MỞ ĐẦU Vildagliptin, một chất thuộc nhóm thuốc tăng cường chức năng tiểu đảo tụy, là chất ức chế dipeptidyl-peptidase-4(DPP-4) mạnh và chọn lọc nên cải thiện được sự kiểm soát đường huyết [1-3]. Sự ức chế DPP-4 của vildagliptin làm tăng nồng độ các hormone incretin GLP-1 (glucagon-like peptide 1) và GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) nội sinh lúc đói và sau bữa ăn. Thuốc được chỉ định như một thuốc hỗ trợ cho chế độ ăn và luyện tập để cải thiện sự kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 (T2DM), đơn trị liệu hoặc phối hợp với thuốc điều trị đái tháo đường khác [4]. Hiện nay, một số doanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu sản xuất các chế phẩm chứa vildagliptin.
Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng của các thuốc này thông qua đánh giá tương đương sinh học chưa được thực hiện đầy đủ. Để xác định được chính xác nồng VDG trong máu, đánh giá chất lượng của thuốc cũng như hiệu quả điều trị trong lâm sàng của thuốc, cần thiết phải thực hiện các nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và đánh giá tương đương sinh học (TĐSH). Kết quả đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học giúp các bác sĩ có thêm cơ sở để lựa chọn thuốc thay thế hiệu quả hay hiệu chỉnh liều dùng cho phù hợp với từng bệnh nhân. Một trong những nội dung quan trọng của nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH là xây dựng quy trình chiết tách, xử lý mẫu và phân tích định lượng nồng độ thuốc trong dịch sinh học.
Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thấp, nền mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích. Hơn nữa khi vào cơ thể dưới sự tác động của rất nhiều loại enzym thì thuốc có thể bị chuyển hóa thành nhiều chất khác nhau nhưng có cấu trúc và tính chất tương tự như hoạt chất cần phân tích. Vì vậy, cần phải xây dựng được một phương pháp thích hợp có đủ độ nhạy và độ tin cậy theo quy định về xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích trong dịch sinh học. Do có độ nhạy và độ chọn lọc cao nên kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ ngày càng được ứng dụng nhiều trong phân tích thuốc trong dịch sinh học [5].
2 Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng Vildagliptin trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ” với mục đích xây dựng được một phương pháp phân tích phù hợp, để định lượng vildagliptin trong huyết tương người. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần nâng cao chất lượng thuốc trên thị trường cũng như đáp ứng yêu cầu điều trị trong lâm sàng. Mục tiêu cụ thể của đề tài là: 1. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng pháp định lượng vildagliptin trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ.
Ứng dụng định lượng vildagliptin trong huyết tương người tình nguyện bằng phương pháp vừa xác nhận giá trị sử dụng phục vụ đánh giá tương đương sinh học. TỔNG QUAN VỀ VILDAGLIPIN 1. Công thức cấu tạo và tính chất hoá lý Công thức phân tử, công thức cấu tạo và tính chất hoá lý cơ bản của Vildagliptin được trình bày dưới đây [6]: Tên khoa học: (2S)-1-[2-[(3-hydroxy-1-adamantyl)amino]acetyl]pyrrolidine-2-carbonitrile. Công thức phân tử: C17H25N3O2 Khối lượng phân tử: 303,4 g/mol pKa = 9,03 LogP = 1,12 Tính tan trong nước: 1,75mg/mL Hình 1.
Công thức cấu tạo của Vildagliptin 1. Dược động học Một số tính chất dược động học cơ bản của vildagliptin được đề cập trên nhiều tài liệu chuyên khảo [7], được trình bày tóm tắt như sau: - Hấp thu: Sau khi uống lúc đói, vildagliptin được hấp thu nhanh với nồng độ đỉnh trong huyết tương được quan sát thấy sau 1,75 giờ. Dùng cùng với thức ăn làm giảm nồng độ Cmax (19%) và có sự chậm lại về thời gian đạt đến nồng độ đỉnh trong huyết tương đến 2,5 giờ. Tuy nhiên mức độ thay đổi không có ý nghĩa lâm sàng.
4 - Phân bố: Vildagliptin gắn kết kém với protein huyết tương (9,3%) và phân bố bằng nhau giữa huyết tương và hồng cầu. - Chuyển hóa: Khoảng 69% liều uống của vildagliptin bị chuyển hóa. Chất chuyển hóa chính LAY151 không có hoạt tính dược lý và là sản phẩm thủy phân của nhóm chức cyano chiếm 57% liều dùng, tiếp theo là sản phẩm thủy phân nhóm chức amid (4% liều dùng). Vildagliptin không bị chuyển hóa bởi các enzym CYP P450.
Các nghiên cứu in vitro cho thấy vildagliptin không ức chế hoặc gây cảm ứng các enzyme CYP P450. - Thải trừ: Sau khi uống vildagliptin, khoảng 85% liều dùng được bài tiết vào nước tiểu và 15% được tìm thấy ở phân. Vildagliptin dạng không đổi bài tiết qua thận chiếm 23% liều dùng sau khi uống. Thời gian bán thải sau khi uống khoảng 3 giờ và không phụ thuộc vào liều dùng.
- Sự tuyến tính: Sinh khả dụng tuyệt đối đường uống của thuốc là 85%. Cmax và diện tích dưới đường cong (AUC) của vildagliptin gần như tăng tỉ lệ với liều dùng trong phạm vi liều điều trị. - Chỉ định: Thuốc được chỉ định như một thuốc hỗ trợ cho chế độ ăn và luyện tập để cải thiện sự kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 (T2DM), đơn trị liệu hoặc phối hợp với thuốc điều trị đái tháo đường khác. - Chống chỉ định: Chống chỉ định dùng bệnh nhân đã biết bị quá mẫn cảm với vildagliptin hoặc với bất cứ tá dược nào của thuốc.
- Tác dụng không mong muốn: Đa số các phản ứng bất lợi trong những thử nghiệm này là nhẹ và thoáng qua, không cần phải ngừng điều trị. Không có sự liên quan giữa những phản ứng bất lợi này với tuổi, chủng tộc, thời gian dùng thuốc hoặc liều lượng hàng ngày. + Các trường hợp hiếm gặp về rối loạn chức năng gan (kể cả viêm gan) đã được báo cáo. Trong những trường hợp này, bệnh nhân thường không có triệu chứng hay di chứng lâm sàng; các xét nghiệm chức năng gan trở về bình thường sau khi ngừng điều trị.
5 + Các tác dụng phụ sau có thể gặp phải khi dùng thuốc dưới dạng đơn trị liệu như sau: + Thường gặp (tần suất >1/100): chóng mặt. + Ít gặp (tần suất >=1/1000 và <1/100): đau đầu, táo bón, phù nề (bàn tay, bàn chân hay mắt cá chân), đau khớp, hạ đường huyết. + Rất hiếm gặp (tần suất <1/10.000): nhiễm trùng đường hô hấp trên. - Tương tác thuốc: Vildagliptin có khả năng tương tác thuốc yếu.
Vì vildagliptin không phải là một cơ chất của enzyme CYP 450, không ức chế và cũng không gây cảm ứng các enzyme CYP 450 nên không có khả năng tương tác với các thuốc dùng đồng thời là cơ chất, chất ức chế hoặc chất gây cảm ứng các enzyme này. Hơn nữa, vildagliptin không ảnh hưởng đến độ thanh thải chuyển hóa của các thuốc dùng đồng thời được chuyển hóa bởi CYP 1A2, CYP 2C8, CYP 2C9, CYP 2C19, CYP 2D6, CYP 2E1 và CYP 3A4/5. Các nghiên cứu về tương tác thuốc-thuốc đã được tiến hành với các thuốc thường được kê đơn đồng thời cho bệnh nhân đái tháo đường type 2 hoặc những thuốc có cửa sổ điều trị hẹp. Kết quả của những nghiên cứu này cho thấy không có tương tác nào có ý nghĩa lâm sàng với các thuốc điều trị đái tháo đường dạng uống khác (glibenclamid, pioglitazone, metformin), amlodipin, digoxin, ramipril, simvastatin, valsartan hoặc warfarin sau khi dùng đồng thời với vildagliptin.
Thuốc có thể tăng nguy cơ phù mạch ở bệnh nhân dùng kết hợp với chất ức chế ACE [6]. Một số phương pháp định lượng Vildagliptin Trong phân tích thuốc trong dịch sinh học, mẫu máu thường được sử dụng phổ biến hơn so với các mẫu khác như nước tiểu, nước bọt, dịch não tủy.do thao tác lấy mẫu thường dễ dàng và chủ động hơn. Các mẫu máu sau khi lấy được chuyển vào các ống nghiệm có chứa chất chống đông Na2–EDTA, ly tâm tách lấy phần huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ quy định cho đến khi được phân tích. 6 Với các thuốc chứa VDG, khoảng 85% liều dùng được bài tiết vào nước tiểu và 15% được tìm thấy ở phân.
Vildagliptin dạng không đổi bài tiết qua thận chiếm 23% liều dùng sau khi uống. Thời gian bán thải sau khi uống khoảng 3 giờ và không phụ thuộc vào liều dùng. Do đó, nồng độ VDG trong nước tiểu thường thấp hơn nhiều so với nồng độ VDG trong huyết tương. Chính vì vậy đa số các nghiên cứu định lượng VDG trong dịch sinh học được tiến hành trên mẫu huyết tương.
Trên thế giới đã có nhiều tác giả công bố phương pháp định lượng VDG trong huyết tương người bằng HPLC hoặc LC/MS được thể hiện trong Bảng 1. Một số nghiên cứu định lượng VDG trong huyết tương người Xử lý Tài liệu TT Điều kiện sắc ký LLOQ mẫu tham khảo - Cột C18, 250mm x 4,6; 5µm - Pha động: MeOH: MeCN: Đêm 1 LLE phosphat pH 3,5 (5: 30: 65 v/v) 1 mcg [8] - Detector: UV, 212 mm - Thời gian phân tích: 7,0 phút - Cột C18, 150mm x 4,6; 5µm - Pha động: Amoni bicacbonat 2 PPT 50mM pH 7,8: MeCN 10 mcg [9] - Detector: UV, 210 mm - Thời gian phân tích: 11,2 phút - Cột C8, 150 x 2mm; 3µm - Pha động: MeCN: Amoni format pH: 3,0 (90:10) 3 LLE 1 ng [10] - Detector: MS/MS - Thời gian phân tích mẫu: 7,5 phút 7 - Cột C18, 50mm x 4,6; 5µm - Pha động: MeCN: NaH2PO4 10Mm (3:7) và SDS (10mm) ở pH 4 PPT 4,5 0,1 mcg [11] - Detector: UV, 208 mm - Thời gian phân tích mẫu: 5 phút - Cột C18 (50 × 2,1 mm, 1,7 μm) - Pha động: Axit acetic 0,5%/ MeOH: Amoni axetat 0,02M 5 PPT (10:90). 5 ng [12] - Detector: MS/MS - Thời gian phân tích mẫu: 7,1 phút - Cột Atlantis HILIC Silica (150 mm × 2,1 mm, 3 μm) - Pha động: H2O: MeCN (80: 20) 6 PPT 5 ng [4] - Detector: MS/MS - Thời gian phân tích mẫu: 3,5 phút - Cột C18 (150 mm x 2,1mm; 5μm) - Cột Pha động: 40% A (Amoni 7 SPE axetat 10mM-MeOH [95:5] và 2 ng [13] 60% B (MeCN: MeOH [10/90]) - Thời gian phân tích: 25 phút Các kết quả nghiên cứu định lượng VDG trong huyết tương được tổng hợp trong Bảng 1.1, cho thấy những ưu, nhược điểm còn tồn tại như sau: Phương pháp [8] và [10] sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng (LLE), [8] có LLOQ cao (1mcg/mL và thời gian phân tích dài (7,0 phút), [10] thời gian phân tích mẫu dài (7,5 phút). 8 Phương pháp [4], [9], [11], [12] sử dụng phương pháp kết tủa protein nhưng [9], [11] có LLOQ cao (10 mcg/mL và 0,1 mcg/mL); [12] có thời gian phân tích dài (7,1 phút).
Phương pháp [4] cột phân tích giá thành cao không phù hợp.