào đó trong bệnh phẩm. Mặt khác, qua nuôi cấy có thể thu đƣợc các chủng vi khuẩn dùng cho các nghiên cứu hệ gen vi khuẩn, xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn. Phƣơng pháp sinh học phân tử Vào những năm 1960, các nhà khoa học chú ý đến gen 16S rARN vì chúng bảo tồn cao ở các loài vi khuẩn và cổ khuẩn [20].
Các nghiên cứu cho thấy, đột biến của gen 16S rARN xảy ra với tần số thấp [57]. Ngoài ra, các nhà khoa học còn phát hiện trên gen 16S rARN có một vùng riêng đặc thù cho vi khuẩn và một vùng chung đặc trƣng cho tất cả các sinh vật sống. Gen 16SrARN còn chứa 9 vùng siêu biến, ký hiệu V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 và V9 cung cấp các tín hiệu để định danh vi khuẩn. Vùng siêu biến VI có nghĩa trong phân loại.
Dựa trên tính chất này, ngƣời ta thiết kế một vài cặp mồi để khuếch đại gen 16S rARN từ bất cứ loài vi khuẩn nào [19].