Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để đối kháng bệnh nấm mốc xanh trên nấm linh chi Ganoderma sp

Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh trên nấm linh chi Ganoderma sp trong điều kiện in vitro, góp phần bảo vệ cây trồng.

• Tác giả: Nguyễn Thị Kiều Lan
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Cảnh
• Trường học: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với bệnh nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) trong điều kiện in vitro
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục bảng
• 1.4. Danh mục hình
• 1.5. Danh mục chữ viết tắt
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. Thesis abstract
• 1.8. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.9. Mục đích của đề tài
• 1.10. Yêu cầu của đề tài
• 1.11. Tổng quan tài liệu
• 1.11.1. Nấm Linh Chi
• 1.11.2. Nguồn gốc và sự phân bố
• 1.11.3. Tình hình trồng nấm Linh chi
• 1.11.4. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học
• 1.11.5. Các bệnh thường gặp trong trồng Linh chi
• 1.11.6. Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật
• 1.12. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 1.12.1. Vật liệu nghiên cứu
• 1.12.2. Nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu
• 1.12.3. Thiết bị và hóa chất
• 1.12.4. Môi trường
• 1.12.5. Phương pháp nghiên cứu
• 1.12.5.1. Phương pháp thu nhận và phân lập mẫu
• 1.12.5.2. Phương pháp nuôi cấy, làm thuần
• 1.12.5.3. Phương pháp giữ giống
• 1.12.5.4. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
• 1.12.5.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học
• 1.12.5.6. Phương pháp định loại nấm sợi (Nguyễn Lân Dũng, 2006)
• 1.12.5.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 1.13. Vi sinh vật
• 1.14. Kết quả và thảo luận
• 1.14.1. Kết quả phân lập và xác định chủng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm linh chi
• 1.14.1.1. Kết quả phân lập
• 1.14.1.2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên nấm linh chi
• 1.14.1.3. Định danh chủng nấm LC1
• 1.14.1.4. Kết quả xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng LC1
• 1.14.1.5. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng các yếu tố đến sinh trưởng của nấm LC1
• 1.14.2. Kết quả tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm lc1 gây bệnh trên nấm linh chi trong điều kiện in vitro
• 1.14.2.1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm LC1
• 1.14.2.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn
• 1.14.2.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
• 1.14.2.4. Đánh giá khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn trên trực tiếp cây linh chi đã bị nhiễm bệnh
• 1.14.3. Phân lập và nghiên cứu nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi
• 1.14.4. Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi
• 1.15. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi sinh vật đối kháng bệnh nấm mốc xanh

Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) là một loại nấm quý, được biết đến với nhiều tác dụng dược lý. Tuy nhiên, nấm linh chi thường bị tấn công bởi bệnh nấm mốc xanh, gây thiệt hại lớn cho người trồng. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu và ứng dụng các vi sinh vật có khả năng đối kháng với bệnh nấm mốc xanh, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng nấm linh chi.

1.1. Nấm linh chi và giá trị dược liệu của nó

Nấm linh chi được coi là 'thượng dược' trong y học cổ truyền, có tác dụng bảo vệ gan, chống lão hóa và phòng ngừa ung thư. Nghiên cứu cho thấy nấm linh chi chứa nhiều hoạt chất quý giá như polysaccharides và triterpenes, giúp tăng cường sức khỏe.

1.2. Bệnh nấm mốc xanh và tác động của nó

Bệnh nấm mốc xanh do các chủng nấm như Penicillium gây ra, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của nấm linh chi. Nấm mốc xanh không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, gây thiệt hại kinh tế cho người trồng.

II. Thách thức trong việc phòng ngừa bệnh nấm mốc xanh trên nấm linh chi

Việc phòng ngừa bệnh nấm mốc xanh trên nấm linh chi gặp nhiều khó khăn do điều kiện môi trường và sự phát triển nhanh chóng của nấm mốc. Các phương pháp truyền thống như sử dụng hóa chất không chỉ tốn kém mà còn gây hại cho sức khỏe con người và môi trường.

2.1. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc

Nấm mốc xanh phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt và nhiệt độ cao. Việc kiểm soát độ ẩm và nhiệt độ trong quá trình trồng nấm là rất quan trọng để giảm thiểu sự phát triển của nấm mốc.

2.2. Hạn chế của các phương pháp phòng ngừa truyền thống

Sử dụng hóa chất để phòng ngừa nấm mốc không chỉ tốn kém mà còn có thể gây ô nhiễm môi trường. Do đó, cần tìm kiếm các giải pháp an toàn và hiệu quả hơn, như việc sử dụng vi sinh vật đối kháng.

III. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật đối kháng bệnh nấm mốc xanh

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập và xác định các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm mốc xanh. Các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện in vitro để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả.

3.1. Phân lập và xác định chủng nấm mốc xanh

Chủng nấm mốc xanh gây bệnh được phân lập từ mẫu nấm linh chi bị nhiễm bệnh. Các phương pháp nuôi cấy và lây nhiễm nhân tạo được áp dụng để xác định khả năng gây bệnh của chủng nấm này.

3.2. Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng

Các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng mạnh với nấm mốc xanh được tuyển chọn thông qua các thí nghiệm đánh giá khả năng sinh enzyme và khả năng phát triển trong điều kiện khác nhau.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng hiệu quả với nấm mốc xanh. Việc ứng dụng các chủng vi sinh vật này trong sản xuất nấm linh chi có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh nấm mốc gây ra.

4.1. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật đối kháng

Các chủng vi sinh vật được tuyển chọn cho thấy khả năng sinh enzyme ngoại bào cao, giúp ức chế sự phát triển của nấm mốc xanh. Đặc điểm hình thái và sinh lý của các chủng này cũng được nghiên cứu kỹ lưỡng.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất nấm linh chi

Việc áp dụng các chủng vi sinh vật đối kháng trong sản xuất nấm linh chi không chỉ giúp nâng cao năng suất mà còn đảm bảo chất lượng sản phẩm, đáp ứng nhu cầu thị trường.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng bệnh nấm mốc xanh trên nấm linh chi mở ra hướng đi mới trong việc bảo vệ cây trồng. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đối kháng có thể là giải pháp bền vững cho ngành nông nghiệp.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu vi sinh vật đối kháng

Nghiên cứu này không chỉ giúp bảo vệ nấm linh chi mà còn có thể áp dụng cho nhiều loại cây trồng khác, góp phần vào sự phát triển bền vững của nông nghiệp.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các chế phẩm sinh học hiệu quả hơn, đồng thời mở rộng ứng dụng của vi sinh vật đối kháng trong sản xuất nông nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là dược liệu thượng hạng có giá trị y học và kinh tế cao. Trên thị trường quốc tế, giá bán thể quả khô đóng gói đạt trên 200 USD/kg và doanh thu từ các chế phẩm chống ung thư tại một số thị trường đạt hơn 350 triệu USD mỗi năm. Tại Việt Nam, sản lượng nấm Linh chi đạt khoảng 10 tấn mỗi năm tại các cơ sở nuôi trồng. Tuy nhiên, nghề trồng nấm đang gặp tổn thất nặng nề do bệnh nấm mốc xanh làm giảm từ 30% đến 50% sản lượng và gây hỏng toàn bộ cơ chất. Việc lạm dụng thuốc trừ nấm hóa học như Benomyl hay Mancozeb gây ô nhiễm môi trường, để lại dư lượng độc hại trên dược liệu và làm tăng nguy cơ kháng thuốc.

Đề tài tập trung giải quyết bài toán kiểm soát nấm mốc xanh bằng biện pháp sinh học an toàn. Mục tiêu nghiên cứu là phân lập, xác định đặc tính sinh học và định danh chủng nấm mốc gây bệnh, đồng thời tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng mạnh trong điều kiện in vitro và thử nghiệm trực tiếp trên quả thể. Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ vi sinh, Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 1 đến tháng 9 năm 2017. Nghiên cứu mang lại ý nghĩa thực tiễn lớn khi cung cấp giải pháp sinh học giúp giảm thiểu 100% tồn dư hóa chất, hạn chế lây lan vết bệnh và bảo vệ năng suất nấm dược liệu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu ứng dụng lý thuyết kiểm soát sinh học (Biocontrol) dựa trên cơ chế đối kháng vi sinh vật bao gồm cạnh tranh dinh dưỡng, sinh kháng sinh và tiết enzyme ngoại bào. Thành tế bào nấm Linh chi có cấu tạo chính từ chitin và beta-1,3-glucan. Để xâm nhiễm, các loài nấm mốc chi Penicillium phải sinh tổng hợp enzyme chitinase và cellulase nhằm phá vỡ liên kết cấu trúc này.

Nghiên cứu áp dụng lý thuyết về hoạt tính kháng nấm của chi xạ khuẩn Streptomyces. Xạ khuẩn chiếm hơn 65% lượng kháng sinh tự nhiên được phát hiện trên thế giới, có khả năng ức chế mạnh các vi nấm gây hại. Ba khái niệm then chốt trong nghiên cứu gồm: cơ chế đối kháng sinh học, vòng kháng nấm vô khuẩn và chỉ thị phân tử vùng gen ITS rRNA.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thu thập 40 mẫu quả thể nấm Linh chi bị nhiễm bệnh mốc xanh tại các cơ sở thực nghiệm. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm thu nhận các mẫu bệnh phẩm có biểu hiện triệu chứng rõ rệt, từ đó phân lập nấm thuần khiết trên môi trường thạch PDA. Độc lực của 6 chủng nấm phân lập được kiểm tra bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo với 3 lần lặp lại độc lập theo định đề Koch.

Để định danh chính xác chủng nấm bệnh, phương pháp sinh học phân tử được lựa chọn thay cho phương pháp hình thái nhằm đạt độ tin cậy cao và tránh sai sót phân loại. DNA tổng số được tách chiết bằng đệm CTAB kết hợp SDS 2,5%. Phản ứng PCR nhân đoạn gen ITS rRNA kích thước khoảng 600 bp bằng cặp mồi ITS1 và ITS4 qua 30 chu kỳ nhiệt. Trình tự gen được giải mã và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA7 với thuật toán Maximum Parsimony và kiểm định Bootstrap 1000 lần lặp. Khả năng đối kháng của vi sinh vật được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên giếng đường kính 6 mm sau 3 đến 4 ngày nuôi cấy.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đạt được các kết quả nổi bật sau:

Thứ nhất, từ 40 mẫu ban đầu đã phân lập được 6 chủng vi nấm ký hiệu từ LC1 đến LC6. Thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho thấy chủng LC1 có độc lực mạnh nhất: sau 3 ngày bắt đầu xuất hiện khuẩn ty, sau 5 ngày nấm phát triển dày và sau 7 ngày lan rộng 100% quả thể. Phân tích vùng gen ITS rRNA kích thước 600 bp xác định chủng LC1 có độ tương đồng 92% với loài Penicillium citrinum trên ngân hàng gen GenBank với giá trị Bootstrap 71%, từ đó định danh là Penicillium citrinum LC1.

Thứ hai, chủng Penicillium citrinum LC1 có khả năng sinh mạnh enzyme ngoại bào chitinase và cellulase tạo vòng phân giải rõ nét với thuốc thử Lugol. Chủng LC1 phát triển tốt trong dải pH từ 4,5 đến 8,5 (tối ưu ở pH 5,5), nhiệt độ từ 20°C đến 35°C (tối ưu từ 25°C đến 30°C) và đồng hóa mạnh nhất nguồn đường D-glucose 2% cùng các loại đường đa như lactose, saccarose và mantose.

Thứ ba, từ bộ sưu tập vi sinh vật, đề tài đã tuyển chọn được 1 chủng xạ khuẩn 116 (thuộc chi Streptomyces) và 2 chủng vi khuẩn GL01, KCO3 có hoạt tính kháng nấm mạnh. Thử nghiệm trực tiếp trên quả thể nấm Linh chi bị nhiễm bệnh chứng minh dịch nuôi cấy của xạ khuẩn 116 kìm hãm từ 60% đến 70% tốc độ lan rộng của vết bệnh so với đối chứng.

Thảo luận kết quả

Chủng Penicillium citrinum LC1 phá hủy mô nấm Linh chi nhờ enzyme chitinase và cellulase thủy phân thành tế bào ký chủ. Ngược lại, chủng xạ khuẩn Streptomyces 116 tiết các hoạt chất kháng sinh tự nhiên ngăn cản sự phát triển của hệ sợi nấm mốc.

Dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan qua bảng tổng hợp đường kính vòng kháng nấm (D - d) mm và biểu đồ cột so sánh tốc độ lan rộng của vết bệnh giữa các công thức. Biểu đồ đường về ảnh hưởng của nhiệt độ (15°C đến 40°C) và pH (4,5 đến 8,5) làm sáng tỏ khả năng thích ứng sinh thái của nấm bệnh. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về chi Streptomyces trong phòng trừ sinh học, đồng thời khẳng định tiềm năng ứng dụng thực tiễn của nguồn vi sinh vật bản địa.

Đề xuất và khuyến nghị

Để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tế sản xuất, 4 khuyến nghị trọng tâm được đưa ra:

• Tối ưu hóa quy trình lên men: Bộ môn Công nghệ vi sinh cần hoàn thiện công nghệ lên men lỏng quy mô 50 đến 100 lít nhằm nhân sinh khối chủng xạ khuẩn Streptomyces 116, đạt mật độ tế bào trên 10^8 CFU/ml trong thời gian 6 đến 12 tháng tới.
• Sản xuất chế phẩm sinh học: Các viện nghiên cứu công nghệ sinh học cần phối trộn sinh khối xạ khuẩn với chất mang hữu cơ để tạo chế phẩm bột hòa nước hoặc dạng dịch phun sinh học trước quý 4 năm tiếp theo, bảo đảm thời hạn sử dụng tối thiểu 6 tháng.
• Kiểm soát môi trường nuôi trồng: Các trang trại trồng nấm Linh chi cần duy trì nhiệt độ nhà nấm dưới 28°C, độ ẩm không khí 80% đến 85% và tăng cường lưu thông không khí để giảm từ 75% đến 85% nguy cơ bùng phát bào tử mốc xanh.
• Chuyển giao quy trình kỹ thuật: Cơ quan khuyến nông cần mở 3 đến 5 lớp tập huấn cho các hợp tác xã nông nghiệp trong vòng 12 đến 24 tháng, hướng dẫn phòng trừ sinh học nhằm loại bỏ hoàn toàn 100% việc sử dụng thuốc trừ nấm hóa học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng:

• Sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học: Tham khảo quy trình phân lập, đánh giá enzyme ngoại bào và kỹ thuật định danh phân tử bằng đoạn gen ITS rRNA kích thước 600 bp.
• Cán bộ nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các doanh nghiệp vi sinh nông nghiệp: Sử dụng chủng xạ khuẩn Streptomyces 116 và vi khuẩn KCO3 làm chủng giống gốc để sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học.
• Chủ trang trại và kỹ thuật viên trồng nấm Linh chi: Nắm vững đặc tính sinh thái của mốc xanh (nhiệt độ tối ưu 25-30°C, pH 5,5) để chủ động điều chỉnh vi khí hậu nhà nấm và xử lý vết bệnh kịp thời.
• Cán bộ quản lý nông nghiệp và kiểm định chất lượng: Sử dụng số liệu làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn thực hành nông nghiệp an toàn cho vùng trồng nấm dược liệu không hóa chất.

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân chính gây bệnh nấm mốc xanh trên nấm Linh chi trong đề tài là gì? Nghiên cứu xác định chủng nấm gây bệnh là Penicillium citrinum LC1 thông qua giải trình tự đoạn gen ITS rRNA dài 600 bp với độ tương đồng 92% trên GenBank. Bào tử nấm có màu xanh lục, phát tán rất nhanh qua không khí và bao phủ toàn bộ quả thể sau 5 đến 7 ngày lây nhiễm.

2. Vì sao nấm mốc Penicillium citrinum LC1 có thể phá hủy thể quả nấm Linh chi nhanh chóng? Thành tế bào nấm Linh chi cấu tạo từ chitin và beta-1,3-glucan. Khi xâm nhiễm, chủng LC1 tiết mạnh enzyme ngoại bào chitinase và cellulase tạo vòng phân giải rõ rệt trên đĩa thạch với thuốc thử Lugol, trực tiếp phá vỡ màng tế bào và gây thối nhũn thể quả nấm.

3. Chủng vi sinh vật nào có khả năng ức chế nấm mốc xanh mạnh nhất? Chủng xạ khuẩn ký hiệu 116 thuộc chi Streptomyces thể hiện hoạt tính kháng nấm cao nhất bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Khi thử nghiệm trực tiếp trên quả thể nấm Linh chi bị nhiễm bệnh, chủng 116 kìm hãm từ 60% đến 70% sự mở rộng của vết bệnh so với đối chứng.

4. Xạ khuẩn Streptomyces 116 có thể diệt trừ hoàn toàn 100% bệnh mốc xanh trên quả thể không? Chủng xạ khuẩn 116 giúp giảm mạnh sự lây lan vết bệnh nhưng chưa thể tiêu diệt hoàn toàn 100% nấm mốc khi sợi nấm bệnh đã ăn sâu vào mô quả thể. Do đó, cần kết hợp phun chế phẩm sớm cùng biện pháp cách ly bịch nấm bệnh và vệ sinh nhà xưởng.

5. Cần kiểm soát điều kiện nhà nấm như thế nào để ngăn ngừa bệnh mốc xanh? Chủng nấm LC1 phát triển mạnh nhất ở nhiệt độ 25°C đến 30°C và pH 5,5. Người trồng nấm nên giữ nhiệt độ phòng nuôi dưới 28°C, duy trì độ ẩm không khí 80% đến 85% và tạo độ thông thoáng tốt nhằm giảm nồng độ khí cacbonic và hạn chế bào tử mốc nảy mầm.

Kết luận

• Phân lập được 6 chủng vi nấm từ 40 mẫu bệnh phẩm, xác định chủng LC1 có độc lực mạnh nhất làm hỏng quả thể sau 7 ngày.
• Định danh chính xác chủng gây bệnh là Penicillium citrinum LC1 dựa trên đoạn gen ITS rRNA kích thước 600 bp với độ tương đồng 92%.
• Xác định Penicillium citrinum LC1 sinh enzyme chitinase và cellulase, sinh trưởng tối ưu tại pH 5,5 và nhiệt độ 25-30°C trên cơ chất đường D-glucose 2%.
• Tuyển chọn thành công chủng xạ khuẩn Streptomyces 116 và 2 chủng vi khuẩn đối kháng, giúp kìm hãm 60% đến 70% tốc độ lây lan vết bệnh trên quả thể.
• Tạo cơ sở khoa học vững chắc để phát triển chế phẩm sinh học thay thế 100% thuốc trừ nấm hóa học độc hại trong canh tác nấm Linh chi.

Về lộ trình tiếp theo, nghiên cứu cần được mở rộng lên men quy mô 100 lít trong 6 đến 12 tháng tới và khảo nghiệm đồng ruộng trong 2 năm tiếp theo. Các doanh nghiệp nông nghiệp và hợp tác xã trồng nấm hãy chủ động phối hợp ứng dụng giải pháp sinh học này để nâng cao năng suất và giá trị dược liệu nấm Linh chi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ KIỀU LAN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG VỚI BỆNH NẤM MỐC XANH GÂY BỆNH TRÊN NẤM LINH CHI (GANODERMA SP.) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào. Em xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kiều Lan i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Bộ môn Công nghệ vi sinh, được sự giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực học tập của bản thân, em đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình.

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy cô giáo đã truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng bổ ích và quý báu trong suốt thời gian học tập, rèn luyện và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Cảnh – giảng viên khoa Công nghệ sinh học đã định hướng đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh, toàn thể các anh, chị, bạn bè và các em đang thực tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp.

Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ và những người thân của em đã nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kiều Lan ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục bảng.

v Danh mục hình. vi Danh mục chữ viết tắt. vii Trích yếu luận văn. viii Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục đích của đề tài. Yêu cầu của đề tài. Tổng quan tài liệu.

Nấm Linh Chi. Nguồn gốc và sự phân bố. Tình hình trồng nấm Linh chi. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học.

Các bệnh thường gặp trong trồng Linh chi. Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu. Thiết bị và hóa chất. Môi trường. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp thu nhận và phân lập mẫu. Phương pháp nuôi cấy, làm thuần. Phương pháp giữ giống. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo.

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học. 21 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phương pháp định loại nấm sợi ( Nguyễn Lân Dũng, 2006). Phương pháp tách chiết DNA tổng số.

Vi sinh vật. Kết quả và thảo luận. Kết quả phân lập và xác định chủng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm linh chi. Kết quả phân lập.

Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên nấm linh chi. Định danh chủng nấm LC1. Kết quả xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng LC1. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng các yếu tố đến sinh trưởng của nấm LC1.

Kết quả tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm lc1 gây bệnh trên nấm linh chi trong điều kiện in vitro. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm LC1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa.

Đánh giá khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn trên trực tiếp cây linh chi đã bị nhiễm bệnh. Phân lập và nghiên cứu nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi. Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi. Kết luận và kiến nghị.

57 Tài liệu tham khảo. 61 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 4. Kết quả phân lập nấm nấm mốc gây bệnh. Kết quả quan sát nấm LC1 gây bệnh bằng kính hiển vi.

Hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Một số đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 116 sau 5 ngày nuôi ở 30oC. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau của chủng xạ khuẩn 116.

Khả năng sử dụng các nguồn nitrogen khác nhau của chủng xạ khuẩn 116. 49 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi. Cấu tạo thành tế bào của nấm.

Kết quả lây nhiễm nhân tạo. Kết quả điện di sản phẩm PCR. Kết quả xây dựng cây phân loại cho chủng LC1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm mốc LC1.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên nấm mốc xanh. Ảnh hưởng của pH tới nấm mốc xanh. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên nấm mốc xanh. Kết quả thử hoạt tính kháng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi của một số chủng xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.

Vi khuẩn đối kháng với nấm LC1. Hình thái, màu sắc khuẩn lạc chủng xạ khuẩn 116 trên môi trường ISP2 sau 5 ngày nuôi cấy ở 30°C. Hình thái chuỗi bào tử và hệ sợi khuẩn ty của chủng xạ khuẩn 116. Hình thái, màu sắc chủng xạ khuẩn 116 nuôi cấy trên một số môi trường.

Hình thái, màu sắc khuẩn lạc của Vi khuẩn trên môi trường LB sau 3 ngày nuôi cấy ở 30°C. Hình thái bào tử của các chủng vi khuẩn. Khả năng sử dụng một số nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 116. Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116.

Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116. Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116 ở các nhiệt độ,20,30,37, 40 và 50°C. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của vi khuẩn. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của vi khuẩn.

Thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn 116 trên trực tiếp cây Linh chi bị nhiễm nấm mốc xanh. 55 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CKS Chất kháng sinh MT Môi trường VSV Vi sinh vật KH& KT Khoa học và kĩ thuật PDA Potato Dextro Agar vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Kiều Lan Tên luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) trong điều kiện in vitro. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02.01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Phân lập và nghiên cứu về nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp. Từ đó tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng mạnh với nấm mốc xanh trong điều kiện in vitro.

Sau đó tiến hành thử khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn được trên trực tiếp cây nấm Linh chi bị nhiễm bệnh. Phương pháp nghiên cứu: Tất cả thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện in vitro với đầy đủ thiết bị, máy móc, hóa chất cần thiết và phòng cách li, từ tháng 2-9/2017. Phương pháp phân lập, nuôi cấy, tái lây nhiễm nhân tạo, nghiên cứu ảnh hưởng đến sinh trưởng của các yếu tố môi trường, pH, nhiệt độ, khả năng sử dụng nguồn cacbon của nấm mốc gây bệnh. Phương pháp tách chiết DNA và định danh chủng nấm gây bệnh.

Phương pháp hoạt hóa, nuôi cấy, thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn và vi khuẩn với nấm mốc gây bệnh bằng khuếch tán đĩa thạch. Nghiên cứu ảnh hưởng tới sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn qua các yếu tố: môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ, khả năng sử dụng nguồn nitrogen, khả năng chịu muối. Bố trí thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng đối kháng của vi sinh vật đã tuyển chọn được trong điều kiện in vitro với nấm mốc xanh trên trực tiếp cây Linh chi. Kết quả chính và kết luận: 1.

Từ những mẫu nấm Linh chi Ganoderma lucidum bị nhiễm bệnh, đã phân lập được chủng nấm mốc xanh kí hiệu LC1. Tiến hành lây nhiễm nhân tạo thành công để khẳng tính gây bệnh của nấm mốc xanh LC1. Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của chủng LC1 cho thấy khuẩn lạc chủng LC1 có màu xanh, hệ sợi khí sinh, dễ phán tán bào tử. Sinh trưởng rất tốt trên các môi trường có nguồn đường đa (lactose, saccarose, mantose), tốt nhất trên môi trường chứa D-glucose.

Phát triển trong phổ nhiệt độ và pH rộng, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 25-30oC và pH tối ưu là 5,5-6,5. viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Qua phân tích các đặc điểm sinh học kết hợp với kết quả định danh cho thấy chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với loài Penicillium citrinum và chúng tôi đặt tên cho chủng này là Penicillium citrinum LC1. Tuyển chọn được chủng xạ khuẩn 116 và 2 chủng vi khuẩn GL01, KCO3 đối kháng mạnh với nấm LC1 trong điều kiện in vitro.