Luận án tiến sĩ về phản ứng thủy phân acetylcholine và vai trò của enzym acetylcholinesterase

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phản ứng thủy phân acetylcholine với xúc tác enzym acetylcholinesterase bằng phương pháp hóa tin, cung cấp kiến thức chuyên sâu.

• Tác giả: Tống Thị Thu Cúc
• Người hướng dẫn: GS. Đặng Ứng Vận
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý
• Đề tài: Nghiên Cứu Phản Ứng Thủy Phân Acetylcholine Với Enzym Acetylcholinesterase
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. LỜI CAM ĐOAN
• 1.2. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1.3. DANH MỤC CÁC BẢNG
• 1.4. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• 1.5. TỔNG QUAN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 1.6. CƠ CHẾ PHẢN ỨNG XÚC TÁC ENZYM
• 1.7. MỘT SỐ CHẤT ỨC CHẾ ĐỐI VỚI ACETYLCHOLINESTERASE. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
• 1.8. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.8.1. PHƯƠNG PHÁP CƠ HỌC PHÂN TỬ
• 1.8.2. PHƯƠNG PHÁP PHIẾM HÀM MẬT ĐỘ
• 1.8.3. PHƯƠNG PHÁP KẾT HỢP CƠ HỌC LƯỢNG TỬ - CƠ HỌC PHÂN TỬ (QM/MM)
• 1.8.4. KĨ THUẬT PROTEIN DOCKING
• 1.9. NGUỒN DỮ LIỆU VÀ CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU
• 1.9.1. NGUỒN DỮ LIỆU
• 1.9.2. GAUSSIAN 09W VÀ GAUSSVIEW
• 1.10. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 1.10.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT DOCKING CHO CƠ CHẤT ACETYLCHOLINE
• 1.10.2. KẾT QUẢ DOCKING ĐỐI VỚI ACETYLCHOLINESTERASE Ở CÁ ĐUỐI ĐIỆN
• 1.10.3. KẾT QUẢ DOCKING ĐỐI VỚI ACETYLCHOLINESTERASE Ở NGƯỜI
• 1.10.4. KẾT QUẢ TÍNH QM/MM CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN ACETYLCHOLINE NHỜ XÚC TÁC ENZYM Ở CÁ ĐUỐI ĐIỆN VÀ Ở NGƯỜI
• 1.10.5. KẾT QUẢ TÍNH QM/MM CHO PHẢN ỨNG Ở CÁ ĐUỐI ĐIỆN
• 1.10.6. KẾT QUẢ TÍNH QM/MM CHO PHẢN ỨNG Ở NGƯỜI
• 1.10.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐẾN ACETYLCHOLINESTERASE
• 1.10.8. KẾT QUẢ DOCKING CỦA DONEPEZIL
• 1.10.9. KẾT QUẢ DOCKING CỦA GALANTAMIN
• 1.10.10. KẾT QUẢ DOCKING CỦA TACRIN
• 1.10.11. KẾT QUẢ DOCKING CỦA NEOSTIGMIN
• 1.10.12. KẾT QUẢ DOCKING CỦA PHYSOSTIGMIN
• 1.10.13. KẾT QUẢ DOCKING CỦA RIVASTIGMIN
• 1.10.14. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ỨC CHẾ KHI GẮN KẾT NGOÀI HỐC PHẢN ỨNG
• 1.11. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• 1.12. CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• 1.13. TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu về acetylcholine và enzym acetylcholinesterase là một lĩnh vực quan trọng trong hóa sinh. Acetylcholine là một chất dẫn truyền xung thần kinh chủ yếu trong hệ thần kinh tự chủ, có vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu giữa các tế bào thần kinh. Enzym acetylcholinesterase xúc tác cho phản ứng thủy phân acetylcholine, giúp điều chỉnh nồng độ của chất này trong cơ thể. Phản ứng này không chỉ quan trọng trong sinh lý học mà còn có ý nghĩa trong việc phát triển các liệu pháp điều trị cho các rối loạn liên quan đến hệ thần kinh. Việc hiểu rõ cơ chế của phản ứng này sẽ giúp phát triển các chất ức chế enzym, từ đó điều chỉnh hoạt động của acetylcholine trong các bệnh lý như Alzheimer.

II. Cơ chế phản ứng xúc tác enzym

Cơ chế xúc tác của acetylcholinesterase diễn ra qua hai giai đoạn chính: acetyl hóa và thủy phân. Trong giai đoạn acetyl hóa, acetylcholine gắn vào vị trí hoạt động của enzym, tạo thành phức hợp trung gian. Sau đó, phức hợp này trải qua quá trình thủy phân để giải phóng axit acetic và choline. Sự tương tác giữa các amino axit trong enzym, đặc biệt là Ser, His, và Glu, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hoạt tính xúc tác. Nghiên cứu cho thấy rằng sự thay đổi cấu trúc của enzym có thể ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng, từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các chất ức chế enzym nhằm điều trị các bệnh lý liên quan đến rối loạn dẫn truyền thần kinh.

III. Một số chất ức chế đối với acetylcholinesterase

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều chất ức chế có khả năng tác động lên enzym acetylcholinesterase, làm giảm hoạt tính của enzym này. Các chất như donepezil, galantamin, và rivastigmin đã được khảo sát và cho thấy khả năng gắn kết mạnh mẽ với enzym, từ đó ức chế quá trình thủy phân acetylcholine. Việc sử dụng các chất ức chế này trong điều trị các bệnh lý như Alzheimer đã được chứng minh là có hiệu quả. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các chất ức chế này có thể tạo ra các phức hợp với enzym, làm thay đổi cấu trúc và hoạt tính của enzym, từ đó ảnh hưởng đến quá trình truyền dẫn xung thần kinh.

IV. Kết quả và bàn luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các phương pháp hóa tin như DFT và QM/MM đã giúp làm rõ cơ chế phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym acetylcholinesterase. Các mô hình docking cho thấy sự tương đồng trong cấu trúc enzym giữa cá đuối điện và người, mặc dù có sự khác biệt về năng lượng và cấu trúc chi tiết. Những phát hiện này không chỉ làm sáng tỏ cơ chế xúc tác mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị cho các rối loạn liên quan đến hệ thần kinh. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của enzym sẽ giúp cải thiện hiệu quả của các chất ức chế enzym trong điều trị lâm sàng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của tác giả Tống Thị Thu Cúc, với đề tài "Góp phần nghiên cứu phản ứng thủy phân acetylcholine với xúc tác enzym acetylcholinesterase bằng phương pháp hóa tin", được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội (năm 2015), thuộc chuyên ngành Hóa lý thuyết và Hóa lý (mã số: 62.19), dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Đặng Ứng Vận.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Trong hệ thần kinh tự chủ, thần kinh ngoại biên và thần kinh trung ương, acetylcholine đóng vai trò là chất dẫn truyền xung thần kinh thiết yếu. Sau khi hoàn thành việc truyền tín hiệu qua các thụ thể, acetylcholine phải được thủy phân nhanh chóng thành choline và axit acetic nhằm tránh hiện tượng chồng lấn tín hiệu xung thần kinh. Phản ứng này diễn ra dưới sự xúc tác của enzym acetylcholinesterase (thuộc nhóm esterase) với hiệu quả xúc tác cao (hệ số chu chuyển đạt $10^3 - 10^4\text{ s}^{-1}$, tốc độ phản ứng tiệm cận giới hạn khuếch tán).

Bằng thực nghiệm hóa sinh sử dụng đồng vị phóng xạ đánh dấu $^3\text{H}$ và quang phổ Ellman, Harry C. Froede và Irwin B. Wilson (1984) đã đề xuất cơ chế acetylenzym gồm hai giai đoạn: giai đoạn acetyl hóa (tạo phức enzym – cơ chất và chuyển nhóm acetyl sang enzym) và giai đoạn deacetyl hóa (thủy phân acetyl-enzym để tái tạo enzym). Tuy nhiên, các đặc trưng cấu trúc không gian chi tiết, bề mặt thế năng, biến đổi năng lượng và tương tác điện tử ở mức độ phân tử trong suốt quá trình phản ứng vẫn chưa được mô tả đầy đủ bằng các phương pháp hóa học lượng tử. Tại Việt Nam, trước thời điểm luận án được công bố, chưa có công trình tính toán lý thuyết hay thực nghiệm chuyên sâu nào về cơ chế xúc tác của enzym acetylcholinesterase. Việc ứng dụng các phương pháp hóa tin (DFT, QM/MM, docking phân tử) nhằm kiểm chứng cơ chế thực nghiệm và đánh giá tương tác của các chất ức chế là yêu cầu cần thiết để bổ sung dữ liệu lý thuyết và định hướng ứng dụng hóa dược.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Nghiên cứu cơ chế giai đoạn acetyl hóa của phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác enzym acetylcholinesterase ở cá đuối điện (Torpedo californica) và ở người (Homo sapiens) theo cơ chế acetylenzym, nhằm làm rõ các yếu tố cấu trúc và điện tử quyết định hoạt tính xúc tác của enzym.
2. Khảo sát ảnh hưởng và khả năng gắn kết của 6 chất ức chế acetylcholinesterase (donepezil, galantamin, tacrin, neostigmin, physostigmin, rivastigmin) tại hốc phản ứng và ngoài hốc phản ứng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Phản ứng thủy phân acetylcholine với sự tham gia xúc tác của enzym acetylcholinesterase ở hai loài: cá đuối điện (Torpedo californica) và người (Homo sapiens).
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Về không gian cấu trúc: Mô hình hóa phân tử enzym ở dạng monome hoạt hóa dựa trên dữ liệu nhiễu xạ tia X từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB: mã 1EVE đối với cá đuối điện và mã 4EY4 đối với người).
  • Về tiến trình phản ứng: Tập trung khảo sát chi tiết giai đoạn acetyl hóa (tương tác trực tiếp giữa cơ chất acetylcholine với bộ ba amino axit tại tâm hoạt động) và mô phỏng docking phân tử 6 chất ức chế đã từng được sử dụng làm thuốc điều trị rối loạn thần kinh.

Thông số đối tượng	Cá đuối điện (Torpedo californica)	Người (Homo sapiens)
Mã dữ liệu PDB	1EVE	4EY4
Độ phân giải dữ liệu tinh thể	2,50 Å	2,16 Å
Số amino axit chuỗi hoạt hóa	543 amino axit	542 amino axit
Bộ ba tâm xúc tác	Ser200 – His440 – Glu327	Ser203 – His447 – Glu334
Dạng cấu trúc mô phỏng	Monome	Monome (tách từ dạng đime)

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm trước đây

• Mô hình xúc tác enzym: Luận án điểm lại quá trình phát triển các lý thuyết xúc tác enzym từ mô hình "chìa khóa – ổ khóa" của Emil Fischer (1894), mô hình "khớp cảm ứng" của Daniel Koshland (1958) đến động học Michaelis – Menten và các cơ chế hạ thấp năng lượng hoạt hóa (làm bền trạng thái chuyển tiếp, tạo phân bố điện tích ngược, tạo đường phản ứng qua phức trung gian, giảm biến thiên entropy). Nghiên cứu của Pisliakov và cộng sự chỉ ra rằng các biến đổi cấu dạng ở thang thời gian mili giây không đóng góp đáng kể vào bản chất xúc tác hóa học của enzym.
• Thực nghiệm trên acetylcholinesterase: Công trình của Harry C. Froede và Irwin B. Wilson (1984) trên acetylcholinesterase từ Electrophorus electricus đã xác nhận sự hình thành phức enzym – cơ chất và đưa ra sơ đồ 3 bước của cơ chế acetylenzym: $$\text{E} + \text{S} \rightleftharpoons \text{ES} \quad (1)$$ $$\text{ES} \rightarrow \text{ES}' + \text{P}_1 \quad (2)$$ $$\text{ES}' + \text{H}_2\text{O} \rightarrow \text{E} + \text{P}_2 \quad (3)$$ Trong đó $\text{E}$ là enzym, $\text{S}$ là acetylcholine, $\text{ES}'$ là phức acetyl-enzym, $\text{P}_1$ là choline và $\text{P}_2$ là axit acetic.
• Ứng dụng hóa tin trong hóa sinh: Các phương pháp cơ học phân tử (MMPBSA/MMGBSA của Wright và cộng sự trên HIV-1 protease), mô phỏng QM/MM của Marcus Lundberg và cộng sự trên isopenicillin N synthase, nghiên cứu metalloenzym của Maricel Torrent và cộng sự.
• Tính toán lượng tử trên acetylcholinesterase: Nhóm nghiên cứu của Yanzi Zhou sử dụng QM/MM kết hợp kỹ thuật umbrella sampling trên acetylcholinesterase ở chuột, thu được hàng rào năng lượng giai đoạn acetyl hóa là 12,4 kcal/mol và giai đoạn deacetyl hóa là 17,5 kcal/mol. Nemukhin và cộng sự thực hiện tính toán QM/MM phân mảnh hiệu dụng dựa trên cấu trúc 2VJA ở cá đuối điện, xác định hàng rào năng lượng tạo phức là 4,7 kcal/mol và phân tích vai trò của các gốc Gly118, Gly119, Ala201.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Luận án tập trung giải quyết khoảng trống về việc mô tả chi tiết hình học phối trí, sự biến đổi bề mặt thế năng và sự tái phân bố điện tích trong giai đoạn acetyl hóa khi so sánh trực tiếp giữa hai hệ enzym: enzym có hoạt tính cao ở cá đuối điện và enzym ở người. Đồng thời, luận án thực hiện đánh giá có hệ thống năng lượng gắn kết của 6 hợp chất ức chế lâm sàng vào hốc phản ứng và sự biến dạng cấu trúc của phức trung gian khi phối tử gắn kết ở vị trí ngoài hốc hoạt động.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án kết hợp bốn phương pháp và lý thuyết nền tảng của hóa học tính toán:

1. Phương pháp Cơ học phân tử (Molecular Mechanics - MM): Mô hình hóa phân tử dựa trên cơ học cổ điển theo định luật II Newton. Tổng năng lượng trường lực ($E_{\text{FF}}$) được phân tách thành: $$E_{\text{FF}} = E_{\text{str}} + E_{\text{bend}} + E_{\text{tors}} + E_{\text{vdw}} + E_{\text{el}} + E_{\text{cross}}$$ Sử dụng trường lực AMBER (bộ tham số AMBER parm96 trong gói phần mềm Amber10) cho khung protein và bộ tham số GAFF (General AMBER Force Field trong AmberTools-1) cho phân tử cơ chất hữu cơ và các chất ức chế.

2. Lý thuyết Phiếm hàm Mật độ (Density Functional Theory - DFT): Dựa trên hai định lý Hohenberg – Kohn và hệ phương trình Kohn – Sham tự nhất quán, cho phép tính toán cấu trúc điện tử và năng lượng trạng thái cơ bản thông qua mật độ electron $\rho(r)$. Phiếm hàm lai hóa B3LYP (kết hợp các thành phần trao đổi Hartree – Fock, LDA và GGA theo các hiệu chỉnh của Becke và Lee – Yang – Parr) được sử dụng để tối ưu hóa hình học và xác định trạng thái chuyển tiếp.

3. Phương pháp kết hợp Cơ học lượng tử / Cơ học phân tử (QM/MM qua kỹ thuật ONIOM): Năng lượng tổng của hệ được tính theo biểu thức ONIOM ba bước: $$E_{\text{ONIOM}} = E_{\text{Model, High}} + E_{\text{Real, Low}} - E_{\text{Model, Low}}$$ Trong đó:

• Vùng QM (Model, High): Áp dụng DFT/B3LYP để mô tả trực tiếp quá trình tạo và đứt liên kết cộng hóa trị giữa acetylcholine và các gốc amino axit hoạt động.
• Vùng MM (Real, Low): Áp dụng trường lực AMBER parm96 để mô tả hiệu ứng không gian và tương tác tĩnh điện của toàn bộ cấu trúc protein còn lại.

4. Kỹ thuật Protein Docking: Sử dụng phần mềm AutoDock Vina với thuật toán tìm kiếm kết hợp các bước đột biến và tối ưu hóa cục bộ theo tiêu chuẩn Metropolis để xác định các cấu dạng gắn kết có năng lượng tự do liên kết thấp nhất.

Công cụ / Phần mềm	Vai trò trong luận án	Bộ tham số / Thuật toán
AutoDock Vina & AutoDockTools	Khảo sát docking phân tử acetylcholine và 6 chất ức chế	Thuật toán lặp đột biến, tối ưu Metropolis
Gaussian 09W & GaussView 5.8	Tính toán lượng tử DFT và QM/MM (ONIOM)	Phiếm hàm B3LYP, kỹ thuật nhúng điện tử (EE)
Amber10 & AmberTools-1	Gán trường lực và tham số hóa phân tử	AMBER parm96 (protein), GAFF (cơ chất/phối tử)
Accelrys Discovery Studio & MS Modeling	Xử lý file cấu trúc PDB, hoàn thiện chuỗi peptit	Sửa lỗi thiếu gốc 260–261, hiển thị đồ họa

Nguồn dữ liệu và quy tắc phân vùng QM/MM

• Dữ liệu PDB: Dữ liệu cấu trúc tinh thể tia X được tải từ Protein Data Bank. Cấu trúc 1EVE ở cá đuối điện có độ phân giải 2,50 Å. Cấu trúc 4EY4 ở người có độ phân giải 2,16 Å (dạng đime ban đầu được tách thành monome; hai amino axit bị thiếu ở vị trí 260 và 261 được khôi phục nhờ Discovery Studio 4.0 và GaussView 5.8, sau đó tối ưu hóa hình học bằng trường lực AMBER).
• Sáu quy tắc phân vùng QM/MM được thiết lập:
  • Quy tắc 1: Phần diễn ra phản ứng hóa học (acetylcholine, nhóm hydroxyl của Ser200/Ser203 và vòng imidazol của His440/His447) phải nằm hoàn toàn trong vùng QM.
  • Quy tắc 2: Vùng MM phải đảm bảo mô tả chính xác hiệu ứng không gian và tương tác tĩnh điện của khung protein.
  • Quy tắc 3: Các liên kết bị cắt qua ranh giới QM/MM phải là liên kết đơn và được bù bão hòa bằng nguyên tử giả (Link atom H).
  • Quy tắc 4: Vị trí cắt liên kết phải cách tâm phản ứng hóa học từ 3 liên kết đơn trở lên nhằm duy trì tính liên tục của các số hạng trường lực 4 tâm trong MM.
  • Quy tắc 5: Tuyệt đối không cắt qua các cấu trúc vòng nhằm tránh làm mất độ cứng và sức căng vòng.
  • Quy tắc 6: Cắt qua 3 liên kết đơn trên khung enzym sao cho sai số hình học và điện tử có thể triệt tiêu lẫn nhau khi so sánh giữa trạng thái phản ứng và sản phẩm.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan đối tượng nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu

Chương này hệ thống hóa các kiến thức cơ sở về đối tượng và phương pháp tính toán:

• Cấu trúc enzym: Trình bày cấu trúc bậc 1 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện (chuỗi đầy đủ gồm 586 amino axit; sau khi cắt 21 gốc tín hiệu đầu N và 22 gốc tiền hoạt hóa đầu C, phân tử hoạt động gồm 543 amino axit). So sánh cấu trúc bậc 2 (các đoạn xoắn $\alpha$, phiến gấp $\beta$ và cầu disunfua tương đồng) và cấu trúc bậc 3 giữa cá đuối điện và người, chỉ ra hốc hoạt động sâu với tâm xúc tác Ser nằm ở đáy hốc được bao quanh bởi các amino axit vòng thơm. Phân tích cấu trúc bậc 4 và đưa ra căn cứ lựa chọn mô hình monome cho tính toán.
• Cơ chế phản ứng và chất ức chế: Phân tích cơ chế acetylenzym 3 bước của Froede và Wilson; điểm luận các đặc tính hóa dược của 6 chất ức chế: donepezil (Aricept điều trị Alzheimer), galantamin (Razadyne), tacrin (Cognex), neostigmin (Prostigmin điều trị nhược cơ), physostigmin (Antilirium) và rivastigmin (Exelon).
• Phương pháp tính toán: Trình bày chi tiết toán học của phương pháp cơ học phân tử, phương pháp DFT (các định lý Hohenberg – Kohn, phương trình Kohn – Sham, phiếm hàm trao đổi – tương quan B3LYP), phương pháp QM/MM (mô hình Warshel – Levitt, mô hình Kollman, biểu thức ONIOM) và nguyên lý docking phân tử.

Chương 2: Nguồn dữ liệu và công cụ nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị dữ liệu và thiết lập tham số:

• Đánh giá dữ liệu tinh thể PDB: Phân tích tương quan giữa độ phân giải tinh thể tia X và độ tin cậy của tọa độ nguyên tử (từ mức $>4,0\text{ \AA}$ đến $0,5-1,5\text{ \AA}$). Luận giải việc lựa chọn cấu trúc 1EVE ($2,5\text{ \AA}$) và 4EY4 ($2,16\text{ \AA}$).
• Quy trình xử lý cấu trúc: Mô tả chi tiết việc chuẩn hóa tệp cấu trúc 4EY4 (tách chuỗi polypeptit đơn, tái dựng hai amino axit bị khuyết 260 và 261, tối ưu hóa năng lượng trường lực).
• Quy trình tính toán 3 bước:
  • Bước 1: Chuẩn bị cấu trúc bằng Accelrys MS Modeling 4.0 và Discovery Studio 2.0 / 4.0.
  • Bước 2: Bổ sung tham số trường lực AMBER parm96 cho protein và GAFF cho cơ chất/chất ức chế bằng AmberTools-1.
  • Bước 3: Phân mức ONIOM trên Gaussian 09W / GaussView 5.8 tuân thủ nghiêm ngặt 6 quy tắc phân vùng. Thiết lập không gian lưới cho docking trên AutoDock Vina.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ các số liệu tính toán và thảo luận chuyên sâu qua 3 nhóm nội dung chính:

[Tiến trình phản ứng thủy phân giai đoạn acetyl hóa qua tính toán QM/MM]
INT1 (Phức gắn kết cơ chất - enzym ban đầu)
INT2 (Phức trung gian tứ diện)
INT3 (Sản phẩm giai đoạn acetyl hóa: Acetyl-enzym + Choline tách rời)

1. Kết quả docking của acetylcholine

• Ở cá đuối điện: Xác định các vùng gắn kết thuận lợi của acetylcholine trong hốc phản ứng. Khảo sát hai trường hợp: khi các nhánh Ser200 và His440 cố định và khi quay tự do, chỉ ra trạng thái có năng lượng gắn kết âm nhất định hướng đầu este về phía Ser200.
• Ở người: Xác định không gian docking, các cụm cấu hình thuận lợi và trạng thái gắn kết tối ưu của acetylcholine vào đáy hốc hoạt động của cấu trúc 4EY4.

2. Kết quả tính toán QM/MM cho giai đoạn acetyl hóa

• Ở cá đuối điện:
  • Xác định cấu trúc tối ưu của phức chất ban đầu ($\text{Tp_INT1}$), phân tích sự biến dạng hình học của acetylcholine và tâm xúc tác so với trạng thái tự do.
  • Xây dựng đường quét thế năng giai đoạn tạo phức theo khoảng cách $\text{C}(24) - \text{O}(6)$, xác định trạng thái chuyển tiếp $\text{Tp_TS1}$ dẫn tới chất trung gian tứ diện bền $\text{Tp_INT2}$.
  • Xây dựng đường quét thế năng giai đoạn phân cắt este giải phóng choline theo khoảng cách $\text{N}(11) - \text{H}(14)$, xác định trạng thái chuyển tiếp $\text{Tp_TS2}$ dẫn tới trạng thái sản phẩm $\text{Tp_INT3}$.
  • Phân tích các trạng thái ảo ($\text{Tp_Vir1}, \text{Tp_Vir2}, \text{Tp_Vir3}$) và vai trò ổn định của vòng thơm tryptophan ($\text{Tp_Vir1Trp}, \text{Tp_Vir2Trp}$).
  • Tổng hợp năng lượng và momen lưỡng cực của vùng Model trong từng trạng thái.
• Ở người:
  • Xác định các trạng thái tương ứng: $\text{Ho_INT1}$, trạng thái chuyển tiếp $\text{Ho_TS1}$ (quét khoảng cách $\text{C}(24) - \text{O}(8)$), phức trung gian tứ diện $\text{Ho_INT2}$, trạng thái chuyển tiếp $\text{Ho_TS2}$ (quét khoảng cách $\text{N}(17) - \text{H}(9)$) và trạng thái sản phẩm $\text{Ho_INT3}$.
  • Phân tích các cấu trúc $\text{Ho_Vir1}$, $\text{Ho_Vir2}$, $\text{Ho_Vir3}$, cấu trúc tương tác với Trp ($\text{Ho_Vir1Trp}, \text{Ho_Vir2Trp}$) và so sánh khoảng cách từ nguyên tử N của acetylcholine đến vòng Trp giữa người và cá đuối điện.
  • So sánh chi tiết khoảng cách liên kết (Å) giữa các nguyên tử chủ chốt trong trạng thái $\text{Tp_INT1}$ và $\text{Ho_INT1}$.

3. Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế

• Tối ưu hóa cấu trúc và xác định momen lưỡng cực của 6 chất: donepezil, galantamin, tacrin, neostigmin, physostigmin, rivastigmin.
• Thực hiện docking 6 chất ức chế lên acetylcholinesterase ở cá đuối điện và ở người, lập bảng năng lượng gắn kết và xác định các vị trí neo đậu thuận lợi tại hốc phản ứng.
• Đánh giá ảnh hưởng khi phối tử gắn kết ngoài hốc phản ứng: Tính toán độ lệch chuẩn cấu trúc (RMSD) của phức trung gian $\text{Ho_INT2}$ khi có donepezil gắn ở bề mặt ngoài, chứng minh sự biến dạng không gian của tâm hoạt động dưới tác động dị lập thể.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học lý luận

1. Kiểm chứng cơ chế acetylenzym bằng mô hình lượng tử: Luận án đã làm sáng tỏ ở cấp độ nguyên tử và điện tử cơ chế phản ứng thủy phân acetylcholine trong giai đoạn acetyl hóa trên cả hai hệ enzym cá đuối điện và người. Kết quả tính toán QM/MM (DFT/AMBER) khẳng định giai đoạn này trải qua hai bước kế tiếp: bước thứ nhất tạo phức trung gian tứ diện (INT2) qua trạng thái chuyển tiếp TS1, bước thứ hai tách choline qua trạng thái chuyển tiếp TS2 để hình thành acetyl-enzym (INT3).
2. Làm rõ vai trò phối hợp của các amino axit tại tâm hoạt động:
   • Nhóm hydroxyl của gốc Ser (Ser200 ở cá đuối điện, Ser203 ở người) đóng vai trò là tác nhân nucleophin tấn công vào nguyên tử cacbon cacbonyl của acetylcholine.
   • Vòng imidazol của gốc His (His440 ở cá đuối điện, His447 ở người) đóng vai trò xúc tác axit – bazơ đồng thời: nhận proton từ Ser để tăng hoạt tính nucleophin ở bước 1, sau đó nhường proton cho nhóm choline để tạo nhóm xuất tốt ở bước 2.
   • Gốc Glu (Glu327 ở cá đuối điện, Glu334 ở người) định hướng và làm bền cấu hình của His thông qua liên kết hydro.
   • Các gốc amino axit vòng thơm xung quanh hốc phản ứng, đặc biệt là gốc Tryptophan (Trp), đóng vai trò giữ và ổn định đầu amoni bậc bốn của acetylcholine thông qua tương tác cation – $\pi$.
3. So sánh định lượng giữa hai loài: Phân tích sự tương đồng và khác biệt về thông số hình học (khoảng cách liên kết Å), phân bố điện tích và biến đổi năng lượng phản ứng giữa enzym ở người và cá đuối điện, giải thích cơ sở hoạt tính xúc tác cao của enzym ở cá đuối điện.

Đóng góp thực tiễn và kiến nghị giải pháp

• Đánh giá cơ chế ức chế phân tử: Xác định ái lực liên kết và vị trí neo đậu của 6 dược chất ức chế (donepezil, galantamin, tacrin, neostigmin, physostigmin, rivastigmin). Cả 6 chất đều có khả năng chiếm giữ hốc phản ứng, ngăn cản cơ chất acetylcholine tiếp cận tâm xúc tác.
• Phát hiện hiệu ứng gắn ngoài hốc phản ứng: Tính toán cho thấy khi chất ức chế (donepezil) gắn kết ở vị trí ngoài hốc hoạt động, nó gây ra sự dịch chuyển cấu hình (đo bằng RMSD) của các amino axit tại tâm xúc tác, dẫn đến ức chế hoạt tính enzym theo cơ chế dị lập thể.
• Ý nghĩa hóa dược: Cung cấp bộ thông số cấu trúc và quy trình phân vùng QM/MM làm cơ sở cho việc thiết kế, sàng lọc ảo các dẫn xuất ức chế acetylcholinesterase mới trong điều trị bệnh Alzheimer và các rối loạn dẫn truyền thần kinh.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

• Luận án mới tập trung mô phỏng chi tiết giai đoạn thứ nhất và thứ hai (giai đoạn acetyl hóa) của cơ chế phản ứng, chưa hoàn thành tính toán QM/MM toàn diện cho giai đoạn thứ ba (giai đoạn deacetyl hóa – phản ứng thủy phân acetyl-enzym với phân tử nước để tái tạo enzym tự do).
• Mô hình enzym được khảo sát ở trạng thái tĩnh monome tách rời từ dữ liệu tinh thể PDB, chưa tính toán động lực học phân tử (Molecular Dynamics) dài hạn có màng sinh chất và dung môi nước đầy đủ.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiếp tục sử dụng phương pháp QM/MM để khảo sát giai đoạn deacetyl hóa, hoàn thiện bức tranh năng lượng toàn phần của chu trình xúc tác 3 bước.
• Áp dụng mô phỏng động lực học phân tử (MD) kết hợp kỹ thuật umbrella sampling để khảo sát đường xâm nhập của acetylcholine và các chất ức chế từ dung dịch vào đáy hốc phản ứng.
• Mở rộng tính toán thiết kế các cấu trúc chất ức chế mới có độ chọn lọc cao hơn đối với acetylcholinesterase ở người.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị trong các lĩnh vực:

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa lý thuyết, Hóa lý và Hóa tin: Cung cấp phương pháp luận chuẩn xác về kỹ thuật phân vùng ONIOM (QM/MM), 6 quy tắc cắt liên kết và phương pháp gán tham số trường lực GAFF/AMBER cho phức hợp protein – phối tử.
• Đối với các nhà nghiên cứu Hóa sinh học và Sinh học phân tử: Cung cấp dữ liệu chi tiết về tọa độ, khoảng cách nguyên tử và vai trò xúc tác của bộ ba Ser – His – Glu cùng tương tác cation – $\pi$ của vòng Trp trong các enzym nhóm esterase.
• Đối với các nhà nghiên cứu Hóa dược và Phát triển thuốc: Cung cấp mô hình docking và dữ liệu so sánh ái lực liên kết của 6 hoạt chất ức chế acetylcholinesterase, hỗ trợ định hướng phát triển thuốc điều trị Alzheimer và bệnh nhược cơ.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Bộ ba amino axit tại tâm xúc tác của acetylcholinesterase ở cá đuối điện và ở người gồm những gốc nào?

Ở cá đuối điện (Torpedo californica), bộ ba amino axit tại tâm xúc tác là Ser200 – His440 – Glu327. Ở người (Homo sapiens), bộ ba amino axit tương ứng là Ser203 – His447 – Glu334. Trong đó, Ser đóng vai trò tác nhân nucleophin, His đóng vai trò xúc tác axit – bazơ và Glu liên kết định hướng cho His.

2. Hai cấu trúc PDB nào được sử dụng làm dữ liệu đầu vào và chất lượng của chúng ra sao?

Tác giả sử dụng hai tệp cấu trúc tinh thể tia X từ Protein Data Bank: mã 1EVE đối với acetylcholinesterase ở cá đuối điện (độ phân giải 2,50 Å) và mã 4EY4 đối với acetylcholinesterase ở người (độ phân giải 2,16 Å). Cả hai cấu trúc đều có độ phân giải trong khoảng $2,0 - 2,5\text{ \AA}$, đảm bảo độ tin cậy cao cho việc xác định tọa độ khung protein, các mạch nhánh và hốc hoạt động.

3. Sáu quy tắc phân vùng QM/MM trong luận án được thiết lập như thế nào?

Sáu quy tắc phân vùng gồm: (1) Phần phản ứng hóa học trực tiếp phải nằm trọn trong vùng QM; (2) Vùng MM phải mô tả được hiệu ứng không gian và tĩnh điện; (3) Vị trí cắt qua ranh giới phải là liên kết đơn và được bù bằng nguyên tử giả (Link atom); (4) Điểm cắt liên kết phải cách tâm phản ứng từ 3 liên kết trở lên để đảm bảo tính liên tục của trường lực MM; (5) Không cắt qua cấu trúc vòng; (6) Sai số do cắt 3 liên kết đơn phải có khả năng bù trừ giữa chất phản ứng và sản phẩm.

4. Sáu chất ức chế acetylcholinesterase được khảo sát trong luận án là những chất nào?

Sáu chất ức chế được khảo sát docking gồm: Donepezil (tên thương mại Aricept), Galantamin (Razadyne, Nivalin), Tacrin (Cognex), Neostigmin (Prostigmin), Physostigmin (Antilirium) và Rivastigmin (Exelon). Các chất này được sử dụng trong điều trị Alzheimer, sa sút trí tuệ, nhược cơ và tăng nhãn áp.

5. Giai đoạn acetyl hóa diễn ra qua những trạng thái cấu trúc cơ bản nào trong tính toán QM/MM?

Giai đoạn acetyl hóa diễn ra qua 5 trạng thái cấu trúc chính: trạng thái phức chất ban đầu ($\text{INT1}$), trạng thái chuyển tiếp thứ nhất ($\text{TS1}$ – hình thành liên kết giữa C cacbonyl của acetylcholine và O của Ser), chất trung gian tứ diện ($\text{INT2}$), trạng thái chuyển tiếp thứ hai ($\text{TS2}$ – chuyển proton từ His sang O của choline và cắt liên kết este), và trạng thái sản phẩm ($\text{INT3}$ – acetyl-enzym cùng phân tử choline tách rời).

---

Kết luận

Luận án của tác giả Tống Thị Thu Cúc đã ứng dụng thành công các phương pháp hóa tin (DFT/B3LYP, QM/MM ONIOM DFT/AMBER và Protein Docking) để mô phỏng chi tiết giai đoạn acetyl hóa trong phản ứng thủy phân acetylcholine xúc tác bởi acetylcholinesterase ở cá đuối điện và ở người. Kết quả tính toán đã kiểm chứng vững chắc cơ chế acetylenzym được đề xuất từ thực nghiệm, làm sáng tỏ vai trò nucleophin của Ser, vai trò cầu nối proton của His và hiệu ứng ổn định cation – $\pi$ của gốc Trp. Đồng thời, công trình đã xác lập được bức tranh định lượng về tương tác của 6 chất ức chế tại hốc hoạt động và chứng minh ảnh hưởng dị lập thể khi chất ức chế gắn kết ngoài hốc phản ứng. Luận án là một công trình nghiên cứu hệ thống, đóng góp nguồn tư liệu học thuật quan trọng cho chuyên ngành Hóa lý thuyết và Hóa lý tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Luận án nghiên cứu một trong những phản ứng quan trọng trong cơ thể sống: phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym acetylcholinesterase. Phản ứng đƣợc mô phỏng bằng các phƣơng pháp hóa tin để làm rõ những yếu tố xác định hoạt tính của enzym. Lý do lựa chọn đề tài Ngày nay, cùng với sự hoàn thiện của các phƣơng pháp tính hóa lƣợng tử, sự xâm nhập của hóa học lý thuyết vào lĩnh vực xúc tác enzym cũng ngày càng phát triển. Nghiên cứu hệ xúc tác enzym để làm sáng tỏ bản chất hóa học của các phản ứng trong cơ thể sống đang đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm.

Một khi các phƣơng pháp lý thuyết thành công trong lĩnh vực này sẽ định hƣớng cho việc điều chỉnh, can thiệp vào các quá trình diễn ra trong cơ thể sống trƣớc khi thử nghiệm trực tiếp trên cơ thể, hạn chế đƣợc rủi ro, nguy hiểm. Đến nay, các phƣơng pháp lý thuyết nghiên cứu hệ xúc tác enzym đang trong quá trình hoàn thiện, vì vậy việc tiếp cận để cải tiến các phƣơng pháp này là một hƣớng phát triển đƣợc ƣu tiên vì nó sẽ tạo ra một bƣớc nhảy vọt trong hóa lý thuyết, đƣa lý thuyết tiến gần hơn đến thực nghiệm. Phản ứng hóa sinh giữ một vị trí rất quan trọng trong nghiên cứu khoa học cũng nhƣ trong ứng dụng thực tiễn, đặc biệt dạng phản ứng này xảy ra trong cơ thể sống. Khi hiểu đƣợc cơ chế của nó sẽ giúp con ngƣời biết cách điều chỉnh đƣợc hƣớng đi và diễn biến của quá trình phản ứng sao cho có lợi nhất.

Trong nhóm esterase, acetylcholinesterase là enzym có hoạt tính cao và tham gia trực tiếp vào quá trình truyền dẫn xung thần kinh với chức năng thủy phân chất dẫn truyền xung thần kinh acetylcholine [66, 69, 70]. Bằng thực nghiệm, tác giả Harry C. Froede và Irwin B. Wilson [27] đã sử dụng phƣơng pháp nguyên tử đánh dấu 3H để khảo sát cơ chế của phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác acetylcholinesterase và đề xuất cơ chế acetylenzym (xem chi tiết mục 1.

Với mong muốn góp phần làm sáng tỏ cơ chế đã đƣợc đề xuất từ thực nghiệm, tác giả sử dụng phƣơng 10 z pháp hóa tin trong đề tài "Góp phần nghiên cứu phản ứng thủy phân acetylcholine với xúc tác enzym acetylcholinesterase bằng phương pháp hóa tin". Mục đích của luận án Mục đích của luận án là tập trung làm sáng tỏ cơ chế xúc tác của một nhóm enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân - enzym esterase, cụ thể là enzym acetylcholinesterase bằng các phƣơng pháp hóa tin. - Nghiên cứu cơ chế giai đoạn acetyl hóa của phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác enzym ở cá đuối điện (Torpedo californica) và ở ngƣời (theo cơ chế acetylenzym) nhằm làm rõ các yếu tố quyết định hoạt tính xúc tác của enzym. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất ức chế acetylcholinesterase.

Đối tƣợng Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác là enzym acetylcholinesterase (thuộc nhóm esterase) ở hai loài là cá đuối điện và ngƣời. Tác giả lựa chọn acetylcholinesterase ở cá đuối điện là enzym có hoạt tính đặc biệt cao [66, 70] và acetylcholinesterase ở ngƣời để định hƣớng cho những nghiên cứu tiếp theo liên quan đến lĩnh vực hóa dƣợc. Phạm vi nghiên cứu Luận án sử dụng các phƣơng pháp hóa tin để làm rõ cơ chế phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác enzym, đồng thời nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất đến hoạt tính của enzym. Những chất này đã từng đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị các chứng bệnh liên quan đến rối loạn truyền dẫn xung thần kinh.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Về mặt khoa học: Những kết quả thu đƣợc từ các số liệu tính toán sẽ góp phần làm tăng thêm vốn hiểu biết về cơ chế của các phản ứng sinh học. - Về mặt thực tiễn: Những đặc điểm biến đổi về mặt cấu trúc và năng lƣợng phản ứng có thể gợi mở cho những ứng dụng mô phỏng sinh học và điều chỉnh, can thiệp vào các quá trình xảy ra trong cơ thể sinh vật. Những điểm mới của luận án 11 z - Trong luận án, tác giả đã sử dụng các phƣơng pháp hóa tin (DFT, QM/MM (DFT/AMBER), protein docking) để khảo sát chi tiết phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym ở cá đuối điện và ở ngƣời, phân tích, so sánh phản ứng ở hai trƣờng hợp kể trên để phân định vai trò của các yếu tố cấu trúc đối với hoạt tính của enzym và chỉ rõ quá trình tạo phức với enzym đã hình thành. Trong hai trƣờng hợp có sự khác nhau về năng lƣợng và sự biến đổi cấu trúc chi tiết trong quá trình phản ứng, tuy nhiên, vai trò tƣơng đồng của một số amino axit nhƣ Ser, His, Trp cũng đƣợc thể hiện rõ ràng.

- Đánh giá sơ bộ ảnh hƣởng của một số chất ức chế đến phản ứng bằng kĩ thuật protein docking và phƣơng pháp QM/MM. Kết quả cho thấy rằng 6 chất đƣợc khảo sát đều có khả năng neo đậu tại hốc phản ứng để thực hiện chức năng ức chế của mình. - Từ các số liệu thu đƣợc bằng các phƣơng pháp hóa tin đã làm rõ hơn cơ chế đề xuất từ thực nghiệm. Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu Esterase là nhóm enzym xúc tác cho quá trình thủy phân nhóm chức este.

Acetylcholinesterase là enzym thuộc nhóm esterase, xúc tác cho quá trình thủy phân acetylcholine. Công thức cấu tạo vắn tắt của acetylcholine: Acetylcholine là một trong số các chất dẫn truyền xung thần kinh trong hệ thần kinh tự chủ. Nó hoạt động trong cả hệ thần kinh ngoại biên và hệ thần kinh trung ƣơng. Sau khi tác động vào các thụ thể để truyền tín hiệu, acetylcholine bị thủy phân dƣới tác dụng xúc tác của acetylcholinesterase thành axit acetic và choline để tín hiệu không bị chồng lấn.

Sau đó choline sẽ đƣợc quay vòng để chuyển lại thành acetylcholine [96]. Cấu trúc Acetylcholinesterase ở các loài khác nhau có cấu trúc khác nhau. Luận án nghiên cứu enzym ở cá đuối điện (Torpedo californica) và ở ngƣời. a) Cấu trúc bậc 1: (Xem kí hiệu các amino axit trong Phụ lục 1.

Kí hiệu các amino axit). Cá đuối điện [81, 109]: MNLLVTSSLG VLLHLVVLCQ ADDHSELLVN TKSGKVMGTR VPVLSSHISA FLGIPFAEPP 70 80 90 100 110 120 VGNMRFRRPE PKKPWSGVWN ASTYPNNCQQ YVDEQFPGFS GSEMWNPNRE MSEDCLYLNI 130 140 150 160 170 180 13 z WVPSPRPKST TVMVWIYGGG FYSGSSTLDV YNGKYLAYTE EVVLVSLSYR VGAFGFLALH 190 200 210 220 230 240 GSQEAPGNVG LLDQRMALQW VHDNIQFFGG DPKTVTIFGE SAGGASVGMH ILSPGSRDLF 250 260 270 280 290 300 RRAILQSGSP NCPWASVSVA EGRRRAVELG RNLNCNLNSD EELIHCLREK KPQELIDVEW 310 320 330 340 350 360 NVLPFDSIFR FSFVPVIDGE FFPTSLESML NSGNFKKTQI LLGVNKDEGS FFLLYGAPGF 370 380 390 400 410 420 SKDSESKISR EDFMSGVKLS VPHANDLGLD AVTLQYTDWM DDNNGIKNRD GLDDIVGDHN 430 440 450 460 470 480 VICPLMHFVN KYTKFGNGTY LYFFNHRASN LVWPEWMGVI HGYEIEFVFG LPLVKELNYT 490 500 510 520 530 540 AEEEALSRRI MHYWATFAKT GNPNEPHSQE SKWPLFTTKE QKFIDLNTEP MKVHQRLRVQ 550 560 570 580 MCVFWNQFLP KLLNATACDG ELSSSGTSSS KGIIFYVLFS ILYLIF Trong chuỗi các amino axit trên, 21 amino axit đầu tiên là đoạn peptit tín hiệu, mang thông tin điều khiển việc chuyển vận của phân tử protein đến vị trí thực hiện chức năng. Sau khi protein tới vị trí đích, các amino axit này sẽ bị tách ra. 22 amino axit cuối cùng là đoạn peptit tiền hoạt hóa.

Protein chỉ thực hiện chức năng khi phần này đƣợc tách bỏ. Nhƣ vậy, ở trạng thái hoạt hóa, phân tử enzym acetylcholinesterase ở cá đuối điện gồm 543 amino axit (phần in đậm). So sánh cấu trúc bậc 1 của enzym acetylcholinesterase ở hai loài ta thấy không giống nhau cả về số lƣợng amino axit và trình tự sắp xếp. Tuy nhiên, enzym ở cả hai loài đều có tâm xúc tác là bộ ba amino axit (Ser, His, Glu).

b) Cấu trúc bậc 2: Cá đuối điện [34]: Cấu trúc bậc hai của acetylcholinesterase ở cá đuối điện đƣợc thể hiện trên hình 1. Cấu trúc bậc 2 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện [34] 16 z Ngƣời [34]: Cấu trúc bậc hai của acetylcholinesterase ở ngƣời đƣợc thể hiện trên hình 1. Cấu trúc bậc 2 của acetylcholinesterase ở ngƣời [34] 18 z Cấu trúc bậc 2 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện và ở ngƣời có sự tƣơng đồng về trật tự các đoạn xoắn , gấp , các cầu nối sunfua. c) Cấu trúc bậc 3: Trong cả hai trƣờng hợp ở cá đuối điện và ở ngƣời, phân tử enzym acetylcholinesterase cuộn xoắn tạo thành một hốc sâu với tâm xúc tác Ser nằm ở đáy hốc (hình 1.

Vị trí tâm xúc tác trên phân tử acetylcholinesterase Cấu trúc bậc 3 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện và ở ngƣời còn thể hiện sự tƣơng đồng các amino axit bao quanh tâm xúc tác (các amino axit này đƣợc thể hiện bằng nét đậm trên hình 1.5, tâm xúc tác Ser đƣợc thể hiện bằng mô hình quả cầu). Cấu trúc bậc 3 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện 20 z Hình 1. Cấu trúc bậc 3 của acetylcholinesterase ở ngƣời Trên hình 1.5, tâm xúc tác Ser đƣợc thể hiện bằng mô hình quả cầu – thanh nối, một số amino axit tƣơng đồng đƣợc thể hiện bằng nét đậm. Trong cấu trúc enzym ở cả hai loài, tâm xúc tác nằm ở đáy hốc phản ứng đƣợc bao quanh bởi nhiều amino axit có các nhánh là vòng thơm.

d) Cấu trúc bậc 4: Cấu trúc bậc 4 của acetylcholinesterase có thể gồm 1, 2, 4, 8, 12 đơn vị cấu trúc bậc 3 và các thành phần khác nhƣ glycolipid. Tuy vậy, hoạt tính xúc tác của mỗi đơn vị acetylcholinesterase trong các dạng cấu trúc này tƣơng đƣơng nhau [66]. Do đó, trong luận án này enzym đƣợc mô phỏng ở dạng monome. Cơ chế phản ứng xúc tác enzym Do chức năng sinh học của acetylcholinesterase trong việc truyền xung thần kinh nên nó cần phải có hoạt tính xúc tác đặc biệt cao, hệ số chu chuyển của nó cỡ 103 – 104 s-1, tốc độ gần với giới hạn khuếch tán [6, 17, 85].

Cũng nhƣ các enzym khác, acetylcholinesterase có tính chọn lọc cao, cơ chất của nó là acetylcholine. Enzym này cũng dễ bị ức chế bởi nhiều chất khác nhau, ngay cả khi nồng độ cơ chất acetylcholine quá lớn nó cũng bị ức chế. Việc nghiên cứu chi tiết về enzym này 21 z không chỉ nhằm làm rõ cơ chế tác động của nó lên phản ứng mà còn có thể tìm đƣợc các chất ức chế hoạt tính của nó. Chất ức chế sẽ có tác dụng ngăn chặn quá trình thủy phân acetylcholine làm tăng cƣờng độ tín hiệu của xung thần kinh.

Để giải thích tính chất chọn lọc của phản ứng xúc tác enzym, Fischer đề xuất mô hình chìa khóa - ổ khóa, theo đó, cơ chất và enzym có hình dạng đặc thù phù hợp với nhau [43]. Mô hình này chỉ giải thích tính chọn lọc của xúc tác enzym trên cơ sở sự tƣơng hợp cứng nhắc về mặt hình học, không giải thích đƣợc hoạt tính cao của enzym.