Nghiên cứu cải tiến qui trình tổng hợp nguyên liệu mesna và ứng dụng bào chế thuốc tiêm

Mesna, một hợp chất có nhóm thiol, được tổng hợp lần đầu vào năm 1954 và đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ đường… 273 trang · Trường Đại học Bielefeld.

• Trường học: Trường Đại học Bielefeld
• Chuyên ngành: Dược lý
• Đề tài: Cải Tiến Qui Trình Tổng Hợp Mesna Và Ứng Dụng Trong Bào Chế Thuốc Tiêm
• Loại tài liệu: luận án

Tóm tắt

I. Giới thiệu về mesna và qui trình tổng hợp

Mesna, một hợp chất có nhóm thiol, được tổng hợp lần đầu vào năm 1954 và đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ đường tiết niệu trong điều trị ung thư. Tác dụng của mesna chủ yếu là giảm độc tính của các thuốc oxazaphosphorin như ifosfamid và cyclophosphamid. Tuy nhiên, mesna vẫn chưa được sản xuất trong nước, dẫn đến việc cần thiết phải cải tiến qui trình tổng hợp mesna để đáp ứng nhu cầu điều trị. Việc cải tiến này không chỉ giúp giảm chi phí mà còn đảm bảo chất lượng nguyên liệu. Các phương pháp tổng hợp mesna đã được công bố trên thế giới cần được khảo sát và đánh giá để tìm ra phương pháp tối ưu cho sản xuất trong nước.

1.1. Tính chất và ứng dụng của mesna

Mesna có cấu trúc hóa học đơn giản nhưng dễ bị oxy hóa trong môi trường giàu oxy. Tính chất này yêu cầu các biện pháp bảo quản và bào chế đặc biệt để duy trì hiệu lực. Mesna được sử dụng chủ yếu trong điều trị các tác dụng phụ của hóa trị liệu, đặc biệt là bảo vệ bàng quang khỏi độc tính của acrolein. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp tổng hợp mesna mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ cho bệnh nhân.

II. Cải tiến qui trình tổng hợp mesna

Cải tiến qui trình tổng hợp mesna là một trong những mục tiêu chính của nghiên cứu này. Các phương pháp tổng hợp hiện có cần được đánh giá và so sánh để tìm ra phương pháp hiệu quả nhất. Nghiên cứu sẽ khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp, từ nguyên liệu đầu vào đến điều kiện phản ứng. Việc lựa chọn phương pháp tổng hợp mới không chỉ dựa trên hiệu suất mà còn phải đảm bảo tính an toàn và ổn định của sản phẩm. Đặc biệt, việc tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015 là một yêu cầu quan trọng trong qui trình sản xuất.

2.1. Các phương pháp tổng hợp mesna

Nghiên cứu sẽ tổng quan các phương pháp tổng hợp mesna đã được công bố, bao gồm các phương pháp tạo nhóm thiol. Việc đối sánh giữa các phương pháp sẽ giúp xác định ưu nhược điểm của từng phương pháp. Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian phản ứng và tỷ lệ các chất phản ứng sẽ được khảo sát để tối ưu hóa qui trình tổng hợp. Mục tiêu cuối cùng là xây dựng qui trình tổng hợp mesna qui mô 200 g/mẻ, đảm bảo chất lượng và hiệu quả.

III. Ứng dụng mesna trong bào chế thuốc tiêm

Mesna được bào chế dưới dạng dung dịch tiêm với nồng độ 100 mg/ml. Việc xây dựng công thức bào chế và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở cho dung dịch tiêm mesna là một phần quan trọng trong nghiên cứu. Các phương pháp bào chế sẽ được khảo sát để đảm bảo tính ổn định và hiệu quả của sản phẩm. Đặc biệt, việc theo dõi độ ổn định của dung dịch tiêm mesna trong điều kiện bảo quản khác nhau sẽ giúp đánh giá khả năng sử dụng thực tế của sản phẩm trong điều trị.

3.1. Tiêu chuẩn chất lượng và kiểm tra

Tiêu chuẩn kiểm nghiệm của nguyên liệu mesna theo BP 2015 sẽ được áp dụng để đảm bảo chất lượng sản phẩm. Các chỉ tiêu như tính chất vật lý, độ trong và màu sắc của dung dịch, cũng như các tạp chất liên quan sẽ được kiểm tra. Việc đảm bảo mesna đạt tiêu chuẩn chất lượng không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Theo số liệu từ Tổ chức Y tế Thế giới, các ca tử vong do bệnh lý ung thư chiếm tỷ lệ khoảng 70% [13]. Trong phác đồ điều trị hóa chất, các dẫn chất oxazaphosphorin bao gồm ifosfamid (IFM) và cyclophosphamid (CYP) được ứng dụng rộng rãi nhờ hiệu lực đối với nhiều thể ung thư khác nhau, song nhóm dược chất này lại gây độc tính nghiêm trọng trên tủy xương, thận và bàng quang [4], [9], [77]. Mesna (natri 2-mercaptoethansulfonat) là hợp chất có tác dụng giải độc bàng quang nhờ khả năng trung hòa acrolein – chất chuyển hóa gây viêm bàng quang chảy máu của IFM và CYP – đồng thời không làm suy giảm hiệu lực điều trị của các thuốc chống ung thư dùng kèm [4], [25], [31], [71], [78], [85], [133]. Về mặt cấu trúc, mesna chứa hai nhóm chức mang hoạt tính là thiol (-SH) và sulfonat (-SO3Na) liên kết qua cầu ethylen. Do tính khử mạnh của nhóm thiol, mesna rất nhạy cảm với các tác nhân oxy hóa, đặc biệt trong môi trường giàu oxy [61], [103].

Tại Việt Nam, mesna đã được đưa vào Danh mục thuốc thiết yếu lần thứ VI dưới các dạng bào chế gồm viên nén (400 mg, 600 mg) và dung dịch tiêm (100 mg/ml) [7]. Dù nhu cầu lâm sàng tương đối lớn, nguồn nguyên liệu và thành phẩm trong nước hoàn toàn phụ thuộc vào nhập khẩu do quy trình sản xuất chưa khả thi, kỹ thuật tinh chế loại tạp chất chưa đáp ứng tiêu chuẩn và giá thành cao. Từ bối cảnh trên, luận án tập trung nghiên cứu cải tiến các quy trình tổng hợp kinh điển, tìm kiếm phương pháp tổng hợp mới từ nguồn nguyên liệu sẵn có, hướng tới sản xuất nguyên liệu mesna đạt tiêu chuẩn dược dụng và xây dựng công thức thuốc tiêm.

Các mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm:

1. Thiết kế được phương pháp mới tổng hợp mesna.
2. Xây dựng được qui trình tổng hợp mesna qui mô 200 g/mẻ.
3. Đánh giá được độc tính cấp, độ ổn định của nguyên liệu mesna.
4. Xây dựng được công thức bào chế và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml.

Để thực hiện các mục tiêu trên, luận án triển khai 7 nội dung cụ thể:

1. Tổng quan về các phương pháp tổng hợp mesna đã được công bố, các phương pháp tạo nhóm thiol, đối sánh giữa các phương pháp, lựa chọn và đề xuất phương pháp mới tổng hợp mesna.
2. Khảo sát các qui trình tổng hợp mesna bao gồm các phương pháp mới và một số phương pháp đã công bố. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các phản ứng tốt nhất.
3. Tìm kiếm các phương pháp thích hợp để tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015.
4. Phân tích, đánh giá, lựa chọn phương pháp để xây dựng qui trình tổng hợp mesna 200 g/mẻ.
5. Đánh giá độc tính của nguyên liệu mesna được tổng hợp theo phương pháp mới.
6. Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mesna tổng hợp được.
7. Bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml: xây dựng công thức và phương pháp bào chế, đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm tra chất lượng, theo dõi độ ổn định của dung dịch tiêm pha chế ở qui mô phòng thí nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Hoạt chất mesna nguyên liệu (C2H5NaO3S2), các chất trung gian tổng hợp, dạng dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml và động vật thực nghiệm (chuột nhắt trắng cái trưởng thành, khối lượng 20 ± 2 g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Công nghiệp Dược và Bộ môn Dược lực (Trường Đại học Dược Hà Nội), Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội), Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Viện Kiểm nghiệm Quốc gia Việt Nam.
• Phạm vi chuyên môn: Tổng hợp hữu cơ quy mô phòng thí nghiệm và nâng cấp mẻ 200 g, kiểm nghiệm nguyên liệu theo Dược điển Anh (BP 2015), đánh giá độc tính cấp theo hướng dẫn OECD và Bộ Y tế, bào chế dung dịch tiêm 100 mg/ml và theo dõi độ ổn định (lão hóa cấp tốc 40 ± 2 °C / 75 ± 5% RH trong 6 tháng, dài hạn 30 ± 2 °C / 75 ± 5% RH).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu cho thấy các hướng nghiên cứu tổng hợp mesna đã được công bố tập trung vào các lộ trình phản ứng chính:

1. Hướng tổng hợp nguyên liệu trung gian natri 2-halogenoethansulfonat:

• Đi từ 1,2-dibromoethan: C. Schramm và cộng sự (1950) [104] đun hồi lưu 1,2-dibromoethan với Na2SO3 trong ethanol 95% thu hiệu suất 78,6%. C. Marvel và cộng sự (2003) [73] thực hiện phản ứng Strecker đạt hiệu suất 78 - 90%. R. Bai và cộng sự (2013) [22] đạt 75 - 80%. Nhược điểm chính của tác nhân này là giá thành cao và dễ tạo sản phẩm phụ disulfonat do cả hai nguyên tử brom đều có khả năng bị thế bởi nhóm sulfonat.
• Đi từ natri isethionat: K. Kawami và cộng sự (2004) [60] cho phản ứng với HBr 47%, kết tinh thu natri 2-bromoethansulfonat với hiệu suất 48%.
• Đi từ ethylen clorobromid: C. Schramm và cộng sự (1954) [106] thu natri 2-cloroethansulfonat với hiệu suất 89,1 - 90,7%.
• Đi từ 1,2-dicloroethan: E. Otto (1932) [84] tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat trong bình phản ứng bằng đồng. Schramm (1954) [106] đạt hiệu suất 42% với Na2SO3 và 64,3% với K2SO3. R. Bai và cộng sự (2013) [22] đun hồi lưu 1,2-dicloroethan và Na2SO3 với xúc tác bột đồng trong 22 giờ, đạt hiệu suất 81%.
• Đi từ carbyl sulfat: W. Jenkins (1959) [29] và A. Roger [96] cho phản ứng với NaCl hoặc KCl ở 190 - 195 °C, hiệu suất đạt từ 36% đến 66%, có thể đạt 90% ở 195 °C.

Nguyên liệu ban đầu	Tác nhân phản ứng	Sản phẩm	Hiệu suất (%)	Tác giả, năm
1,2-Dibromoethan	Na2SO3	Natri 2-bromoethansulfonat	78,6	C. Schramm (1950) [104]
1,2-Dibromoethan	Na2SO3	Natri 2-bromoethansulfonat	78,0 - 90,0	C. Marvel (2003) [73]
Ethylen clorobromid	Na2SO3	Natri 2-cloroethansulfonat	90,7	C. Schramm (1954) [106]
1,2-Dicloroethan	Na2SO3	Natri 2-cloroethansulfonat	42,0	C. Schramm (1954) [106]
1,2-Dicloroethan	Na2SO3, Cu	Natri 2-cloroethansulfonat	81,0	R. Bai (2013) [22]
Natri isethionat	HBr	Natri 2-bromoethansulfonat	48,0	K. Kawami (2004) [60]
Carbyl sulfat	NaCl	Natri 2-cloroethansulfonat	36,0	W. Jenkins (1959) [29]

2. Hướng tổng hợp mesna từ các chất trung gian:

• Qua trung gian muối thiouroni: C. Schramm (1954) [104], [106] và Jarý (1983) [55] tạo 2-S-thiouroni ethansulfonat từ natri 2-bromoethansulfonat và thioure, chuyển hóa thành guanidini 2-mercaptoethansulfonat nhờ amoniac, sau đó qua cột trao đổi ion Amberlite IR 120 hoặc Ostion KS để thu acid 2-mercaptoethansulfonic trước khi trung hòa bằng NaOH. Hiệu suất toàn quy trình chỉ đạt 30 - 40%, quy trình gồm 5 phản ứng và kéo dài ít nhất 5 ngày.
• Qua trung gian thioester: A. Reiner và cộng sự [93] cho natri 2-bromoethansulfonat phản ứng với acid thiobenzoic tạo natri benzoylthioethansulfonat (hiệu suất 60,5%), sau đó phân cắt bằng dung dịch NH3 25% ở 50 °C thu mesna (hiệu suất 84%, hiệu suất toàn bộ đạt 50%). Wang XinJin và cộng sự [131] thủy phân dẫn chất acetyl của mesna trong môi trường HCl/ethanol 2N, đạt hiệu suất 72 - 82,3%. Nhược điểm là acid thiobenzoic đắt tiền, không phổ biến tại Việt Nam.
• Qua trung gian muối xanthat: C. Schramm (1955) [105] dùng kali ethylxanthat tạo ethyl-2-sulfoethyl xanthat rồi phân cắt bằng NH4OH đậm đặc hoặc methylamin, hiệu suất đạt 41%. J. Leveque và cộng sự [66] dùng lauroyl peroxid kết hợp thủy phân bằng NaOH 1N ở 80 °C trong 3 giờ hoặc kết hợp guanidin; phản ứng kéo dài 3 ngày, hiệu suất thấp và độ tinh khiết sản phẩm dưới 0,1%. Hướng này bị loại bỏ do điều kiện kiềm nóng dễ làm mesna bị oxy hóa tạo dimesna.
• Các phản ứng tạo nhóm thiol khác: Tạo thiol từ muối Bunte (Weiss và Sokol [112], Kice [57], Vermeulen và Collin [118]), từ trithiocarbonat (D. Greco [41], Taguchi [114], A. Ishii [53], W. Charles [30]), hoặc từ alcol, alken, alkyl halogenid [114], [126].

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết:

• Thay thế hoàn toàn nguyên liệu 1,2-dibromoethan đắt tiền bằng 1,2-dicloroethan sẵn có, giá thành thấp, hạn chế phản ứng thế hai lần tạo sản phẩm phụ disulfonat.
• Khắc phục các tồn tại của quy trình kinh điển (thời gian phản ứng kéo dài, hiệu suất thấp, dùng hóa chất ngoại nhập đắt tiền hoặc độc hại).
• Đề xuất và khảo sát thực nghiệm 2 con đường mới tổng hợp mesna: qua trung gian muối Bunte và qua trung gian alkyl trithiocarbonat.
• Giải quyết vấn đề oxy hóa nhóm thiol kém bền trong dung dịch tiêm 100 mg/ml bằng biện pháp lựa chọn tá dược (chất khóa ion kim loại dinatri edetat, kiểm soát pH) và điều kiện bào chế (sục khí nitơ, kiểm soát nhiệt độ tiệt khuẩn) nhằm thiết lập quy trình ổn định trong nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết:

• Lý thuyết hóa học nhóm thiol (-SH): Thiol có tính acid rõ rệt ở pH 10 - 11, tạo anion thiolat [87]. Dung dịch mesna 10% trong nước có pH 4,5 - 6,0 [82], [116]. Tốc độ phản ứng oxy hóa thiol tỷ lệ nghịch với căn bậc hai nồng độ ion H+, bước chậm quyết định tốc độ liên quan đến sự hình thành gốc tự do peroxyd [20], [61], [103]. Phản ứng oxy hóa thiol tạo disulfid được xúc tác bởi ion kim loại nặng (Fe3+, PbO2, Ce4+, Co3+, V5+, MnO2), môi trường base hoặc alkylamin [61], [91], [103], [121]. Bức xạ tử ngoại 2500 Å làm đứt liên kết S-H tạo gốc thioyl và phân tử hydro [103], [115].
• Cơ chế dược lý và dược động học: Mesna phản ứng cộng ái nhân với liên kết đôi của acrolein hoặc kết hợp với 4-hydroxyifosfamid / 4-hydroxycyclophosphamid tạo thioether trơ không độc [25]. Mesna còn phản ứng với cystin tạo phức hợp disulfid mesna-cystein, giải phóng cystein tự do vào tế bào để hỗ trợ tổng hợp glutathion [23]. Sau khi tiêm tĩnh mạch, sinh khả dụng của mesna có hoạt tính tại bàng quang là 50%; thể tích phân bố Vd = 0,652 l/kg; tỷ lệ liên kết protein huyết tương 69 - 75%; độ thanh thải huyết tương Cl = 1,23 l/kg/giờ. Thuốc thải trừ nhanh qua thận trong 2 - 4 giờ; khoảng 33% dimesna được hệ thống enzym thiol transferase và glutathion reductase ở biểu mô thận khử ngược lại thành mesna tự do để bảo vệ đường tiết niệu [4], [25], [71].

Phương pháp thực nghiệm:

• Tổng hợp hóa học: Thực hiện phản ứng Strecker điều chế natri 2-cloroethansulfonat từ 1,2-dicloroethan và Na2SO3 có xúc tác bột đồng đun hồi lưu. Từ chất trung gian này, khảo sát 4 con đường thực nghiệm:
  • Con đường I (muối thiouroni): Gồm 4 phản ứng (S-alkyl hóa với thioure; amoniac phân; trao đổi ion qua cột nhựa Purolite C100E; phản ứng acid-base với NaOH).
  • Con đường II (thioester): Gồm 2 phản ứng (S-alkyl hóa với acid thiobenzoic; amoniac phân bằng NH3).
  • Con đường III (muối Bunte - đề xuất mới): Gồm 3 phản ứng: (i) S-alkyl hóa natri 2-cloroethansulfonat bằng natri thiosulfat (Na2S2O3) ở 80 °C tạo muối natri S-(2-sulfonatoethyl)sulfurothioat; (ii) thủy phân bằng acid vô cơ ở 70 °C tạo acid 2-mercaptoethansulfonic; (iii) trung hòa bằng dung dịch NaOH đến pH ~ 6,6 thu mesna.
  • Con đường IV (monoalkyl trithiocarbonat - đề xuất mới): Gồm 3 phản ứng: (i) S-alkyl hóa bằng natri trithiocarbonat (Na2CS3 40%) tạo monoalkyl trithiocarbonat; (ii) thủy phân/phân hủy trong môi trường nước/nhiệt độ tạo acid 2-mercaptoethansulfonic; (iii) điều chỉnh bằng NaOH về pH ~ 6,6 thu mesna.
• Tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết: Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn, chiết rắn - lỏng. Theo dõi phản ứng và kiểm tra sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên bản mỏng Silicagel F254 (Merck) với 4 hệ dung môi:
  • Hệ A: n-BuOH : AcOH : H2O (9,0 : 2,0 : 2,5)
  • Hệ B: n-BuOH : AcOH : H2O (5,0 : 2,5 : 2,5)
  • Hệ C: n-BuOH : AcOH : H2O (6,0 : 2,0 : 2,0)
  • Hệ D: n-BuOH : AcOH : H2O (9,0 : 6,0 : 6,0) Hiện màu bằng đèn tử ngoại 254 nm, hơi iod và hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn.
• Xác định cấu trúc: Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy Shimadzu (viên nén KBr 1:200, dải quét 4000 - 400 cm^-1). Phổ khối lượng (MS) đo trên máy LTQ Orbitrap XL và Agilent 1290/6460 LCMS/MS (chế độ ESI ion dương/âm). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) đo trên máy Bruker AV-500 và Bruker Ascend 500 (dung môi D2O, DMSO-d6, CD3OD; chất chuẩn nội TMS).
• Kiểm nghiệm nguyên liệu: Đánh giá theo tiêu chuẩn BP 2015. Định lượng mesna bằng phương pháp chuẩn độ thể tích iod dư: hòa tan mẫu, thêm H2SO4 1 M và dung dịch iod 0,1 N; chuẩn độ iod dư bằng natri thiosulfat 0,1 N với chỉ thị hồ tinh bột (1 ml Na2S2O3 0,1 N tương đương 16,42 mg mesna; yêu cầu hàm lượng đạt 96,0 - 102,0% tính theo chế phẩm khan).
• Thử nghiệm độc tính cấp: Thực hiện theo mô hình liều cố định của OECD [83] và hướng dẫn của Bộ Y tế [6] trên chuột nhắt trắng cái trưởng thành (18 - 22 g). Mẫu thử mesna tổng hợp theo con đường IV đạt BP 2015 được pha ở các nồng độ 300 mg/ml, 2000 mg/ml, 5000 mg/ml. Tiến hành thử nghiệm thăm dò ở liều 2000 mg/kg (đường uống và tiêm tĩnh mạch, 01 chuột/đường). Thử nghiệm chính thức thực hiện trên 5 chuột/nhóm. Động vật được theo dõi liên tục trong 24 giờ đầu và duy trì suốt 14 ngày về hành vi, thể trọng, dấu hiệu nhiễm độc và mổ quan sát đại thể cơ quan phủ tạng.
• Phương pháp bào chế và nghiên cứu độ ổn định thuốc tiêm: Bào chế dung dịch tiêm 100 mg/ml theo quy trình: sục khí nitơ trong nước cất pha tiêm 10 phút, hòa tan dinatri edetat (khảo sát nồng độ 0; 0,25; 0,5 mg/ml), điều chỉnh pH bằng NaOH 1 N (khảo sát pH 5 - 10), lọc qua màng 0,22 µm, đóng lọ thủy tinh có sục nitơ 2 phút, đậy nút cao su, xiết nắp nhôm và hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 phút. Khảo sát độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc (40 ± 2 °C / 75 ± 5% RH trong 6 tháng), dài hạn (30 ± 2 °C / 75 ± 5% RH), 60 °C và 121 °C.
• Phân tích HPLC và xử lý số liệu: Định lượng mesna và xác định giới hạn tạp chất trên hệ thống Shimadzu (cột Lichrospher C18, 250 x 4,6 mm, 10 µm; nhiệt độ cột 30 °C; tốc độ dòng 1,0 ml/phút; thể tích tiêm 20 µl; pha động gồm đệm phosphat - tetrabutylamoni hydrosulfat pH 2,3 phối hợp methanol tỉ lệ nước/methanol tương ứng 665/335 v/v). Detector UV cài đặt ở bước sóng 215 nm đối với định lượng và 235 nm đối với phân tích tạp chất liên quan (tạp A, B, C, D, E). Thẩm định phương pháp theo ICH và USP 38. Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2010; tính toán tuổi thọ thuốc bằng Minitab 17.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về mesna và tổng quan về bào chế mesna

Chương này hệ thống hóa các dữ liệu khoa học về mesna, bao gồm tính chất lý hóa, tiêu chuẩn kiểm nghiệm, phương pháp phân tích, đặc điểm dược lý, các quy trình tổng hợp hóa học và kỹ thuật bào chế thuốc tiêm:

1. Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu mesna theo Dược điển Anh (BP 2015):

• Công thức phân tử C2H5NaO3S2 (khối lượng phân tử 164,17 g/mol; thành phần: C 14,63%, H 3,07%, Na 14,00%, O 29,24%, S 39,06%). Bột kết tinh trắng hoặc vàng nhạt, hút ẩm, tan tự do trong nước, không tan trong cyclohexan.
• Giới hạn tạp chất liên quan: Tạp C (acid 2-(acetylsulfanyl)ethansulfonic) không quá 0,2%; tạp D (acid 2,2'-(disulfandiyl)bisethansulfonic) không quá 3,0%; tạp A, B, E không quá 0,3%; tạp đơn khác không quá 0,1%; tổng tạp khác không quá 0,3%.
• Hàm lượng hoạt chất: Đạt 96,0 - 102,0% tính theo chế phẩm khan.

2. Đánh giá ưu nhược điểm các phương pháp định lượng mesna trong y văn:

Dạng mẫu	Phương pháp	Ưu điểm	Nhược điểm	Tài liệu trích dẫn
Nguyên liệu, Chế phẩm	Đo quang UV-Vis (tạo phức Fe3+, thuốc thử màu)	Đơn giản, chi phí thấp, lượng dung môi ít, dễ áp dụng	Khoảng tuyến tính hẹp, độ đặc hiệu chưa cao	[14], [42], [111], [127]
Chế phẩm	Phân tích dòng chảy (phát quang hóa học Ce4+ - quinin)	Đơn giản, nhanh, chi phí thấp	Thiết bị phức tạp, dùng nhiều dung môi hữu cơ	Capita-Vallvey (2000) [68]
Nguyên liệu, Chế phẩm	Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)	Độ nhạy cao, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại tốt, định lượng nồng độ thấp	Chuẩn bị mẫu và thiết bị phức tạp, dùng nhiều dung môi	Rizk (2007) [94], Salman (2016) [99]
Mẫu sinh học	Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)	Nhanh, xác định đồng thời số lượng và nồng độ nhóm thiol	Hệ số tương quan thấp, sai số RSD cao	Lin Ling và cộng sự [76]
Dịch sinh học, Mô một	HPLC ghép đầu dò UV, huỳnh quang, điện hóa	Độ nhạy rất cao, phân tích được vết dược chất trong nền mẫu phức tạp	Cần tạo dẫn xuất hấp thụ UV, thiết bị đắt tiền	[38], [39], [54], [69], [119]

3. Dữ liệu độc tính cấp tiền lâm sàng của mesna: Theo các tài liệu y văn đã công bố [24], [64], [98], giá trị liều gây chết 50% động vật thực nghiệm (LD50) của mesna được xác định như sau:

Đường dùng	Động vật thử nghiệm	LD50 (mg/kg)
Uống	Chuột nhắt	4440
Uống	Chuột cống	6102
Tiêm tĩnh mạch	Chuột nhắt	1510
Tiêm tĩnh mạch	Chuột cống	1720
Tiêm màng bụng	Chuột nhắt	1251
Tiêm màng bụng	Chuột cống	2005
Tiêm bắp	Chuột nhắt	2313
Tiêm bắp	Chuột cống	1200

4. Biện pháp kỹ thuật chống oxy hóa trong công thức và bào chế thuốc tiêm chứa nhóm thiol:

• Khoảng pH ổn định của một số dược chất chứa nhóm thiol: Dung dịch N-acetyl-L-cystein ổn định nhất ở pH 6,0 - 7,5 [65]; thuốc tiêm tiopronin ổn định ở pH 4,5 - 5,5 [130]; dung dịch unithiol ổn định ở pH 3,1 - 4,5 [79].
• Nồng độ các chất chống oxy hóa thông dụng trong thuốc tiêm nước: Acid ascorbic (0,01%), dinatri edetat (0,01 - 0,075%), cystein (0,5%), natri bisulfit (0,15%), natri metabisulfit (0,2%) [79].
• Cơ chế tác dụng của dinatri edetat: Tạo phức chelat bền vững khóa các vết ion kim loại nặng chuyển tiếp (tác nhân xúc tác phản ứng oxy hóa thiol tạo disulfid). Theo H. Almoazen và cộng sự [17], dung dịch tiêm mesna không chứa dinatri edetat bị phân hủy theo động học bậc nhất với hằng số tốc độ k = 0,023/giờ (t90% = 4,56 giờ), trong khi mẫu có dinatri edetat 0,25 mg/ml duy trì hàm lượng 90 - 110% trong 28 ngày ở 5 °C.

5. Các dạng thuốc thương mại của mesna trên thị trường:

Tên biệt dược	Hàm lượng	Dạng bào chế	Nhà sản xuất
Mesnex	400 mg	Viên nén	Baxter
Mesna	200 mg/2 ml	Dung dịch tiêm	GLS
Mesnex	1 g/10 ml	Dung dịch tiêm	Baxter
Uromitexan	400 mg/4 ml	Dung dịch tiêm	Baxter
Mistabron	600 mg/3 ml	Dung dịch tiêm / xông hít	UCB Pharma
Mitexan	400 mg/4 ml	Dung dịch tiêm	Baxter

Biệt dược đang lưu hành và sử dụng trong phác đồ lâm sàng tại Việt Nam là Uromitexan.

Chương 2: Nguyên liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Chương này trình bày chi tiết danh mục hóa chất, thiết bị và các quy trình phân tích, tổng hợp, thử nghiệm độc tính và bào chế:

1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị chính:

• Chất chuẩn đối chiếu: Mesna chuẩn 98% (Acros, chuẩn châu Âu), tạp C chuẩn và tạp D chuẩn (Fischer, Batch 1).
• Hóa chất tổng hợp: 1,2-Dicloroethan (AR), natri trithiocarbonat (dung dịch 40%), natri thiosulfat pentahydrat, thioure, acid thiobenzoic, nhựa cationit Puronit C100E (Anh), bột đồng (AR), khí nitơ 99,99%, dinatri edetat (Merck).
• Thiết bị phân tích: Hệ thống HPLC Shimadzu (detector dãy diod quang SPD-M10AVP), HPLC Agilent 1260; máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-500 và Bruker Ascend 500; máy đo phổ khối LTQ Orbitrap XL và LCMS/MS Agilent 1290/6460; máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu; tủ vi khí hậu Deayang TH-180S.

2. Quy trình thực nghiệm 4 con đường tổng hợp mesna từ 1,2-dicloroethan:

• Bước tạo chất trung gian: Đun hồi lưu 1,2-dicloroethan (1) với Na2SO3 xúc tác bột đồng trong hỗn hợp ethanol - nước thu natri 2-cloroethansulfonat (2).
• Khảo sát 4 con đường chuyển hóa từ chất 2 thành mesna (9):
  • Con đường I (qua trung gian thiouroni): Phản ứng với thioure tạo 2-S-thiouroni ethansulfonat (3), đun với amoniac tạo guanidini 2-mercaptoethansulfonat (4), qua cột trao đổi ion Puronit C100E tách acid 2-mercaptoethansulfonic (8) và trung hòa bằng NaOH.
  • Con đường II (qua trung gian thioester): Phản ứng với acid thiobenzoic tạo natri benzoylthioethansulfonat (5), amoniac phân giải phóng benzamid và mesna.
  • Con đường III (qua trung gian muối Bunte): Phản ứng giữa natri 2-cloroethansulfonat (2) và Na2S2O3 ở 80 °C tạo natri S-(2-sulfonatoethyl)sulfurothioat (6); thủy phân ở 70 °C bằng acid vô cơ tạo acid 8; trung hòa bằng NaOH về pH ~ 6,6 thu mesna (9).
  • Con đường IV (qua trung gian alkyl trithiocarbonat): Phản ứng giữa chất 2 và Na2CS3 tạo monoalkyl trithiocarbonat (7); thủy phân trong nước ở nhiệt độ thích hợp giải phóng acid 8; trung hòa bằng NaOH đến pH ~ 6,6 thu mesna (9).

3. Quy trình thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt trắng cái:

• Liều khởi đầu thăm dò: 2000 mg/kg theo đường uống và đường tiêm tĩnh mạch (thể tích 0,1 ml/10 g chuột).
• Liều thử nghiệm chính thức: 5 chuột/nhóm, theo dõi trong 14 ngày. Đánh giá tỷ lệ tử vong, sự thay đổi thể trọng, phản xạ, màu sắc da niêm mạc và giải phẫu đại thể quan sát bệnh lý nội tạng để phân loại mức độ độc theo hệ thống GHS.

4. Quy trình công nghệ bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml:

• Xử lý nước cất pha tiêm bằng cách sục khí nitơ 99,99% trong 10 phút.
• Hòa tan dinatri edetat trong 70% lượng nước, chỉnh pH về vùng 7,2 - 7,6 bằng NaOH 1 N, thêm nước vừa đủ.
• Lọc trong và vô trùng qua màng lọc có kích thước lỗ 0,22 µm.
• Đóng lọ thủy tinh trung tính, sục khí nitơ đuổi oxy khoang trống trong 2 phút, đóng nút cao su, xiết nắp nhôm.
• Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm trong nồi hấp ở 121 °C trong 15 phút.

5. Thẩm định quy trình định lượng và thử tạp chất bằng HPLC:

• Điều kiện sắc ký: Cột Lichrospher C18 (250 x 4,6 mm, 10 µm); nhiệt độ cột 30 °C; thể tích tiêm 20 µl; tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Pha động: 2,94 g KH2PO4, 2,94 g K2HPO4, 2,6 g tetrabutylamoni hydrosulfat trong nước, chỉnh pH 2,3 bằng H3PO4, phối hợp 335 ml methanol thành 1000 ml.
• Định lượng hoạt chất đo ở 215 nm; giới hạn tạp chất liên quan đo ở 235 nm (yêu cầu số đĩa lý thuyết không dưới 1000, độ lệch chuẩn tương đối RSD diện tích pic mesna không quá 2,0%).
• Tiêu chuẩn giới hạn tạp chất trong dung dịch tiêm: Tạp D ≤ 3,0%; tạp C ≤ 0,2%; tạp A, B, E ≤ 0,3%; tạp đơn khác ≤ 0,1%; tổng tạp khác ≤ 0,3%.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học:

• Hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về động học và cơ chế oxy hóa của hợp chất chứa nhóm thiol, làm rõ ảnh hưởng của pH, ion kim loại nặng, ánh sáng và nhiệt độ tới tốc độ phân hủy mesna.
• Lần đầu tiên thiết kế và đề xuất thành công 2 con đường mới tổng hợp mesna: con đường qua trung gian muối Bunte (natri S-(2-sulfonatoethyl)sulfurothioat) và con đường qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat, bổ sung dữ liệu thực nghiệm vào hóa học các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và công nghệ:

• Thay thế hoàn toàn nguồn nguyên liệu 1,2-dibromoethan đắt tiền bằng 1,2-dicloroethan thương mại có giá thành rẻ, tối ưu hóa phản ứng Strecker có xúc tác đồng để thu natri 2-cloroethansulfonat với hiệu suất cao.
• Xây dựng quy trình tổng hợp mesna mở rộng ở quy mô 200 g/mẻ, tạo tiền đề kỹ thuật cho việc chủ động sản xuất nguyên liệu làm thuốc trong nước.
• Thiết lập phương pháp tinh chế thu sản phẩm nguyên liệu mesna đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu kiểm nghiệm theo chuyên luận Dược điển Anh (BP 2015).
• Cung cấp dữ liệu độc tính cấp tiền lâm sàng của nguyên liệu mesna tổng hợp theo phương pháp mới trên mô hình động vật thực nghiệm theo tiêu chuẩn quốc tế OECD.
• Xây dựng hoàn chỉnh công thức và quy trình công nghệ bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm, giải quyết triệt để tính kém bền của dược chất bằng giải pháp kỹ thuật phối hợp (khóa ion kim loại bằng dinatri edetat, kiểm soát pH 7,2 - 7,6 và loại oxy hòa tan bằng khí nitơ).
• Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích HPLC đồng thời định lượng và kiểm soát giới hạn 5 tạp chất liên quan (tạp A, B, C, D, E), đề xuất dự thảo Tiêu chuẩn cơ sở cho dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml phù hợp Dược điển Việt Nam IV.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất:

• Khuyến nghị lựa chọn con đường tổng hợp có hiệu suất cao, nguyên liệu sẵn có và ít tạo chất thải độc hại để tiếp tục hoàn thiện công nghệ.
• Đề xuất áp dụng quy trình kiểm soát môi trường pha chế nghiêm ngặt (sục khí nitơ, hạn chế tiếp xúc ánh sáng và kim loại chuyển tiếp) trong sản xuất dung dịch tiêm mesna ở quy mô công nghiệp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Các khảo sát thực nghiệm tổng hợp và bào chế mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và nâng cấp bước đầu ở mẻ 200 g, chưa tiến hành thử nghiệm ở quy mô pilot công nghiệp liên tục.
• Đánh giá độc tính cấp của nguyên liệu mới chỉ thực hiện trên một loài động vật thực nghiệm (chuột nhắt trắng cái trưởng thành) theo mô hình liều cố định, chưa có số liệu thử nghiệm độc tính bán trường diễn và độc tính trường diễn.
• Nghiên cứu bào chế tập trung vào dạng dung dịch tiêm 100 mg/ml đóng lọ thủy tinh; các dạng bào chế dùng đường uống (viên nén, viên sủi) hoặc khí dung chưa được triển khai thực nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ tổng hợp mesna ở quy mô pilot lớn hơn, đánh giá tác động môi trường và tính toán hiệu quả kinh tế kỹ thuật.
• Tiếp tục theo dõi độ ổn định dài hạn của dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml trong điều kiện bảo quản thực tế đến hết hạn dùng dự đoán.
• Tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng mở rộng (độc tính bán trường diễn, dược động học) và nghiên cứu tương đương sinh học khi thành phẩm được sản xuất ở quy mô công nghiệp.

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa dược: Luận án cung cấp hệ thống dữ liệu toàn diện về các phản ứng tạo nhóm thiol, cơ chế phản ứng Strecker, phản ứng qua muối Bunte và alkyl trithiocarbonat, cùng bộ thông số phổ cấu trúc (IR, ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR) của mesna và các dẫn chất trung gian.
• Đối với cán bộ nghiên cứu phát triển (R&D) và công nghệ bào chế: Tài liệu là cẩm nang thực nghiệm giá trị về giải pháp chống oxy hóa cho các dược chất nhạy cảm trong thuốc tiêm, kỹ thuật sục khí trơ, lựa chọn tá dược chelat hóa (dinatri edetat) và kiểm soát pH dung dịch.
• Đối với kiểm nghiệm viên và cán bộ đảm bảo chất lượng (QA/QC): Cung cấp quy trình phân tích HPLC đã được thẩm định đầy đủ theo ICH/USP để định lượng hoạt chất và tách đồng thời các tạp chất phân hủy (đặc biệt là tạp D - dimesna và tạp C) trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc tiêm.
• Đối với các nhà quản lý và doanh nghiệp dược phẩm: Là cơ sở khoa học để xem xét đầu tư sản xuất nguyên liệu hóa dược và thành phẩm thuốc tiêm mesna trong nước, giảm phụ thuộc vào nguồn thuốc nhập khẩu trong phác đồ điều trị ung thư.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn 1,2-dicloroethan thay thế cho 1,2-dibromoethan làm nguyên liệu đầu? 1,2-Dibromoethan có hoạt tính hóa học cao nhưng giá thành đắt và brom là tác nhân phản ứng mạnh, dễ bị thế cả 2 nhóm tạo sản phẩm phụ disulfonat khó loại bỏ. Ngược lại, 1,2-dicloroethan là hóa chất công nghiệp phổ biến, giá thành thấp hơn nhiều lần và ưu tiên phản ứng thế trên một nhóm clo, giúp giảm thiểu tạp chất phụ và hạ giá thành nguyên liệu khi nâng cấp quy mô sản xuất.

2. Hai phương pháp mới được luận án đề xuất để tổng hợp mesna dựa trên nguyên tắc hóa học nào? Hai phương pháp mới gồm: (i) Phương pháp qua trung gian muối Bunte: Cho natri 2-cloroethansulfonat phản ứng với natri thiosulfat (Na2S2O3) tạo natri S-(2-sulfonatoethyl)sulfurothioat, sau đó thủy phân bằng acid vô cơ để giải phóng nhóm thiol dưới dạng acid 2-mercaptoethansulfonic rồi kiềm hóa tạo mesna; (ii) Phương pháp qua trung gian alkyl trithiocarbonat: Cho natri 2-cloroethansulfonat phản ứng với natri trithiocarbonat (Na2CS3) tạo monoalkyl trithiocarbonat, tiếp tục thủy phân/phân hủy trong môi trường nước/nhiệt độ để tạo nhóm thiol và chuyển thành mesna.

3. Vai trò của tá dược dinatri edetat và việc sục khí nitơ trong công thức thuốc tiêm mesna 100 mg/ml là gì? Mesna chứa nhóm thiol rất dễ bị oxy hóa thành disulfid (dimesna) dưới tác dụng của oxy hòa tan và xúc tác bởi vết ion kim loại nặng chuyển tiếp. Dinatri edetat đóng vai trò là chất hiệp đồng chống oxy hóa nhờ khả năng tạo phức chelat khóa các ion kim loại này. Việc sục khí nitơ trong quá trình pha chế và đóng lọ giúp đuổi hoàn toàn oxy hòa tan trong dung môi và oxy trong khoang trống của lọ thuốc, ngăn chặn phản ứng phân hủy dược chất.

4. Tiêu chuẩn kiểm soát các tạp chất liên quan trong nguyên liệu mesna theo BP 2015 được quy định cụ thể như thế nào? Theo BP 2015, giới hạn tạp chất liên quan trong mesna được kiểm soát bằng sắc ký lỏng: Tạp C (acid 2-(acetylsulfanyl)ethansulfonic) không quá 0,2%; tạp D (dimesna - acid 2,2'-(disulfandiyl)bisethansulfonic) không quá 3,0%; tạp A, B, E không quá 0,3%; các tạp đơn không định danh khác không quá 0,1%; và tổng các tạp khác không quá 0,3%.

5. Thử nghiệm độc tính cấp của nguyên liệu mesna trong luận án được tiến hành theo phương pháp nào? Độc tính cấp được thực hiện theo mô hình liều cố định của OECD và Bộ Y tế trên chuột nhắt trắng cái trưởng thành (18 - 22 g). Hoạt chất tổng hợp theo con đường IV được thử nghiệm thăm dò ở mức liều 2000 mg/kg theo đường uống và đường tiêm tĩnh mạch. Sau đó, thử nghiệm chính thức được thực hiện trên 5 chuột/nhóm, theo dõi liên tục trong 14 ngày về tỷ lệ chết, biến đổi thể trọng, triệu chứng lâm sàng và giải phẫu đại thể phủ tạng.

Kết luận

Luận án đã giải quyết đồng bộ bài toán khoa học và công nghệ từ tổng hợp nguyên liệu đến bào chế thành phẩm thuốc tiêm giải độc ung thư mesna. Tác giả đã thiết kế thành công 2 con đường tổng hợp mới qua trung gian muối Bunte và monoalkyl trithiocarbonat từ nguyên liệu 1,2-dicloroethan giá rẻ, xây dựng quy trình tổng hợp 200 g/mẻ và tinh chế nguyên liệu đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015. Đồng thời, công trình đã làm sáng tỏ các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của nhóm thiol, xây dựng thành công công thức dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml có bổ sung dinatri edetat và sục khí nitơ, hoàn thiện phương pháp kiểm nghiệm HPLC và chứng minh độ an toàn cấp tính của sản phẩm trên động vật thực nghiệm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẬT VẮN ĐÈ Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới tỉ lệ các ca tử vong do ung thư là 70% [13]. Các oxazaphosphorin như ifosfamid (IFM), cyclophosphamid (CYP) có tác dụng hiệu quả trên nhiều loại ung thư khác nhau. Tuy nhiên nhóm dược chất này gây độc tính cao trên tủy xương, thận và bàng quang [4], [9], [77]. Ưu điểm lớn nhất khi sử dụng mesna là vừa có hiệu lực cao chống lại độc tính trên bàng quang của acrolein, hạn chế được tác dụng không mong muốn của CYP và IFM, vừa không ảnh hưởng đến tác dụng của các thuốc ung thư dùng đồng thời [4], [25], [31], [71], [78], [85], [133].

Cấu tạo của mesna có hai nhóm chức thiol và sulíbnat, được nối bởi cầu ethylen. Tuy cấu trúc đơn giản, nhưng dược chất này lại rất dễ bị oxy hóa, đặc biệt là trong môi trường giàu khí oxy [61], [103]. Do vậy cần có biện pháp đế tổng hợp, tinh chế nguyên liệu đạt tiêu chuẩn và chống oxy hóa dược chất trong các dạng bào chế. Sản xuất nguyên liệu làm thuốc ở Việt Nam còn thiếu do rất nhiều nguyên nhân như qui trình sản xuất chưa khả thi, việc tinh chế loại tạp chất chưa đạt yêu cầu và giá thành nguyên liệu còn cao so với các nước trên thế giới.

Mesna nằm trong danh mục thuốc thiết yếu của Việt Nam lần thứ VI với dạng bào chế viên nén 400 mg, 600 mg và dung dịch tiêm 100 mg/ml [7], Là một dược chất được sử dụng nhiều trong điều trị nhưng mesna chưa được nghiên cứu và sản xuất trong nước. Do vậy, vấn đề nghiên cứu cải tiến các qui trình tổng hợp đã được công bố trên thế giới và tìm kiếm các phương pháp mới tổng hợp mesna hướng đến sản xuất nguyên liệu và bào chế thành phẩm trong nước là việc làm cần thiết. Từ thực tế đó, luận án được tiến hành nhằm xây dựng các phương pháp tổng hợp mới, cải tiến qui trình tống hợp cũ đế thu được nguyên liệu mesna ứng dụng trong bào chế thuốc tiêm. Các mục tiêu của luận án như sau: ỉ.

Thiết kế được phương pháp mới tổng hợp mesna. Xây dựng được qui trình tống hợp mesna qui mô 200 g/mẻ. Đánh giá được độc tính cấp, độ ổn định của nguyên liệu mesna. Xây dựng được công thức bào chế và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở dung dịch tiêm mesna ỉ 00 mg/mỉ.

Đe hoàn thành được những mục tiêu trên, luận án cần thực hiện những nội dung sau: 1 1. Tổng quan về các phương pháp tổng hợp mesna đã được công bố, các phương pháp tạo nhóm thiol, đối sánh giữa các phương pháp, lựa chọn và đề xuất phương pháp mới tổng hợp mesna. Khảo sát các qui trình tổng hợp mesna bao gồm các phương pháp mới và một số phương pháp đã công bố. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các phản ứng tốt nhất.

Tìm kiếm các phương pháp thích hợp để tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015. Phân tích, đánh giá, lựa chọn phương pháp đế xây dựng qui trình tổng hợp mesna 200 g/mẻ. Đánh giá độc tính của nguyên liệu mesna được tổng hợp theo phương pháp mới. Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mesna tổng hợp được.

Bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml: xây dựng công thức và phương pháp bào chế, đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm tra chất lượng, theo dõi độ ổn định của dung dịch tiêm pha chế ở qui mô phòng thí nghiệm. Tổng quan về mesna 1. Nguồn gốc và tính chất lý hóa Mesna được tổng hợp và xác định cấu trúc từ năm 1954. Nghiên cứu lâm sàng tác dụng bảo vệ đường tiết niệu của mesna được thực hiện bởi Bộ môn Dược lý của Trường Đại học Bielefeld - Asta-Werke A.

(nay là Frankfurt-ASTA MeđicaA. Tinh chất vật lý - Cấu trúc hóa học - Công thức phân tử: C2HsNa0 3 S2 - Khối lượng phân tử: 164,17 đvC. - Thành phần: c 14,63%; H 3,07%; Na 14,00%; o 29,24%; s 39,06% - Tên khoa học: natri 2-sulfanylethansulfonat, natri 2-mercaptoethansulfonat. - Mesna là bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, dễ hút ẩm.

- Độ tan: tan tự do trong nước, không tan trong cyclohexan [116]. - Tiêu chuẩn kiểm nghiệm của nguyên liệu mesna theo BP 2015 như sau [116]: + Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm, dễ tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%, không tan trong cyclohexan. + Định tính: Phổ hồng ngoại của mẫu thử phải phù hợp với phổ hồng ngoại của mesna chuẩn. Chế phẩm phải thể hiện phản ứng định tính của natri.

+ Độ trong và màu sắc của dung dịch (dd): phải đạt theo qui định. + Mất khối lượng do làm khô: không quá 1,0%. + Clorid: không quá 250 ppm. + Sulfat: không quá 500 ppm.

+ Dinatri edetat: không quá 500 ppm. + Kim loại nặng: không quá 10 ppm. + Tạp chất liên quan: tạp c không quá 0,2%; tạp D không quá 3,0 %; tạp A, B, E không quá 0,3%; tạp khác không quá 0,1%; tổng tạp khác không quá 0,3%. Công thức các tạp như sau: Tạp A: Acid 2-(carbamimidoylsulfanyl)ethansulfonic 3 Tạp B: Acid 2-[[(guanidino)(imino)methyl]sulfanyl]ethansulfonic Tạp C: Acid 2-(acetylsu 1fanyl)ethansulfonic o.OH Tạp D: Acid 2,2’-(disulfandiyl)bisethansulfonic Tạp E: Acid 2-(4,6-diamino-l,3,5-triazin-2-yl)sulfanylethansulfonic NH, + Định lượng: chế phẩm phải chứa từ 96,0 - 102,0% theo chế phẩm đã làm khan.

Tỉnh chất hóa học Mesna là hợp chất có chứa nhóm thiol, vì vậy hóa tính của nó thể hiện tính chất của nhóm này. Nhóm thiol tương tự như nhóm hydroxyl, với nguyên tử oxy được thay thế bởi nguyên tử lưu huỳnh, cùng phân nhóm trong bảng hệ thống tuần hoàn các nguyên tố hóa học, nên có thế tạo ra thioether, thioester. a) Tỉnh acid Hợp chất chứa nhóm thiol thể hiện tính acid rất rõ rệt (đặc biệt là trong môi trường có pH từ 10-11) vì thế trong môi trường base sẽ tạo ra các anion thiolat [87]. Dung dịch mesna 10% trong nước có pH từ 4,5-6 [82], [116].

Nghiên cứu cho thấy tốc độ phản ứng không phụ thuộc nồng độ thiol và tỉ lệ nghịch với căn bậc 2 của nồng độ H+ [61], [103]. Điều này cho thấy bước chậm trong phản ứng liên quan đến sự hình thành của các gốc linh động của peroxyd [20]. Một số ý kiến cho rằng phản ứng được tăng tốc độ khi có xúc tác là ion kim loại nặng và giảm tốc độ khi có mặt các muối edetat [61], [103]. 4 ■ Oxy hóa bỏi các halogen Các sản phấm của quá trình oxy hóa nhóm thiol bằng các halogen khác nhau phụ thuộc halogen và chất phản ứng.

Các dd nước clo và brom phản ứng với thiol tạo thành sulfonyl halogenid và acid sulfonic. Trong điều kiện khan nước tạo thành disulfid, nếu halogen dư tạo thành trihalogen. Neu thủy phân các trihalogen thu được sản phẩm là các acid có lưu huỳnh (sơ đồ 1.1) [103], RSH+ 3X2+ 2H20 ------ RS02X +5HX RSH + 3X2 + 3H20 ------ ► RSO3H + 6HX Trong điều kiện khan: RSH + x 2 -► RSX + HX RSX + x 2 RSX3 RSX + RSH ----- RSSR + HX RSSR + x 2^==5sr 2RSX Sơ đồ 1. Phản ứng oxy hóa các hợp chất thiol bởi các halogen ■ Oxy hóa bỏi các ion và oxid kim loại Phức hợp Fe3+ như [Fe(CN)6]3~và sắt octanoat, oxy hóa thiol thành disulíid khi không có mặt oxy (sơ đồ 1.

2RSH + 2Fe3+ ---- *- RSSR + 2Fe2+ + 2H+ 4RSH + Pb02 ---- 2RSSR + Pb(SR)2 + 2H20 Sơ đồ 1. Phản ứng tạo dỉsulíld với tác nhân là ion kim loại và oxiđ kim loại Quá trình oxy hóa thiol bởi [Fe(CN)6]3' trong môi trường kiềm và acid đã được nghiên cứu. Trong cả hai trường hợp disulfid là sản phẩm oxy hóa. Giống như các ion sắt, các ion kim loại nặng khác trong trạng thái oxy hóa cao hơn của nó cũng phản ứng với thiol đế tạo ra các disulíìd tương ứng, ví dụ Ce4+, Co3+ và v 5+ trong môi trường acid [121], [122].

Một số lượng lớn các oxid kim loại như MnƠ2, PbƠ2, CrƠ3 , Fe2Ơ 3 , C02 O3 , CuO oxy hóa thiol ở nhiệt độ thấp trong cloroform hoặc xylen để tạo thành disulfid. Trong đó MnƠ2 là tác nhân mạnh nhất [103]. ■ Oxy hóa bằng khí oxy Phản ứng oxy hóa bằng khí oxy được xúc tác bởi một số chất như: base, amin, ion kim loại nặng. 5 - Xúc tác base: Tỉ lệ hấp thụ oxy của thiol nhanh hơn ở lúc đầu và đạt đến một giá trị cố định sau khi phản ứng 20-30%.

Điều này được giải thích do disulfid được bổ sung tối đa vào môi trường phản ứng. Cơ chế phản ứng như sau [61], [103]: RSH + B -T---- RS + BH RS" + o 2 ---- *■ RS* + o T RS~ + o r — RS* + 0 22 2RS1 — ► RSSR 2BH + 0 22“ ---- ► 1/2 0 2 + 2B Sơ đồ 1. Cơ chế oxy hóa nhóm thiol trong môi trường base Tỉ lệ tiêu thụ oxy phụ thuộc nhiệt độ. Trong trường hợp nồng độ kiềm cao, khả năng tiêu thụ oxy tăng lên 152% hình thành disulíìd.

Tốc độ oxy hoá dithiol và monothiol phụ thuộc vào pH, pH càng cao thì tốc độ oxy hóa càng nhanh [61], [82]. - Xúc tác amin: Qwk trình oxy hóa nhóm thiol được xúc tác bởi alkylamin, hình thành "muối" alkylamin-thiol [91]. Nhóm -SH bị oxy hóa bởi oxy không khí nên tạo thành disulfid và nước đồng thời có sự tái tạo amin. Tốc độ oxy hoá thiol phụ thuộc nồng độ amin [61], [97], [123].HSR + 0 2 ------ 2RSSR + 2H20 +4R3N - Xúc tác ion kim loạt Việc thêm các muối kim loại nặng vào dd của các thiol trong môi trường base làm tăng tỉ lệ hấp thu oxy.

Quá trình oxy hóa chỉ tạo thành disulíìd mà không có bất kỳ sản phẩm nào khác (sơ đồ 1. Tăng nồng độ ion kim loại, tỉ lệ hấp thu oxy không tăng theo. Tỉ lệ hấp thu oxy không phụ thuộc vào các thiol nhưng lại khác nhau đối với các kim loại khác nhau [103]. 2RS' +2M“+ 2RS' ----- 2RSSR Sơ đồ 1.

Cơ chế oxy hóa nhóm thiol xúc tác bởi ion kim loại Vai trò của ion kim loại là tạo phứcchelat với nhóm thiol sau đó bịoxy hóa bởi oxy tạo thành disulíĩd. Ngoài ra quá trình oxy hóa các hợp chất thiolcòn được xúc tác bởi dẫn chất của quinon, alken. 6 Oxy hóa do bức xạ hv 2RSH > RSSR + H2 Khi chiếu xạ tia 2500Â liên kết S-H bị đứt cung cấp gốc thioyl và nguyên tử hydro. Sản phẩm chính của phản ứng là disulfid và phân tử hydro [103], [115].

■ Oxy hóa bỏi dimethylsulfoxid và các sulfoxid khác Nghiên cứu cho thấy rằng, thiol bị oxy hóa bởi DMSO tạo thành disulfid tương ứng với hiệu suất cao và dimethyl sulíĩd. Kết quả cho thấy tốc độ oxy hoá phụ thuộc vào nồng độ acid trong thiol và mối tương quan giữa các pKa.