Tổng quan nghiên cứu

Vildagliptin (VDG) là một chất ức chế dipeptidyl-peptidase-4 (DPP-4) mạnh và chọn lọc, được sử dụng trong điều trị đái tháo đường type 2 (T2DM) nhằm cải thiện kiểm soát đường huyết. Thuốc có khả năng tăng nồng độ các hormone incretin nội sinh như GLP-1 và GIP, giúp tăng tiết insulin và giảm sản xuất glucagon. Theo các nghiên cứu dược động học, vildagliptin hấp thu nhanh với nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt sau khoảng 1,75 giờ, thời gian bán thải khoảng 3 giờ và sinh khả dụng tuyệt đối đạt 85%. Việc định lượng chính xác nồng độ vildagliptin trong huyết tương là cần thiết để đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm thuốc, từ đó đảm bảo chất lượng thuốc và hiệu quả điều trị trong lâm sàng.

Mục tiêu chính của luận văn là xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng phương pháp định lượng vildagliptin trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu huyết tương người tình nguyện sử dụng thuốc vildagliptin hàm lượng 50 mg, với phạm vi thời gian lấy mẫu kéo dài đến 24 giờ sau khi uống thuốc. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao chất lượng kiểm soát thuốc trên thị trường Việt Nam, đồng thời hỗ trợ các bác sĩ trong việc lựa chọn thuốc và điều chỉnh liều dùng phù hợp cho bệnh nhân đái tháo đường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Dược động học (Pharmacokinetics - DĐH): Nghiên cứu quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ của vildagliptin trong cơ thể người, làm cơ sở cho việc xác định các thông số như Cmax, Tmax, AUC.
  • Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): Kết hợp khả năng phân tách của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với độ nhạy và độ chọn lọc cao của khối phổ tứ cực chập ba (Triple Quadrupole MS/MS) sử dụng nguồn ion hóa phun điện (ESI).
  • Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích: Áp dụng các tiêu chuẩn của US-FDA và EMA về độ chọn lọc, độ nhạy, độ chính xác, độ đúng, độ ổn định, ảnh hưởng nền mẫu và độ thu hồi trong phân tích thuốc trong dịch sinh học.
  • Kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương: Sử dụng phương pháp kết tủa protein (PPT) với dung môi acetonitril (MeCN) để loại bỏ protein và tạp chất, đảm bảo độ thu hồi cao và tương thích với thiết bị LC-MS/MS.

Các khái niệm chính bao gồm: ion mẹ và ion con trong phổ khối, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), đường chuẩn và khoảng tuyến tính, ảnh hưởng nền mẫu, độ thu hồi, độ ổn định mẫu.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu huyết tương người tình nguyện khỏe mạnh, được lấy tại các thời điểm từ 0 đến 24 giờ sau khi uống viên nén vildagliptin 50 mg. Mẫu huyết tương trắng được sử dụng để chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra.
  • Phương pháp phân tích: Xây dựng phương pháp LC-MS/MS với thiết bị QTrap 6500+ (Sciex, Mỹ), sử dụng cột Hypersil Gold C8 (50 × 2,1 mm, 1,9 µm), nguồn ion hóa ESI (+), phân tích theo chế độ MRM với ion mẹ m/z 304,0 và ion con m/z 154,0, 97,0.
  • Xử lý mẫu: Kết tủa protein bằng acetonitril theo tỷ lệ 1:3 (huyết tương: MeCN), ly tâm và lấy dịch trong để phân tích.
  • Xác nhận giá trị sử dụng: Thực hiện các bước đánh giá độ chọn lọc, LLOQ, đường chuẩn, ảnh hưởng nền mẫu, độ nhiễm chéo, độ đúng và độ chính xác trong ngày và khác ngày, độ thu hồi, độ ổn định mẫu theo quy định của US-FDA và EMA.
  • Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện trong năm 2021 tại Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, với các giai đoạn chuẩn bị mẫu, xây dựng phương pháp, xác nhận giá trị sử dụng và ứng dụng định lượng trên mẫu người tình nguyện.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Điều kiện khối phổ tối ưu: Ion mẹ của vildagliptin được xác định tại m/z 304,0 ở chế độ ESI (+). Hai ion con đặc trưng được chọn là m/z 154,0 và 97,0 với năng lượng phân mảnh lần lượt 21 V và 39 V. Điện thế ion hóa tối ưu là 5000 V, điện thế bộ phận thu mẫu 142 V. Chuẩn nội carbamazepin được lựa chọn do có thời gian lưu tương tự và tính chất hóa lý phù hợp.

  2. Đường chuẩn và LLOQ: Đường chuẩn xây dựng trong khoảng nồng độ 3 – 600 ng/mL với hệ số tương quan r ≥ 0,98, sử dụng mô hình weighting 1/x² cho kết quả phù hợp nhất. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) đạt 3 ng/mL, đáp ứng yêu cầu độ nhạy cao trong phân tích.

  3. Độ đúng và độ chính xác: Độ đúng trong ngày và khác ngày nằm trong khoảng 85 – 115%, riêng LLOQ đạt 80 – 120%. Độ chính xác (CV) trong ngày và khác ngày đều ≤ 15%, đảm bảo tính lặp lại và tin cậy của phương pháp.

  4. Ảnh hưởng nền mẫu và độ thu hồi: Hệ số biến thiên (CV) của tỷ số MFAN/MFIS ≤ 15%, chứng tỏ phương pháp không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu. Độ thu hồi của vildagliptin và chuẩn nội ổn định, không vượt quá sai số 15%, đảm bảo hiệu quả chiết tách và xử lý mẫu.

  5. Độ ổn định mẫu: Mẫu huyết tương ổn định sau 6 chu kỳ đông – rã, bảo quản ở -70°C trong 77 ngày, và trong autosampler trong thời gian phân tích. Dung dịch chuẩn gốc và chuẩn nội cũng duy trì độ ổn định trong thời gian nghiên cứu.

Thảo luận kết quả

Phương pháp LC-MS/MS sử dụng phổ khối tứ cực chập ba với nguồn ion hóa ESI (+) cho phép định lượng vildagliptin trong huyết tương với độ nhạy và độ chọn lọc cao, vượt trội so với các phương pháp HPLC-UV truyền thống. Việc lựa chọn carbamazepin làm chuẩn nội giúp kiểm soát hiệu quả quá trình chiết tách và phân tích, giảm thiểu sai số do biến động thiết bị.

Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng rộng và LLOQ thấp cho phép phát hiện chính xác nồng độ vildagliptin trong mẫu huyết tương người tình nguyện, phù hợp với các nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học. Độ đúng và độ chính xác đạt tiêu chuẩn quốc tế, đảm bảo tính tin cậy của phương pháp trong ứng dụng thực tế.

Ảnh hưởng nền mẫu được kiểm soát tốt nhờ kỹ thuật kết tủa protein bằng acetonitril, giúp loại bỏ protein và giảm thiểu các tạp chất gây nhiễu trong quá trình ion hóa. Độ thu hồi cao và ổn định chứng tỏ quy trình xử lý mẫu hiệu quả, phù hợp với yêu cầu phân tích dược chất trong dịch sinh học.

Kết quả ổn định mẫu cho thấy phương pháp có thể áp dụng cho các nghiên cứu kéo dài, đảm bảo tính chính xác trong quá trình bảo quản và phân tích mẫu huyết tương. So sánh với các nghiên cứu trước đây, phương pháp này có thời gian phân tích ngắn, chi phí hợp lý và dễ dàng triển khai trong các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thuốc tại Việt Nam.

Biểu đồ đường cong nồng độ vildagliptin theo thời gian của người tình nguyện thể hiện rõ các thông số dược động học cơ bản như Cmax, Tmax và AUC, hỗ trợ đánh giá hiệu quả điều trị và tương đương sinh học của thuốc.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong kiểm nghiệm thuốc: Các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thuốc nên áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng vildagliptin trong huyết tương, nhằm nâng cao chất lượng kiểm soát thuốc trên thị trường. Thời gian thực hiện: trong vòng 6 tháng; Chủ thể thực hiện: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và các phòng thí nghiệm liên quan.

  2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ phân tích: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật LC-MS/MS và xử lý mẫu huyết tương để đảm bảo nhân lực có kỹ năng vận hành và phân tích chính xác. Thời gian: 3 tháng; Chủ thể: Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Kiểm nghiệm thuốc.

  3. Nâng cao nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học: Sử dụng phương pháp định lượng này trong các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm vildagliptin trong nước, góp phần phát triển dược phẩm nội địa. Thời gian: 1-2 năm; Chủ thể: Các công ty dược và viện nghiên cứu.

  4. Cải tiến quy trình xử lý mẫu: Nghiên cứu kết hợp kỹ thuật kết tủa protein với các phương pháp chiết pha rắn hoặc chiết lỏng-lỏng để giảm thiểu ảnh hưởng nền mẫu và tăng độ thu hồi, nâng cao độ chính xác phân tích. Thời gian: 6-12 tháng; Chủ thể: Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Hóa phân tích và Dược học: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật LC-MS/MS và quy trình xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học, hỗ trợ nghiên cứu và học tập.

  2. Phòng kiểm nghiệm thuốc và các cơ quan quản lý dược phẩm: Phương pháp định lượng vildagliptin được xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng giúp nâng cao chất lượng kiểm soát thuốc, phục vụ công tác cấp phép và giám sát chất lượng thuốc trên thị trường.

  3. Các công ty dược phẩm sản xuất và nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường: Thông tin về phương pháp phân tích và dược động học vildagliptin hỗ trợ phát triển sản phẩm, đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học, đảm bảo hiệu quả và an toàn thuốc.

  4. Bác sĩ và chuyên gia y tế trong lĩnh vực nội tiết và đái tháo đường: Kết quả nghiên cứu giúp hiểu rõ hơn về dược động học vildagliptin, hỗ trợ lựa chọn thuốc và điều chỉnh liều dùng phù hợp cho bệnh nhân, nâng cao hiệu quả điều trị.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với các kỹ thuật khác trong định lượng vildagliptin?
    Phương pháp LC-MS/MS có độ nhạy và độ chọn lọc cao, cho phép phát hiện nồng độ thuốc rất thấp (LLOQ 3 ng/mL), giảm thiểu nhiễu nền mẫu và tăng độ chính xác so với HPLC-UV hoặc các phương pháp sắc ký đơn thuần.

  2. Tại sao chọn carbamazepin làm chuẩn nội trong phương pháp này?
    Carbamazepin có tính chất hóa lý và thời gian lưu tương tự vildagliptin, ổn định trong quá trình xử lý mẫu và phân tích, giúp kiểm soát hiệu quả biến động trong quá trình chiết tách và phân tích, từ đó nâng cao độ chính xác.

  3. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương bằng kết tủa protein có nhược điểm gì?
    Kỹ thuật kết tủa protein đơn giản và nhanh nhưng không loại bỏ hoàn toàn các tạp chất hòa tan như phospholipid, có thể ảnh hưởng đến tuổi thọ cột sắc ký và gây nhiễu nền mẫu, do đó cần cân nhắc kết hợp với các kỹ thuật làm sạch khác.

  4. Phương pháp này có thể áp dụng cho các nghiên cứu tương đương sinh học không?
    Có, phương pháp đã được xác nhận giá trị sử dụng với độ chính xác và độ nhạy cao, phù hợp để định lượng vildagliptin trong huyết tương người tình nguyện, phục vụ các nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học.

  5. Mẫu huyết tương được bảo quản như thế nào để đảm bảo độ ổn định của vildagliptin?
    Mẫu huyết tương được kiềm hóa bằng NH4OH 2,5 M, bảo quản ở nhiệt độ -70°C và có thể ổn định sau 6 chu kỳ đông – rã, cũng như trong autosampler trong thời gian phân tích, đảm bảo độ tin cậy của kết quả định lượng.

Kết luận

  • Đã xây dựng thành công phương pháp định lượng vildagliptin trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS với độ nhạy cao (LLOQ 3 ng/mL) và độ chính xác tốt (CV ≤ 15%).
  • Phương pháp sử dụng ion mẹ m/z 304,0 và ion con m/z 154,0, 97,0, chuẩn nội carbamazepin phù hợp với điều kiện phân tích.
  • Kỹ thuật kết tủa protein bằng acetonitril được lựa chọn để xử lý mẫu huyết tương, đảm bảo độ thu hồi cao và giảm thiểu ảnh hưởng nền mẫu.
  • Phương pháp đã được xác nhận giá trị sử dụng theo tiêu chuẩn US-FDA và EMA, có thể ứng dụng trong nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học.
  • Đề xuất triển khai áp dụng phương pháp trong kiểm nghiệm thuốc và đào tạo nhân lực, đồng thời nghiên cứu cải tiến quy trình xử lý mẫu để nâng cao hiệu quả phân tích.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các cơ quan kiểm nghiệm và doanh nghiệp dược phẩm áp dụng phương pháp này để nâng cao chất lượng thuốc và hỗ trợ điều trị đái tháo đường hiệu quả hơn.