MỞ ĐẦU Luận án nghiên cứu một trong những phản ứng quan trọng trong cơ thể sống: phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym acetylcholinesterase. Phản ứng đƣợc mô phỏng bằng các phƣơng pháp hóa tin để làm rõ những yếu tố xác định hoạt tính của enzym. Lý do lựa chọn đề tài Ngày nay, cùng với sự hoàn thiện của các phƣơng pháp tính hóa lƣợng tử, sự xâm nhập của hóa học lý thuyết vào lĩnh vực xúc tác enzym cũng ngày càng phát triển. Nghiên cứu hệ xúc tác enzym để làm sáng tỏ bản chất hóa học của các phản ứng trong cơ thể sống đang đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm.
Một khi các phƣơng pháp lý thuyết thành công trong lĩnh vực này sẽ định hƣớng cho việc điều chỉnh, can thiệp vào các quá trình diễn ra trong cơ thể sống trƣớc khi thử nghiệm trực tiếp trên cơ thể, hạn chế đƣợc rủi ro, nguy hiểm. Đến nay, các phƣơng pháp lý thuyết nghiên cứu hệ xúc tác enzym đang trong quá trình hoàn thiện, vì vậy việc tiếp cận để cải tiến các phƣơng pháp này là một hƣớng phát triển đƣợc ƣu tiên vì nó sẽ tạo ra một bƣớc nhảy vọt trong hóa lý thuyết, đƣa lý thuyết tiến gần hơn đến thực nghiệm. Phản ứng hóa sinh giữ một vị trí rất quan trọng trong nghiên cứu khoa học cũng nhƣ trong ứng dụng thực tiễn, đặc biệt dạng phản ứng này xảy ra trong cơ thể sống. Khi hiểu đƣợc cơ chế của nó sẽ giúp con ngƣời biết cách điều chỉnh đƣợc hƣớng đi và diễn biến của quá trình phản ứng sao cho có lợi nhất.
Trong nhóm esterase, acetylcholinesterase là enzym có hoạt tính cao và tham gia trực tiếp vào quá trình truyền dẫn xung thần kinh với chức năng thủy phân chất dẫn truyền xung thần kinh acetylcholine [66, 69, 70]. Bằng thực nghiệm, tác giả Harry C. Froede và Irwin B. Wilson [27] đã sử dụng phƣơng pháp nguyên tử đánh dấu 3H để khảo sát cơ chế của phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác acetylcholinesterase và đề xuất cơ chế acetylenzym (xem chi tiết mục 1.
Với mong muốn góp phần làm sáng tỏ cơ chế đã đƣợc đề xuất từ thực nghiệm, tác giả sử dụng phƣơng 10 z pháp hóa tin trong đề tài "Góp phần nghiên cứu phản ứng thủy phân acetylcholine với xúc tác enzym acetylcholinesterase bằng phương pháp hóa tin". Mục đích của luận án Mục đích của luận án là tập trung làm sáng tỏ cơ chế xúc tác của một nhóm enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân - enzym esterase, cụ thể là enzym acetylcholinesterase bằng các phƣơng pháp hóa tin. - Nghiên cứu cơ chế giai đoạn acetyl hóa của phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác enzym ở cá đuối điện (Torpedo californica) và ở ngƣời (theo cơ chế acetylenzym) nhằm làm rõ các yếu tố quyết định hoạt tính xúc tác của enzym. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất ức chế acetylcholinesterase.
Đối tƣợng Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác là enzym acetylcholinesterase (thuộc nhóm esterase) ở hai loài là cá đuối điện và ngƣời. Tác giả lựa chọn acetylcholinesterase ở cá đuối điện là enzym có hoạt tính đặc biệt cao [66, 70] và acetylcholinesterase ở ngƣời để định hƣớng cho những nghiên cứu tiếp theo liên quan đến lĩnh vực hóa dƣợc. Phạm vi nghiên cứu Luận án sử dụng các phƣơng pháp hóa tin để làm rõ cơ chế phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác enzym, đồng thời nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất đến hoạt tính của enzym. Những chất này đã từng đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị các chứng bệnh liên quan đến rối loạn truyền dẫn xung thần kinh.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Về mặt khoa học: Những kết quả thu đƣợc từ các số liệu tính toán sẽ góp phần làm tăng thêm vốn hiểu biết về cơ chế của các phản ứng sinh học. - Về mặt thực tiễn: Những đặc điểm biến đổi về mặt cấu trúc và năng lƣợng phản ứng có thể gợi mở cho những ứng dụng mô phỏng sinh học và điều chỉnh, can thiệp vào các quá trình xảy ra trong cơ thể sinh vật. Những điểm mới của luận án 11 z - Trong luận án, tác giả đã sử dụng các phƣơng pháp hóa tin (DFT, QM/MM (DFT/AMBER), protein docking) để khảo sát chi tiết phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym ở cá đuối điện và ở ngƣời, phân tích, so sánh phản ứng ở hai trƣờng hợp kể trên để phân định vai trò của các yếu tố cấu trúc đối với hoạt tính của enzym và chỉ rõ quá trình tạo phức với enzym đã hình thành. Trong hai trƣờng hợp có sự khác nhau về năng lƣợng và sự biến đổi cấu trúc chi tiết trong quá trình phản ứng, tuy nhiên, vai trò tƣơng đồng của một số amino axit nhƣ Ser, His, Trp cũng đƣợc thể hiện rõ ràng.
- Đánh giá sơ bộ ảnh hƣởng của một số chất ức chế đến phản ứng bằng kĩ thuật protein docking và phƣơng pháp QM/MM. Kết quả cho thấy rằng 6 chất đƣợc khảo sát đều có khả năng neo đậu tại hốc phản ứng để thực hiện chức năng ức chế của mình. - Từ các số liệu thu đƣợc bằng các phƣơng pháp hóa tin đã làm rõ hơn cơ chế đề xuất từ thực nghiệm. Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu Esterase là nhóm enzym xúc tác cho quá trình thủy phân nhóm chức este.
Acetylcholinesterase là enzym thuộc nhóm esterase, xúc tác cho quá trình thủy phân acetylcholine. Công thức cấu tạo vắn tắt của acetylcholine: Acetylcholine là một trong số các chất dẫn truyền xung thần kinh trong hệ thần kinh tự chủ. Nó hoạt động trong cả hệ thần kinh ngoại biên và hệ thần kinh trung ƣơng. Sau khi tác động vào các thụ thể để truyền tín hiệu, acetylcholine bị thủy phân dƣới tác dụng xúc tác của acetylcholinesterase thành axit acetic và choline để tín hiệu không bị chồng lấn.
Sau đó choline sẽ đƣợc quay vòng để chuyển lại thành acetylcholine [96]. Cấu trúc Acetylcholinesterase ở các loài khác nhau có cấu trúc khác nhau. Luận án nghiên cứu enzym ở cá đuối điện (Torpedo californica) và ở ngƣời. a) Cấu trúc bậc 1: (Xem kí hiệu các amino axit trong Phụ lục 1.
Kí hiệu các amino axit). Cá đuối điện [81, 109]: MNLLVTSSLG VLLHLVVLCQ ADDHSELLVN TKSGKVMGTR VPVLSSHISA FLGIPFAEPP 70 80 90 100 110 120 VGNMRFRRPE PKKPWSGVWN ASTYPNNCQQ YVDEQFPGFS GSEMWNPNRE MSEDCLYLNI 130 140 150 160 170 180 13 z WVPSPRPKST TVMVWIYGGG FYSGSSTLDV YNGKYLAYTE EVVLVSLSYR VGAFGFLALH 190 200 210 220 230 240 GSQEAPGNVG LLDQRMALQW VHDNIQFFGG DPKTVTIFGE SAGGASVGMH ILSPGSRDLF 250 260 270 280 290 300 RRAILQSGSP NCPWASVSVA EGRRRAVELG RNLNCNLNSD EELIHCLREK KPQELIDVEW 310 320 330 340 350 360 NVLPFDSIFR FSFVPVIDGE FFPTSLESML NSGNFKKTQI LLGVNKDEGS FFLLYGAPGF 370 380 390 400 410 420 SKDSESKISR EDFMSGVKLS VPHANDLGLD AVTLQYTDWM DDNNGIKNRD GLDDIVGDHN 430 440 450 460 470 480 VICPLMHFVN KYTKFGNGTY LYFFNHRASN LVWPEWMGVI HGYEIEFVFG LPLVKELNYT 490 500 510 520 530 540 AEEEALSRRI MHYWATFAKT GNPNEPHSQE SKWPLFTTKE QKFIDLNTEP MKVHQRLRVQ 550 560 570 580 MCVFWNQFLP KLLNATACDG ELSSSGTSSS KGIIFYVLFS ILYLIF Trong chuỗi các amino axit trên, 21 amino axit đầu tiên là đoạn peptit tín hiệu, mang thông tin điều khiển việc chuyển vận của phân tử protein đến vị trí thực hiện chức năng. Sau khi protein tới vị trí đích, các amino axit này sẽ bị tách ra. 22 amino axit cuối cùng là đoạn peptit tiền hoạt hóa.
Protein chỉ thực hiện chức năng khi phần này đƣợc tách bỏ. Nhƣ vậy, ở trạng thái hoạt hóa, phân tử enzym acetylcholinesterase ở cá đuối điện gồm 543 amino axit (phần in đậm). So sánh cấu trúc bậc 1 của enzym acetylcholinesterase ở hai loài ta thấy không giống nhau cả về số lƣợng amino axit và trình tự sắp xếp. Tuy nhiên, enzym ở cả hai loài đều có tâm xúc tác là bộ ba amino axit (Ser, His, Glu).
b) Cấu trúc bậc 2: Cá đuối điện [34]: Cấu trúc bậc hai của acetylcholinesterase ở cá đuối điện đƣợc thể hiện trên hình 1. Cấu trúc bậc 2 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện [34] 16 z Ngƣời [34]: Cấu trúc bậc hai của acetylcholinesterase ở ngƣời đƣợc thể hiện trên hình 1. Cấu trúc bậc 2 của acetylcholinesterase ở ngƣời [34] 18 z Cấu trúc bậc 2 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện và ở ngƣời có sự tƣơng đồng về trật tự các đoạn xoắn , gấp , các cầu nối sunfua. c) Cấu trúc bậc 3: Trong cả hai trƣờng hợp ở cá đuối điện và ở ngƣời, phân tử enzym acetylcholinesterase cuộn xoắn tạo thành một hốc sâu với tâm xúc tác Ser nằm ở đáy hốc (hình 1.
Vị trí tâm xúc tác trên phân tử acetylcholinesterase Cấu trúc bậc 3 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện và ở ngƣời còn thể hiện sự tƣơng đồng các amino axit bao quanh tâm xúc tác (các amino axit này đƣợc thể hiện bằng nét đậm trên hình 1.5, tâm xúc tác Ser đƣợc thể hiện bằng mô hình quả cầu). Cấu trúc bậc 3 của acetylcholinesterase ở cá đuối điện 20 z Hình 1. Cấu trúc bậc 3 của acetylcholinesterase ở ngƣời Trên hình 1.5, tâm xúc tác Ser đƣợc thể hiện bằng mô hình quả cầu – thanh nối, một số amino axit tƣơng đồng đƣợc thể hiện bằng nét đậm. Trong cấu trúc enzym ở cả hai loài, tâm xúc tác nằm ở đáy hốc phản ứng đƣợc bao quanh bởi nhiều amino axit có các nhánh là vòng thơm.
d) Cấu trúc bậc 4: Cấu trúc bậc 4 của acetylcholinesterase có thể gồm 1, 2, 4, 8, 12 đơn vị cấu trúc bậc 3 và các thành phần khác nhƣ glycolipid. Tuy vậy, hoạt tính xúc tác của mỗi đơn vị acetylcholinesterase trong các dạng cấu trúc này tƣơng đƣơng nhau [66]. Do đó, trong luận án này enzym đƣợc mô phỏng ở dạng monome. Cơ chế phản ứng xúc tác enzym Do chức năng sinh học của acetylcholinesterase trong việc truyền xung thần kinh nên nó cần phải có hoạt tính xúc tác đặc biệt cao, hệ số chu chuyển của nó cỡ 103 – 104 s-1, tốc độ gần với giới hạn khuếch tán [6, 17, 85].
Cũng nhƣ các enzym khác, acetylcholinesterase có tính chọn lọc cao, cơ chất của nó là acetylcholine. Enzym này cũng dễ bị ức chế bởi nhiều chất khác nhau, ngay cả khi nồng độ cơ chất acetylcholine quá lớn nó cũng bị ức chế. Việc nghiên cứu chi tiết về enzym này 21 z không chỉ nhằm làm rõ cơ chế tác động của nó lên phản ứng mà còn có thể tìm đƣợc các chất ức chế hoạt tính của nó. Chất ức chế sẽ có tác dụng ngăn chặn quá trình thủy phân acetylcholine làm tăng cƣờng độ tín hiệu của xung thần kinh.
Để giải thích tính chất chọn lọc của phản ứng xúc tác enzym, Fischer đề xuất mô hình chìa khóa - ổ khóa, theo đó, cơ chất và enzym có hình dạng đặc thù phù hợp với nhau [43]. Mô hình này chỉ giải thích tính chọn lọc của xúc tác enzym trên cơ sở sự tƣơng hợp cứng nhắc về mặt hình học, không giải thích đƣợc hoạt tính cao của enzym.