Xây Dựng Bộ Kit Định Lượng PCR HBV Để Phát Hiện Virus Viêm Gan B

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu hus xây dựng bộ kit định lượng pcr hbv qpcr để phát hiện virus viêm gan b hbv, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Nguyễn Quang Duy
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
• Đề tài: Xây dựng Bộ Kit Định Lượng PCR HBV (QPCR) Để Phát Hiện Virus Viêm Gan B (HBV)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về Hepatitis B Virus
• 1.2. Cấu trúc HBV
• 1.3. Cơ chế xâm nhiễm của HBV
• 1.4. Dịch tễ học của viêm gan B
• 1.5. Tình hình mắc viêm gan B trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.6. Phương thức lây truyền
• 1.7. Các giai đoạn nhiễm HBV
• 1.8. Các phương pháp chuẩn đoán nhiễm HBV
• 1.8.1. Kĩ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology)
• 1.8.2. Kĩ thuật lai bắt giữ (Hybrid capture technology)
• 1.8.3. PCR cạnh tranh định lượng (Quantitative-competitive PCR)
• 1.8.4. Real-time PCR
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế thí nghiệm
• 2.2. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Hóa chất và sinh phẩm
• 2.5. Trang thiết bị
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp PCR và phương pháp real-time PCR
• 2.6.2. Phương pháp điện di
• 2.6.3. Phương pháp ligate
• 2.6.4. Phương pháp xác định nồng độ DNA
• 2.6.5. Cắt và tinh sạch plasmid sau khi cắt
• 2.6.6. Phương pháp pha loãng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tách dòng plasmid mang đoạn gen P của HBV
• 3.2. Tạo mẫu chuẩn HBV
• 3.3. Tạo DNA nội chuẩn
• 3.4. Thiết kế đoạn IC
• 3.5. Tách dòng IC
• 3.6. Chuẩn hóa điều kiện phát hiện HBV và IC
• 3.7. Tối ưu thành phần và điều kiện phản ứng
• 3.8. Khảo sát độ giới hạn phát hiện HBV
• 3.9. Tối ưu hóa nồng độ plasmid IC phối trộn với plasmid HBV
• 3.10. Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR
• 3.11. Xây dựng đường chuẩn định lượng HBV và xác định giới hạn phát hiện HBV trong real-time PCR
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Bộ Kit Định Lượng PCR HBV Phát Hiện Virus Viêm Gan B

Bộ Kit Định Lượng PCR HBV là một công cụ quan trọng trong việc phát hiện virus viêm gan B (HBV). Viêm gan B là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến và nguy hiểm nhất trên thế giới. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, khoảng 257 triệu người mắc bệnh viêm gan B mãn tính. Bộ kit này giúp xác định tải lượng virus trong huyết thanh, từ đó hỗ trợ trong việc theo dõi và điều trị bệnh nhân. Việc phát hiện sớm và chính xác virus HBV là rất cần thiết để ngăn chặn các biến chứng nghiêm trọng như xơ gan và ung thư gan.

1.1. Virus Viêm Gan B Đặc điểm và Tác động

Virus viêm gan B (HBV) thuộc họ Hepadnaviridae, có cấu trúc DNA và gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng. Tình hình mắc viêm gan B ở Việt Nam rất cao, với khoảng 8,6 triệu người nhiễm. Việc phát hiện sớm virus HBV giúp giảm thiểu nguy cơ tử vong do các biến chứng của bệnh.

1.2. Tầm quan trọng của Bộ Kit Định Lượng PCR HBV

Bộ Kit Định Lượng PCR HBV cho phép xác định chính xác tải lượng virus trong cơ thể bệnh nhân. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Việc sử dụng bộ kit này không chỉ tiết kiệm chi phí mà còn nâng cao hiệu quả điều trị.

II. Thách thức trong việc Phát Hiện Virus Viêm Gan B

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện virus viêm gan B, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc chẩn đoán chính xác. Các bộ kit thương mại hiện tại thường có giá thành cao và không phải lúc nào cũng sẵn có. Điều này gây khó khăn cho việc tiếp cận xét nghiệm cho nhiều bệnh nhân, đặc biệt là ở các vùng nông thôn. Hơn nữa, độ chính xác của các phương pháp hiện tại cũng cần được cải thiện để giảm thiểu tỷ lệ sai sót trong chẩn đoán.

2.1. Giá thành cao của các bộ kit thương mại

Nhiều bộ kit xét nghiệm hiện tại đều nhập khẩu và có giá thành cao, điều này làm hạn chế khả năng tiếp cận của bệnh nhân. Việc phát triển bộ kit nội địa với giá thành hợp lý là rất cần thiết.

2.2. Độ chính xác và độ nhạy của các phương pháp hiện tại

Độ chính xác của các phương pháp phát hiện virus viêm gan B cần được cải thiện. Các nghiên cứu cho thấy rằng một số phương pháp có thể cho kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả, ảnh hưởng đến quá trình điều trị.

III. Phương pháp Xây dựng Bộ Kit Định Lượng PCR HBV Hiệu Quả

Để phát triển bộ kit định lượng PCR HBV, cần thực hiện các bước nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình. Việc lựa chọn mồi và đầu dò phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Các điều kiện phản ứng PCR cũng cần được tối ưu hóa để đạt được kết quả tốt nhất. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các thành phần chất lượng cao và quy trình chuẩn hóa sẽ giúp nâng cao hiệu quả phát hiện virus HBV.

3.1. Thiết kế mồi và đầu dò cho PCR HBV

Việc thiết kế mồi và đầu dò cho PCR HBV cần dựa trên trình tự gen của virus. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng mồi và đầu dò có độ đặc hiệu cao sẽ giúp tăng cường độ nhạy của xét nghiệm.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR

Điều kiện phản ứng PCR như nhiệt độ, thời gian và nồng độ các thành phần cần được tối ưu hóa để đạt được kết quả chính xác nhất. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các yếu tố này có thể cải thiện đáng kể độ nhạy của bộ kit.

IV. Ứng dụng Thực tiễn của Bộ Kit Định Lượng PCR HBV

Bộ Kit Định Lượng PCR HBV không chỉ giúp phát hiện virus mà còn hỗ trợ trong việc theo dõi hiệu quả điều trị. Việc xác định tải lượng virus giúp bác sĩ điều chỉnh phác đồ điều trị kịp thời, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng bộ kit này đã giúp giảm tỷ lệ tử vong do các biến chứng của viêm gan B.

4.1. Theo dõi hiệu quả điều trị bệnh nhân nhiễm HBV

Bộ kit cho phép theo dõi tải lượng virus trong quá trình điều trị, giúp bác sĩ đánh giá hiệu quả của phác đồ điều trị. Việc này rất quan trọng để điều chỉnh kịp thời nếu cần thiết.

4.2. Giảm tỷ lệ tử vong do biến chứng viêm gan B

Sử dụng bộ kit định lượng PCR HBV đã giúp giảm tỷ lệ tử vong do các biến chứng như xơ gan và ung thư gan. Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời là rất quan trọng trong việc nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

V. Kết luận và Tương lai của Bộ Kit Định Lượng PCR HBV

Bộ Kit Định Lượng PCR HBV là một bước tiến quan trọng trong việc phát hiện và điều trị virus viêm gan B. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, bộ kit này hứa hẹn sẽ trở thành công cụ không thể thiếu trong việc quản lý bệnh viêm gan B. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển để cải thiện hơn nữa hiệu quả của bộ kit, đồng thời giảm giá thành để nhiều bệnh nhân có thể tiếp cận được.

5.1. Nghiên cứu và phát triển bộ kit trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit. Việc phát triển các công nghệ mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả phát hiện virus HBV.

5.2. Tăng cường khả năng tiếp cận cho bệnh nhân

Giảm giá thành và tăng cường khả năng tiếp cận bộ kit cho bệnh nhân là rất cần thiết. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm tỷ lệ tử vong do viêm gan B.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về Hepatitis B Virus 1. Cấu trúc HBV 1. Hình thái Virus viêm gan B là một loại virus hướng gan có vật chất di truyền là DNA thuộc họ Hepadnaviridae virus [4, 36].

Trong huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn virus đang tái bản, có thể quan sát thấy ba kiểu cấu trúc bao gồm: hình cầu, hình ống và hạt dane hoàn chỉnh [36]. Cấu trúc hình cầu có đường kính 20 nm. Cấu trúc hình ống có chiều rộng 22 nm và chiều dài thay đổi. Những dạng này được cấu tạo bởi kháng nguyên bề mặt (HBsAg) và lipit có nguồn gốc từ vật chủ, không chứa axit nucleic của virus do đó không có khả năng lây nhiễm [18].

Hạt dane có đường kính 42 nm gồm lớp vỏ lipid và HBsAg bao quanh một nucleocapsid chứa hệ gen của virus và polymerase sẽ giúp virus nhân lên trong cơ thể vật chủ [29].1: Hình ảnh dưới kính hiển vi tử và số lượng gần đúng của các thành phần liên quan đến HBV trong 1 ml huyết thanh bệnh nhân mang HBV mãn tính [19]. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Hệ gen Hệ gen của HBV là phân tử DNA dạng vòng chiều dài khoảng 3200 nucleotide (3.2 kb) có dạng xoắn kép không hoàn toàn gồm hai sợi đơn có chiều dài khác nhau. Sợi ngoài (sợi âm) có chiều dài cố định là 3.2 kb và gắn một gốc tyrosine của protein P tại đầu 5’.

Hệ gen của virus mã hóa cho 4 khung đọc mở (Open Reading Frames-ORF) là S, C, P và X nằm gối lên nhau [36]: - Khung đọc mở S mã hóa cho protein bề mặt virus (HBsAg) được chia thành 3 vùng preS1, preS2 và S nhờ ba codon khởi đầu khác nhau [48]. HBgAg được chia làm 3 loại: L-HBsAg là thành phần chính của thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1; protein M và S-HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA preS [13]. - Khung đọc mở C mã hóa cho kháng nguyên lõi (HBcAg) hoặc kháng nguyên e (HBeAg) hỗ trợ đóng gói cấu trúc genome tùy thuộc vào vị trí bắt đầu dịch mã. - Khung đọc mở X mã hóa cho protein HBxAg.

Protein HBx có vai trò trong nhân bản HBV bao gồm tín hiệu kích hoạt phiên mã, sửa chữa DNA và ức chế quá trình phân hủy protein [15]. - Khung đọc mở P mã hóa cho polymerase là một protein lớn được chia thành 4 domain: terminal protein domain (đóng vai trò như mồi tổng hợp DNA virus), spacer domain (chưa rõ vai trò), reverse transcriptase domain (chịu trách nhiệm cho phiên mã và nhân bản RNA virus) và RNAase H domain (phân hủy RNA tiền gen). Trong đó, RNA tiền gen đóng vai trò là khuôn tổng hợp DNA virus thông qua quá trình phiên mã ngược [29]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2: Cấu trúc hệ gen của HBV [44].

Cơ chế xâm nhiễm của HBV Quá trình xâm nhập của HBV vào tế bào gan của vật chủ được bắt đầu bằng tương tác không đặc hiệu giữa vùng preS1 của protein L-HBsAg với bề mặt tế bào gan hoặc đặc hiệu với thụ thể NTCP [54]. Sau khi xâm nhập vào tế bào, virus di chuyển nhờ hệ thống vi ống đến phức hệ màng nhân. Tại đây, virus sẽ bỏ lớp vỏ capsid giải phóng DNA vào trong nhân [31]. Trong nhân tế bào gan, DNA của sợi dương được tổng hợp hoàn chỉnh.

Sau đó, các sợi sẽ co xoắn lại cùng với protein histon tạo thành phân tử cccDNA (covalently closed circular DNA) có dạng nhiễm sắc thể mini, đóng vai trò phiên mã tổng hợp mRNA của virus [43]. Đoạn dài nhất 3.5 kb mã hóa protein lõi, tiền lõi và polymerase.4 kb mã hoá cho protein L- HBsAg, trong khi đoạn 2.1 kb mã hoá protein M và S-HBsAg. Đoạn nhỏ nhất 0.7 kb mã hoá protein X [39]. Cấu tạo bền vững của phân tử cccDNA tạo nên tính kháng thuốc của HBV.

Khi cccDNA còn ổn định ở trong tế bào, nó sẽ làm khuôn mẫu cho tất cả các mRNA virus. Do đó, cccDNA là nguồn tạo các thế hệ virus mới [13, 23]. Các mRNA được phiên mã từ cccDNA sẽ được vận chuyển ra bào tương, làm khuôn cho quá trình dịch mã tổng hợp polymerase, vỏ capsid, protein bề mặt và protein X. Trong khi nucleocapsid được lắp ráp trong bào tương, RNA tiền gen kết 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] hợp cùng polymerase khởi động quá trình phiên mã ngược.

RNA tiền gen đóng vài trò làm khuôn cho quá trình tổng hợp DNA sợi âm. Sau khi tổng hợp xong sợi âm, RNA tiền gen bị phân cắt bởi RNase. Sợi âm được sử dụng làm khuôn tổng hợp sợi dương. Quá trình tổng hợp sợi dương hiếm khi hoàn thành nên thường bắt gặp sợi dương có độ dài khác nhau trong virus HBV [13, 54].

Một số virus mang bộ gen hoàn chỉnh sẽ quay trở lại nhân tế bào gan và DNA mới được tổng hợp sẽ lại chuyển dạng cccDNA để duy trì một lượng khuôn ổn định cho quá trình phiên mã. Số virus còn lại sẽ đi vào hệ thống lưới nội chất chứa các protein bề mặt của virus thông qua hình thức “nảy chồi”. Bằng cách này các “lõi” virus sẽ bọc bởi các kháng nguyên bề mặt tạo ra cấu trúc virus hoàn chỉnh và thoát khỏi tế bào gan đi vào hệ thống tuần hoàn [17].3: Quá trình xâm nhiễm của HBV [17]. HBV gắn kết với thụ thể trên bề mặt và xâm nhập vào tế bào.

Sau đó, HBV di chuyển tới nhân và chuyển dạng thành cccDNA làm khuôn để tổng hợp mRNA; mRNA được dịch mã để tổng hợp protein bề mặt virus, lõi, polymerase và protein X; mRNA này tiếp tục tham gia vào quá trình phiên mã ngược thành DNA virus kết hợp với capsid tạo thành hạt virus, các hạt virus này hoặc di chuyển vào mạng lưới nội chất hoặc quay lại nhân tế bào gan. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phân loại Dựa vào cấu trúc hệ gen, HBV được chia làm nhiều kiểu gen (genotypes). Trước đây, có 8 genotypes đã được biết rõ (A-H).

Theo các nghiên cứu gần đây, 2 genotypes khác được xác định là I và J. Một vài genotypes của HBV được phân chia thành dưới kiểu gen (sub-genotypes). Trong phân loại, các genotype có trình tự khác nhau hơn 8%, các sub-genotype trong cùng một genotype khác nhau 4-8% [52]. Hiện nay, hơn 30 sub-genotype của HBV đã được xác định, nhưng các cơ chế gây bệnh khác nhau giữa chúng chưa được rõ ràng.

Có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự khác biệt giữa genotypes và sub-genotypes phụ thuộc vào phân bố địa lý và liên quan đến sự tiến triển của bệnh, tiến triển lâm sàng và khả năng đáp ứng điều trị [12]. Genotypes A, B, C, D và F được chia thành nhiều sub-genotype và genotypes E, G và H không có sub-genotype nào được xác định [28, 42]. Genotype A phổ biến ở vùng cận Sahara-Châu Phi, Bắc Âu và Tây Phi. Genotype B và C xuất hiện phổ biết ở Châu Á.

Genotype C chủ yếu quan sát thấy ở Đông Nam Á. Genotype D chiếm ưu thế ở Châu Phi, Châu Âu, các nước Địa Trung Hải và Ấn Độ. Genotype G được báo cáo ở Pháp, Đức và Hoa Kỳ. Genotype H thường gặp ở Trung và Nam Mỹ.

Genotype I gần đây được tìm thấy ở Việt Nam và Lào. Genotype HBV mới nhất là genotype J được xác định ở quần đảo Ryukyu của Nhật Bản [35]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.4: Phân bố địa lý về genotypes của HBV trên thế giới [35]. Các con số bên cạnh các biểu đồ hình tròn là số lượng mẫu kiểm tra.

Kích thước của biểu đồ hình tròn đã được điều chỉnh sao để hiển thị rõ các phần trong biểu đồ [34]. Các kiểu gen có thể liên quan đến một số thể đột biến trên khung đọc mở C. Do đó, chúng có thể dẫn đến sự khác nhau về diễn biến tiền lâm sàng cũng như về tỷ lệ viêm gan tối cấp giữa các nhóm kiểu gen khác nhau. Ví dụ: kiểu gen B và đặc biệt dưới kiểu gen Bj khiến người bệnh dễ mắc viêm gan tối cấp nhiều hơn so với kiểu gen A hoặc C [10].

Dịch tễ học của viêm gan B 1. Tình hình mắc viêm gan B trên thế giới và ở Việt Nam Dựa vào sự có mặt của kháng nguyên bề mặt HBsAg, tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính trong năm 2015 trên toàn thế giới có khoảng 257 triệu người đang bị nhiễm HBV và khoảng 887,000 ca tử vong do HBV, chủ yếu từ các biến chứng bao gồm xơ gan và ung thư gan [58]. Dựa trên tỉ lệ nhiễm HBV, các vùng trên thế giới được xếp vào các mức độ nhiễm cao, trung bình và thấp (Hình 1. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.5: Phân bố tỷ lệ người nhiễm HBV theo địa lý [57].

Vùng lưu hành dịch cao: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg ≥8% và người đã từng phơi nhiễm với HBV >60%. Khoảng 45% dân số thế giới sống ở khu vực dịch tễ này, bao gồm các nước Châu Á, Châu Phi, một phần Trung Đông, lưu vực sông Amazon [45]. Vùng lưu hành dịch trung bình: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg từ 2-7% và tỷ lệ người đã từng phơi nhiễm với HBV từ 20-60%, bao gồm một phần Nam Âu, Đông Âu, Nga và Nam-Trung Mỹ [47]. Vùng lưu hành dịch thấp: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg <2% và tỷ lệ người từng phơi nhiễm với HBV <20%, bao gồm Mỹ, Tây Âu, Úc với khoảng 12% dân số thế giới sống ở vùng này [58].

Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc viêm gan B cao trong đó ước tính có khoảng 8,6 triệu người nhiễm HBV. Tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính được ước tính khoảng 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở nam giới. Người nhiễm HBV mãn tính thường không có các biểu hiện rõ ràng làm người bệnh thường có tâm lý chủ quan. Do đó, ở Việt Nam, nhiễm HBV mãn tính là nguyên nhân chính gây xơ gan và ung thư gan.

8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phương thức lây truyền HBV lây truyền khi các tổn thương trên bề mặt da và niêm mạc tiếp xúc với dịch tiết hoặc máu của người đã nhiễm virus. HBV có hàm lượng lớn trong máu và dịch tiết từ vết thương. Lượng virus được phát hiện thấp hơn trong tinh dịch, dịch tiết âm đạo và có rất ít trong nước bọt.

HBV không lây truyền qua không khí và đồ ăn [57]. Các con đường lây truyền chính của virus như sau: - Lây truyền từ mẹ sang con có thể xảy ra quanh lúc chuyển dạ sinh. Lây truyền trong tử cung ít gặp, chỉ xảy ra từ 2-5% số lây truyền từ mẹ sang con. Không có bằng chứng cho thấy virus có thể lây truyền qua việc cho con bú.