ĐẬT VẮN ĐÈ Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới tỉ lệ các ca tử vong do ung thư là 70% [13]. Các oxazaphosphorin như ifosfamid (IFM), cyclophosphamid (CYP) có tác dụng hiệu quả trên nhiều loại ung thư khác nhau. Tuy nhiên nhóm dược chất này gây độc tính cao trên tủy xương, thận và bàng quang [4], [9], [77]. Ưu điểm lớn nhất khi sử dụng mesna là vừa có hiệu lực cao chống lại độc tính trên bàng quang của acrolein, hạn chế được tác dụng không mong muốn của CYP và IFM, vừa không ảnh hưởng đến tác dụng của các thuốc ung thư dùng đồng thời [4], [25], [31], [71], [78], [85], [133].
Cấu tạo của mesna có hai nhóm chức thiol và sulíbnat, được nối bởi cầu ethylen. Tuy cấu trúc đơn giản, nhưng dược chất này lại rất dễ bị oxy hóa, đặc biệt là trong môi trường giàu khí oxy [61], [103]. Do vậy cần có biện pháp đế tổng hợp, tinh chế nguyên liệu đạt tiêu chuẩn và chống oxy hóa dược chất trong các dạng bào chế. Sản xuất nguyên liệu làm thuốc ở Việt Nam còn thiếu do rất nhiều nguyên nhân như qui trình sản xuất chưa khả thi, việc tinh chế loại tạp chất chưa đạt yêu cầu và giá thành nguyên liệu còn cao so với các nước trên thế giới.
Mesna nằm trong danh mục thuốc thiết yếu của Việt Nam lần thứ VI với dạng bào chế viên nén 400 mg, 600 mg và dung dịch tiêm 100 mg/ml [7], Là một dược chất được sử dụng nhiều trong điều trị nhưng mesna chưa được nghiên cứu và sản xuất trong nước. Do vậy, vấn đề nghiên cứu cải tiến các qui trình tổng hợp đã được công bố trên thế giới và tìm kiếm các phương pháp mới tổng hợp mesna hướng đến sản xuất nguyên liệu và bào chế thành phẩm trong nước là việc làm cần thiết. Từ thực tế đó, luận án được tiến hành nhằm xây dựng các phương pháp tổng hợp mới, cải tiến qui trình tống hợp cũ đế thu được nguyên liệu mesna ứng dụng trong bào chế thuốc tiêm. Các mục tiêu của luận án như sau: ỉ.
Thiết kế được phương pháp mới tổng hợp mesna. Xây dựng được qui trình tống hợp mesna qui mô 200 g/mẻ. Đánh giá được độc tính cấp, độ ổn định của nguyên liệu mesna. Xây dựng được công thức bào chế và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở dung dịch tiêm mesna ỉ 00 mg/mỉ.
Đe hoàn thành được những mục tiêu trên, luận án cần thực hiện những nội dung sau: 1 1. Tổng quan về các phương pháp tổng hợp mesna đã được công bố, các phương pháp tạo nhóm thiol, đối sánh giữa các phương pháp, lựa chọn và đề xuất phương pháp mới tổng hợp mesna. Khảo sát các qui trình tổng hợp mesna bao gồm các phương pháp mới và một số phương pháp đã công bố. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các phản ứng tốt nhất.
Tìm kiếm các phương pháp thích hợp để tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015. Phân tích, đánh giá, lựa chọn phương pháp đế xây dựng qui trình tổng hợp mesna 200 g/mẻ. Đánh giá độc tính của nguyên liệu mesna được tổng hợp theo phương pháp mới. Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mesna tổng hợp được.
Bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml: xây dựng công thức và phương pháp bào chế, đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm tra chất lượng, theo dõi độ ổn định của dung dịch tiêm pha chế ở qui mô phòng thí nghiệm. Tổng quan về mesna 1. Nguồn gốc và tính chất lý hóa Mesna được tổng hợp và xác định cấu trúc từ năm 1954. Nghiên cứu lâm sàng tác dụng bảo vệ đường tiết niệu của mesna được thực hiện bởi Bộ môn Dược lý của Trường Đại học Bielefeld - Asta-Werke A.
(nay là Frankfurt-ASTA MeđicaA. Tinh chất vật lý - Cấu trúc hóa học - Công thức phân tử: C2HsNa0 3 S2 - Khối lượng phân tử: 164,17 đvC. - Thành phần: c 14,63%; H 3,07%; Na 14,00%; o 29,24%; s 39,06% - Tên khoa học: natri 2-sulfanylethansulfonat, natri 2-mercaptoethansulfonat. - Mesna là bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, dễ hút ẩm.
- Độ tan: tan tự do trong nước, không tan trong cyclohexan [116]. - Tiêu chuẩn kiểm nghiệm của nguyên liệu mesna theo BP 2015 như sau [116]: + Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm, dễ tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%, không tan trong cyclohexan. + Định tính: Phổ hồng ngoại của mẫu thử phải phù hợp với phổ hồng ngoại của mesna chuẩn. Chế phẩm phải thể hiện phản ứng định tính của natri.
+ Độ trong và màu sắc của dung dịch (dd): phải đạt theo qui định. + Mất khối lượng do làm khô: không quá 1,0%. + Clorid: không quá 250 ppm. + Sulfat: không quá 500 ppm.
+ Dinatri edetat: không quá 500 ppm. + Kim loại nặng: không quá 10 ppm. + Tạp chất liên quan: tạp c không quá 0,2%; tạp D không quá 3,0 %; tạp A, B, E không quá 0,3%; tạp khác không quá 0,1%; tổng tạp khác không quá 0,3%. Công thức các tạp như sau: Tạp A: Acid 2-(carbamimidoylsulfanyl)ethansulfonic 3 Tạp B: Acid 2-[[(guanidino)(imino)methyl]sulfanyl]ethansulfonic Tạp C: Acid 2-(acetylsu 1fanyl)ethansulfonic o.OH Tạp D: Acid 2,2’-(disulfandiyl)bisethansulfonic Tạp E: Acid 2-(4,6-diamino-l,3,5-triazin-2-yl)sulfanylethansulfonic NH, + Định lượng: chế phẩm phải chứa từ 96,0 - 102,0% theo chế phẩm đã làm khan.
Tỉnh chất hóa học Mesna là hợp chất có chứa nhóm thiol, vì vậy hóa tính của nó thể hiện tính chất của nhóm này. Nhóm thiol tương tự như nhóm hydroxyl, với nguyên tử oxy được thay thế bởi nguyên tử lưu huỳnh, cùng phân nhóm trong bảng hệ thống tuần hoàn các nguyên tố hóa học, nên có thế tạo ra thioether, thioester. a) Tỉnh acid Hợp chất chứa nhóm thiol thể hiện tính acid rất rõ rệt (đặc biệt là trong môi trường có pH từ 10-11) vì thế trong môi trường base sẽ tạo ra các anion thiolat [87]. Dung dịch mesna 10% trong nước có pH từ 4,5-6 [82], [116].
Nghiên cứu cho thấy tốc độ phản ứng không phụ thuộc nồng độ thiol và tỉ lệ nghịch với căn bậc 2 của nồng độ H+ [61], [103]. Điều này cho thấy bước chậm trong phản ứng liên quan đến sự hình thành của các gốc linh động của peroxyd [20]. Một số ý kiến cho rằng phản ứng được tăng tốc độ khi có xúc tác là ion kim loại nặng và giảm tốc độ khi có mặt các muối edetat [61], [103]. 4 ■ Oxy hóa bỏi các halogen Các sản phấm của quá trình oxy hóa nhóm thiol bằng các halogen khác nhau phụ thuộc halogen và chất phản ứng.
Các dd nước clo và brom phản ứng với thiol tạo thành sulfonyl halogenid và acid sulfonic. Trong điều kiện khan nước tạo thành disulfid, nếu halogen dư tạo thành trihalogen. Neu thủy phân các trihalogen thu được sản phẩm là các acid có lưu huỳnh (sơ đồ 1.1) [103], RSH+ 3X2+ 2H20 ------ RS02X +5HX RSH + 3X2 + 3H20 ------ ► RSO3H + 6HX Trong điều kiện khan: RSH + x 2 -► RSX + HX RSX + x 2 RSX3 RSX + RSH ----- RSSR + HX RSSR + x 2^==5sr 2RSX Sơ đồ 1. Phản ứng oxy hóa các hợp chất thiol bởi các halogen ■ Oxy hóa bỏi các ion và oxid kim loại Phức hợp Fe3+ như [Fe(CN)6]3~và sắt octanoat, oxy hóa thiol thành disulíid khi không có mặt oxy (sơ đồ 1.
2RSH + 2Fe3+ ---- *- RSSR + 2Fe2+ + 2H+ 4RSH + Pb02 ---- 2RSSR + Pb(SR)2 + 2H20 Sơ đồ 1. Phản ứng tạo dỉsulíld với tác nhân là ion kim loại và oxiđ kim loại Quá trình oxy hóa thiol bởi [Fe(CN)6]3' trong môi trường kiềm và acid đã được nghiên cứu. Trong cả hai trường hợp disulfid là sản phẩm oxy hóa. Giống như các ion sắt, các ion kim loại nặng khác trong trạng thái oxy hóa cao hơn của nó cũng phản ứng với thiol đế tạo ra các disulíìd tương ứng, ví dụ Ce4+, Co3+ và v 5+ trong môi trường acid [121], [122].
Một số lượng lớn các oxid kim loại như MnƠ2, PbƠ2, CrƠ3 , Fe2Ơ 3 , C02 O3 , CuO oxy hóa thiol ở nhiệt độ thấp trong cloroform hoặc xylen để tạo thành disulfid. Trong đó MnƠ2 là tác nhân mạnh nhất [103]. ■ Oxy hóa bằng khí oxy Phản ứng oxy hóa bằng khí oxy được xúc tác bởi một số chất như: base, amin, ion kim loại nặng. 5 - Xúc tác base: Tỉ lệ hấp thụ oxy của thiol nhanh hơn ở lúc đầu và đạt đến một giá trị cố định sau khi phản ứng 20-30%.
Điều này được giải thích do disulfid được bổ sung tối đa vào môi trường phản ứng. Cơ chế phản ứng như sau [61], [103]: RSH + B -T---- RS + BH RS" + o 2 ---- *■ RS* + o T RS~ + o r — RS* + 0 22 2RS1 — ► RSSR 2BH + 0 22“ ---- ► 1/2 0 2 + 2B Sơ đồ 1. Cơ chế oxy hóa nhóm thiol trong môi trường base Tỉ lệ tiêu thụ oxy phụ thuộc nhiệt độ. Trong trường hợp nồng độ kiềm cao, khả năng tiêu thụ oxy tăng lên 152% hình thành disulíìd.
Tốc độ oxy hoá dithiol và monothiol phụ thuộc vào pH, pH càng cao thì tốc độ oxy hóa càng nhanh [61], [82]. - Xúc tác amin: Qwk trình oxy hóa nhóm thiol được xúc tác bởi alkylamin, hình thành "muối" alkylamin-thiol [91]. Nhóm -SH bị oxy hóa bởi oxy không khí nên tạo thành disulfid và nước đồng thời có sự tái tạo amin. Tốc độ oxy hoá thiol phụ thuộc nồng độ amin [61], [97], [123].HSR + 0 2 ------ 2RSSR + 2H20 +4R3N - Xúc tác ion kim loạt Việc thêm các muối kim loại nặng vào dd của các thiol trong môi trường base làm tăng tỉ lệ hấp thu oxy.
Quá trình oxy hóa chỉ tạo thành disulíìd mà không có bất kỳ sản phẩm nào khác (sơ đồ 1. Tăng nồng độ ion kim loại, tỉ lệ hấp thu oxy không tăng theo. Tỉ lệ hấp thu oxy không phụ thuộc vào các thiol nhưng lại khác nhau đối với các kim loại khác nhau [103]. 2RS' +2M“+ 2RS' ----- 2RSSR Sơ đồ 1.
Cơ chế oxy hóa nhóm thiol xúc tác bởi ion kim loại Vai trò của ion kim loại là tạo phứcchelat với nhóm thiol sau đó bịoxy hóa bởi oxy tạo thành disulíĩd. Ngoài ra quá trình oxy hóa các hợp chất thiolcòn được xúc tác bởi dẫn chất của quinon, alken. 6 Oxy hóa do bức xạ hv 2RSH > RSSR + H2 Khi chiếu xạ tia 2500Â liên kết S-H bị đứt cung cấp gốc thioyl và nguyên tử hydro. Sản phẩm chính của phản ứng là disulfid và phân tử hydro [103], [115].
■ Oxy hóa bỏi dimethylsulfoxid và các sulfoxid khác Nghiên cứu cho thấy rằng, thiol bị oxy hóa bởi DMSO tạo thành disulfid tương ứng với hiệu suất cao và dimethyl sulíĩd. Kết quả cho thấy tốc độ oxy hoá phụ thuộc vào nồng độ acid trong thiol và mối tương quan giữa các pKa.
