Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học determine the presence of enteroinvasive e coli and enterohemorrhagic e coli in swiftlet houses using multiplex pcr technique

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học determine the presence of enteroinvasive e coli and enterohemorrhagic, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Le Thanh Binh
• Người hướng dẫn: Dr. Dinh Xuan Phat
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Xác định sự hiện diện của E. coli gây bệnh trong nhà nuôi chim Yến bằng kỹ thuật PCR đa mồi
• Loại tài liệu: graduation thesis
• Năm xuất bản: 2018 - 2022
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• CONFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• 1. CHAPTER 1: INTRODUCTION
• 1.1. Objectives of the research
• 1.2. Researching contents
• 1.3. Escherichia coli
• 1.4. Taxonomy
• 2. CHAPTER 2: BASIC BIOLOGICAL AND GENOMIC CHARACTERISTICS OF ESCHERICHIA COLI
• 2.1. Basic biological characteristics of Escherichia coli
• 2.2. Basic genomic characteristics of Escherichia coli
• 2.3. Diarrheagenic Escherichia coli
• 2.4. Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)
• 2.4.1. Virulence factors, mechanisms and pathogenesis of EHEC
• 2.4.2. Treatment and clinical diagnosis of EHEC
• 2.5. Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC)
• 2.5.1. Virulence factors, mechanisms, and pathogenesis of EIEC
• 2.5.2. Treatment and clinical diagnosis of EIEC infections
• 2.6. Polymerase Chain Reaction (PCR)
• 2.7. Reagents for PCR reaction
• 2.8. Steps of the PCR
• 3. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODOLOGY
• 3.1. Time and location of the research
• 3.2. Materials of the research
• 3.3. Controls and field samples
• 3.4. Chemicals and Equipment
• 3.5. Isolation of Escherichia coli from swiftlet house environment samples
• 3.6. Bacterial DNA extraction from Escherichia coli colonies
• 3.7. DNA extraction using WizPrepTM Viral DNA/RNA Mini Kit V2
• 3.8. Optimization of the annealing temperatures for the multiplex PCR
• 3.9. Optimization for the annealing temperature for the simplex PCR
• 3.10. Optimization of the annealing temperature of the multiplex PCR
• 3.11. Optimization of the primer concentration for the multiplex PCR
• 3.12. Evaluation of the specificity of the multiplex PCR
• 3.13. Determination of detection limit of the multiplex PCR assay
• 3.14. Application of the established multiplex PCR assay on field samples
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Results of the isolation of Escherichia coli from swiftlet house environment samples
• 4.2. Optimization of the mPCR assay for identification of EIEC and EHEC
• 4.2.1. Optimization of annealing temperature of the multiplex PCR assay
• 4.2.2. Optimization of primer concentration for the multiplex PCR reaction
• 4.2.3. Evaluation of the specificity of the multiplex PCR
• 4.2.4. Determination for limit of detection (LOD) of the multiplex PCR
• 4.3. Application of the established multiplex PCR assay for field samples
• 4.4. Discussion
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS
• APPENDIX
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng quan về xác định E

Nghiên cứu về sự hiện diện của E. coli gây bệnh trong nhà nuôi chim Yến là một vấn đề quan trọng trong ngành chăn nuôi. E. coli là một loại vi khuẩn có thể gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng cho cả người và động vật. Việc phát hiện sớm sự hiện diện của E. coli trong môi trường nuôi chim Yến giúp đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng. Kỹ thuật PCR đa mồi đã được áp dụng để xác định chính xác các chủng vi khuẩn này.

1.1. Định nghĩa và vai trò của E. coli trong môi trường nuôi chim

E. coli là một loại vi khuẩn gram âm, thường sống trong ruột của động vật có vú. Một số chủng của E. coli có thể gây bệnh cho người và động vật, đặc biệt là trong môi trường nuôi chim Yến. Việc hiểu rõ về vai trò của E. coli trong hệ sinh thái nuôi chim là rất cần thiết.

1.2. Tầm quan trọng của việc phát hiện E. coli trong nhà nuôi chim

Phát hiện sớm sự hiện diện của E. coli trong nhà nuôi chim giúp ngăn ngừa sự lây lan của bệnh tật. Điều này không chỉ bảo vệ sức khỏe của chim mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

II. Vấn đề và thách thức trong việc phát hiện E

Việc phát hiện E. coli trong môi trường nuôi chim Yến gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như điều kiện môi trường, phương pháp lấy mẫu và phân tích có thể ảnh hưởng đến kết quả. Sự đa dạng của các chủng E. coli cũng làm cho việc phát hiện trở nên phức tạp hơn. Do đó, cần có các phương pháp chính xác và hiệu quả để xác định sự hiện diện của chúng.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến việc phát hiện E. coli

Điều kiện môi trường như độ ẩm, nhiệt độ và vệ sinh trong nhà nuôi chim có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của E. coli. Việc lấy mẫu không đúng cách cũng có thể dẫn đến kết quả sai lệch.

2.2. Sự đa dạng của các chủng E. coli và ảnh hưởng đến kết quả

Có nhiều chủng E. coli khác nhau, mỗi chủng có khả năng gây bệnh khác nhau. Việc xác định chính xác chủng nào có mặt trong mẫu là rất quan trọng để đưa ra biện pháp xử lý phù hợp.

III. Phương pháp PCR đa mồi trong phát hiện E

Kỹ thuật PCR đa mồi là một phương pháp hiệu quả để phát hiện sự hiện diện của E. coli trong mẫu môi trường. Phương pháp này cho phép xác định nhiều gen độc lực cùng một lúc, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Quy trình này bao gồm các bước như lấy mẫu, chiết xuất DNA và thực hiện phản ứng PCR.

3.1. Quy trình thực hiện PCR đa mồi

Quy trình thực hiện PCR đa mồi bao gồm các bước như chuẩn bị mẫu, chiết xuất DNA và thực hiện phản ứng PCR với các mồi đặc hiệu cho từng gen độc lực của E. coli.

3.2. Lợi ích của việc sử dụng PCR đa mồi

Sử dụng PCR đa mồi giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của E. coli trong môi trường nuôi chim. Phương pháp này cũng giúp giảm thiểu thời gian và chi phí so với các phương pháp truyền thống.

IV. Kết quả nghiên cứu về sự hiện diện của E

Nghiên cứu đã thu thập 90 mẫu từ các nhà nuôi chim Yến và thực hiện phân tích bằng kỹ thuật PCR đa mồi. Kết quả cho thấy 57.78% mẫu dương tính với E. coli, cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn này trong môi trường nuôi chim. Tuy nhiên, không phát hiện được các gen độc lực của E. coli gây bệnh trong các mẫu này.

4.1. Tỷ lệ mẫu dương tính với E. coli

Kết quả cho thấy 52/90 mẫu (57.78%) dương tính với E. coli, tất cả đều là mẫu phân. Điều này cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong môi trường nuôi chim Yến.

4.2. Phân tích gen độc lực của E. coli

Mặc dù có sự hiện diện của E. coli, nhưng không phát hiện được các gen độc lực như stx2, escV và ipaH trong các mẫu. Điều này cho thấy không có sự hiện diện của các chủng E. coli gây bệnh trong môi trường này.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu E

Nghiên cứu đã thành công trong việc xác định sự hiện diện của E. coli trong nhà nuôi chim Yến bằng kỹ thuật PCR đa mồi. Kết quả cho thấy cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về sự phát triển và lây lan của E. coli trong môi trường nuôi chim. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh do E. coli gây ra.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát hiện các chủng E. coli gây bệnh và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng trong môi trường nuôi chim.

5.2. Ứng dụng của kết quả nghiên cứu trong thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để cải thiện quy trình nuôi chim Yến, đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành chăn nuôi và khai thác tổ yến (yến sào) giữ vai trò ngày càng quan trọng trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp Việt Nam, với sản lượng ước tính đạt khoảng 120 tấn/năm, tương đương giá trị thương mại xấp xỉ 450 triệu USD (khoảng 10.000 tỷ VNĐ). Tuy nhiên, sự phát triển nhanh chóng cùng tình trạng xây dựng nhà yến tự phát tại khu vực Đông Nam Bộ đang đặt ra nhiều thách thức lớn về quản lý môi trường và an toàn sinh học. Do chim yến có tập tính sống và tìm kiếm thức ăn tương tự các loài chim hoang dã, chúng có nguy cơ cao trở thành vật chủ lưu trữ và phát tán các vi sinh vật gây bệnh sang các khu dân cư và các trang trại chăn nuôi lân cận.

Trong số các tác nhân vi khuẩn đường ruột, nhóm Escherichia coli gây tiêu chảy (Diarrheagenic E. coli - DEC) là mối quan ngại hàng đầu đối với sức khỏe cộng đồng và ngành thú y. Nhóm DEC gồm 7 kiểu hình gây bệnh chính:

• E. coli gây xuất huyết ruột (Enterohemorrhagic E. coli - EHEC)
• E. coli sinh độc tố Shiga (Shiga toxin-producing E. coli - STEC)
• E. coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic E. coli - EPEC)
• E. coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic E. coli - ETEC)
• E. coli ngưng kết ruột (Enteroaggregative E. coli - EAEC)
• E. coli xâm nhập ruột (Enteroinvasive E. coli - EIEC)
• E. coli bám dính khuếch tán (Diffusely-adherent E. coli - DAEC)

Trong đó, hai chủng EIEC và EHEC đặc biệt nguy hiểm do khả năng gây ra các bệnh lý nghiêm trọng như kiết lỵ, viêm đại tràng xuất huyết và hội chứng tán huyết ure huyết cao (Hemolytic Uremic Syndrome - HUS) có thể đe dọa tính mạng con người. Nhằm hỗ trợ công tác chẩn đoán nhanh và đánh giá nguy cơ dịch tễ học, đề tài "Xác định sự hiện diện của Enteroinvasive E. coli (EIEC) và Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) trong nhà nuôi chim Yến bằng kỹ thuật Multiplex Polymerase Chain Reaction" đã được thực hiện.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của nghiên cứu là phân lập thành công vi khuẩn E. coli từ các mẫu môi trường nhà yến và thiết lập quy trình kỹ thuật Multiplex PCR (mPCR) nhằm xác định sự hiện diện của hai kiểu hình gây bệnh EIEC và EHEC.

Nhiệm vụ nghiên cứu được phân chia thành 3 nội dung chính:

1. Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Escherichia coli từ các mẫu môi trường thu nhận tại các nhà nuôi chim yến.
2. Nội dung 2: Thiết lập và tối ưu hóa quy trình mPCR phát hiện EIEC và EHEC, bao gồm:
   • Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) của phản ứng mPCR.
   • Tối ưu hóa nồng độ mồi trong phản ứng mPCR.
   • Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình mPCR.
   • Xác định giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD) của quy trình mPCR.
3. Nội dung 3: Ứng dụng quy trình mPCR đã thiết lập để khảo sát sự hiện diện của EIEC và EHEC trên các mẫu thực địa thu thập từ nhà nuôi chim yến.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn Escherichia coli, hệ gen vi sinh vật và các gen độc lực mục tiêu (stx2, escV, ipaH).
• Phạm vi không gian: Thu thập 90 mẫu thực địa (gồm 67 mẫu phân gộp và 23 mẫu phết bề mặt tổ yến) tại 30 nhà nuôi chim yến thuộc 3 tỉnh/thành phố: Bình Dương, Đồng Nai và Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu thực hiện từ tháng 11/2021 đến tháng 09/2022, chia làm 2 giai đoạn:
  • Giai đoạn 1 (11/2021 - 04/2022): Phân lập vi sinh vật tại Phòng thí nghiệm Chẩn đoán Thú y Biomin (Chi nhánh Biomin Việt Nam tại Bình Dương, Tập đoàn DSM).
  • Giai đoạn 2 (04/2022 - 09/2022): Thực hiện nghiên cứu sinh học phân tử tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen BIO313, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi thuộc họ Enterobacteriaceae. Bộ gen chuẩn của chủng E. coli K-12 MG1655 có kích thước 4,6 Mb, trong khi các chủng mang độc lực thường có kích thước lớn hơn khoảng 1 Mb do tiếp nhận các yếu tố độc lực qua con đường chuyển gen ngang (horizontal gene transfer).

• Kiểu hình EHEC: Được định danh dựa trên sự đồng hiện diện của hai yếu tố độc lực:
  • Gen stx2 (mã hóa độc tố Shiga nhóm 2 - Stx2): Độc tố cấu trúc $AB_5$ ức chế tổng hợp protein tế bào chủ thông qua việc loại bỏ gốc adenine khỏi tiểu phần 28S rRNA của ribosome 60S, gắn vào thụ thể globotriaosylceramide ($Gb_3$) gây tổn thương tế bào nội mô mạch máu và suy thận cấp.
  • Gen escV (nằm trên đảo sinh bệnh Locus of Enterocyte Effacement - LEE): Mã hóa cho cấu trúc phức hợp tiết loại III (T3SS injectisome), chịu trách nhiệm hình thành tổn thương bám dính và xóa mờ (Attaching and Effacing - AE lesions) trên tế bào biểu mô ruột.
• Kiểu hình EIEC: Mang đặc tính xâm nhập và phá hủy tế bào biểu mô đại tràng tương tự Shigella spp. Quá trình xâm nhập và lây lan nội bào phụ thuộc vào hệ thống tiết T3SS mã hóa trên plasmid độc lực inv (220 kb) và gen kháng nguyên bề mặt plasmid xâm nhập ipaH (Invasion plasmid antigen H), phân bố trên cả plasmid và nhiễm sắc thể.

Phương pháp nghiên cứu

                  [ 90 Mẫu thực địa (67 phân, 23 phết tổ) ]
 [ Phân lập vi sinh (TCVN 8400-16:2011) ]            [ Tách chiết tổng DNA ]
             [ Quy trình Multiplex PCR tối ưu (stx2, escV, ipaH) ]
              [ Điện di gel Agarose 1,5% & Đọc kết quả dưới tia UV ]

1. Phương pháp phân lập và định danh vi sinh: Dựa trên tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-16:2011 có hiệu chỉnh. Mẫu được phục hồi trong môi trường nước Peptone đệm (Buffered Peptone Water - BPW) ở 37°C trong 3–4 giờ, sau đó cấy ria trên thạch MacConkey, CNA và thạch máu Columbia Blood Agar. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra hình thái qua nhuộm Methylene blue, nhuộm Gram (phương pháp KOH) và kiểm tra các phản ứng sinh hóa: Catalase (+), Indole (+), Oxidase (-), Urease (-).
2. Phương pháp tách chiết DNA:
   • DNA từ khuẩn lạc vi khuẩn thuần: Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt đun sôi (Boiling method) ở 95–100°C trong 10 phút.
   • DNA tổng số từ dịch huyền phù mẫu và tinh sạch DNA từ gel agarose: Sử dụng bộ kit thương mại WizPrep™ Viral DNA/RNA Mini Kit V2.
3. Thiết kế và thông số mồi PCR:

Cặp mồi	Trình tự mồi ($5' \rightarrow 3'$)	Gen mục tiêu	Kích thước sản phẩm (bp)	Nguồn tham khảo
stx2F stx2R	TTAACCACACCCCACCGGGCAGT GCTCGGATGCATCTCTGGT	stx2 (EHEC/STEC)	346	Vendruscolo et al.
escVF escVR	TAACGCCTGCGCGCATATCACC GTTGATGCGCCTGTCGCTAGT	escV (EHEC/EPEC)	266	Vendruscolo et al.
IpaIII IpaIV	GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC	ipaH (EIEC/Shigella)	619	Sethabutr et al. (1993)

4. Chủng đối chứng:
   • Đối chứng dương: DNA hệ gen của EIEC (chứa ipaH), STEC (chứa stx2), EPEC (chứa escV) do Viện Pasteur TP.HCM cung cấp.
   • Đối chứng âm và kiểm tra đặc hiệu: Staphylococcus spp., Clostridium perfringens, Streptococcus spp. (cung cấp bởi Lab Biomin) và các chủng DEC khác gồm EAEC, ETEC, DAEC; đối chứng không có mẫu thử (Nuclease-free water).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu (Introduction)

Chương 1 thiết lập tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ sự bùng nổ của nghề nuôi chim yến tại miền Nam Việt Nam. Tác giả chỉ ra lỗ hổng trong việc kiểm soát vệ sinh dịch tễ môi trường nhà yến và nguy cơ tiềm ẩn từ các vi khuẩn đường ruột nguy hiểm như EHEC và EIEC. Mục tiêu tổng quát và 3 nội dung nghiên cứu cụ thể được định hình nhằm giải quyết vấn đề chẩn đoán phân tử vi sinh vật trong môi trường này.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Literature Review)

Chương này tổng hợp chi tiết các kiến thức khoa học nền tảng về:

• Sinh học và hệ gen của E. coli, cơ chế phân loại huyết thanh học (kháng nguyên O, H, K) và phân nhóm phát sinh loài (phylogenetic groups A, B1, B2, C, D, E, F, clade I theo Clermont).
• Phân loại 7 nhóm E. coli gây tiêu chảy (DEC) và mức độ nguy hiểm đối với người và gia súc.
• Cơ chế sinh bệnh học chi tiết của EHEC: Sự tiết độc tố Shiga gây ức chế tổng hợp protein và tổn thương tế bào nội mô cầu thận dẫn đến HUS; vai trò của đảo sinh bệnh LEE và các operon từ LEE1 đến LEE5 trong việc hình thành cấu trúc injectisome T3SS.
• Cơ chế bệnh sinh của EIEC: Quá trình chuyển dịch qua tế bào M ở mảng Peyer, thoát khỏi thực bào đại thực bào nhờ gây chết tế bào theo cơ chế pyroptosis, xâm nhập bề mặt đáy biểu mô ruột và hiện tượng trùng hợp actin tạo đuôi đẩy vi khuẩn lan truyền sang các tế bào lân cận.
• Nguyên lý kỹ thuật PCR, thành phần phản ứng, chu trình nhiệt và các thách thức kỹ thuật khi thiết lập phản ứng Multiplex PCR (tương tác giữa các cặp mồi, cạnh tranh tài nguyên phản ứng, hiện tượng tạo primer dimer).

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Materials and Methodology)

Trình bày chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm:

• Địa điểm, nguồn gốc 90 mẫu thực địa và phương pháp thu gom mẫu đại diện theo tầng nhà yến (mẫu phân gộp 5 điểm và mẫu phết bề mặt tổ bằng tăm bông vô trùng).
• Danh mục hóa chất, sinh phẩm (DreamTaq Green PCR Master Mix 2X, thang chuẩn 1 Kb Plus DNA Ladder, chất nhuộm Midori Green Advance) và trang thiết bị (máy luân nhiệt GeneQ Thermal Cycler, máy đo quang phổ BioDrop µLITE).
• Quy trình phân lập vi sinh vật chuẩn hóa theo TCVN 8400-16:2011 kết hợp các thử nghiệm sinh hóa khẳng định.
• Quy trình tối ưu hóa mPCR từng bước: khảo sát gradient nhiệt độ bắt cặp ($52^\circ\text{C} - 64^\circ\text{C}$), khảo sát nồng độ mồi theo các tỉ lệ thể tích khác nhau, đánh giá độ đặc hiệu chéo trên 5 loài vi khuẩn và các chủng DEC khác, xác định LOD qua dải pha loãng nồng độ DNA mục tiêu từ $1\text{ ng/}\mu\text{L}$ đến $10^{-9}\text{ ng/}\mu\text{L}$.

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được kèm hình ảnh điện di minh chứng:

1. Kết quả phân lập vi khuẩn:

   • 52/90 mẫu (57,78%) dương tính với E. coli sống.
   • Toàn bộ 52 mẫu dương tính đều là mẫu phân (đạt tỷ lệ 77,61% trên tổng số 67 mẫu phân).
   • 23/23 mẫu phết bề mặt tổ yến đều âm tính với việc phân lập vi khuẩn E. coli sống (0,00%).

2. Kết quả tối ưu hóa quy trình mPCR:

   • Nhiệt độ bắt cặp ($T_a$): Khảo sát từ 52°C đến 64°C cho thấy phản ứng đơn (sPCR) và đa mồi (mPCR) đều khuếch đại tốt 3 vạch kích thước 266 bp (escV), 346 bp (stx2) và 619 bp (ipaH). Nhiệt độ $T_a = 60^\circ\text{C}$ được lựa chọn là tối ưu nhất vì cho vạch sản phẩm sắc nét, đồng thời hạn chế tối đa hiện tượng tạo primer dimer (khoảng 100 bp).
   • Chu trình nhiệt tối ưu: Tiền biến tính ở 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳ gồm biến tính 95°C (30 giây), bắt cặp 60°C (40 giây), kéo dài 72°C (40 giây); kéo dài cuối ở 72°C trong 5 phút.
   • Nồng độ mồi tối ưu: Nồng độ cuối của cả 3 cặp mồi trong phản ứng là $0,2\ \mu\text{M}$ (tương ứng tỉ lệ mồi escV : stx2 : ipaH là 1:1:1), đảm bảo các vạch khuếch đại đồng đều.
   • Độ đặc hiệu: Phản ứng mPCR không khuếch đại bất kỳ vạch nào với DNA của Staphylococcus spp., Clostridium perfringens, ETEC, EAEC và DAEC. Chỉ tạo 1 vạch escV (266 bp) với EPEC và 1 vạch stx2 (346 bp) với STEC, khẳng định tính đặc hiệu tuyệt đối cho việc nhận diện gen đích.
   • Giới hạn phát hiện (LOD): Thử nghiệm lặp lại 3 lần cho kết quả thống nhất, LOD của quy trình mPCR đạt mức $10^{-7}\text{ ng/}\mu\text{L}$ (tương đương $0,1\text{ fg/}\mu\text{L}$) DNA mục tiêu cho mỗi phản ứng.

3. Ứng dụng khảo sát trên mẫu thực địa:

   • Trên 52 mẫu DNA khuẩn lạc E. coli phân lập: Tỷ lệ mang gen stx2 là 1/52 (1,92%), escV là 13/52 (25,00%), ipaH là 0/52 (0,00%). Mẫu dương tính với stx2 không mang gen escV.
   • Trên 90 mẫu tổng DNA tách trực tiếp từ môi trường: Tỷ lệ dương tính với stx2, escV và ipaH lần lượt là 1/90 (1,11%), 19/90 (21,11%) và 0/90 (0,00%).

4. Thảo luận: Tác giả so sánh tỷ lệ phân lập vi khuẩn E. coli từ phân chim yến (77,61%) với các nghiên cứu trên chim hoang dã của Yuan et al. (2021) tại Trung Quốc (40,0%) và Ong et al. (2020) tại Singapore (57,1%). Việc không tìm thấy E. coli sống trên tổ yến phù hợp với công bố của Razak (2016) tại Malaysia (tỷ lệ trên tổ rất thấp, chỉ 3,33%). Sự hiện diện của gen stx2 cho thấy sự lưu hành của chủng STEC, cảnh báo nguy cơ chuyển giao gen độc lực trong môi trường nhà yến. Việc phát hiện gen escV trên 26,09% mẫu tổ yến chỉ ra sự tồn tại của dấu vết DNA từ các chủng vi khuẩn bám dính (như EPEC) dù tế bào vi khuẩn có thể không còn sống.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị (Conclusion and Recommendations)

Tóm tắt các thông số kỹ thuật đã thiết lập thành công của quy trình mPCR và các kết luận dịch tễ học rút ra từ 90 mẫu thực địa. Đồng thời đề xuất kiến nghị ứng dụng quy trình mPCR vào kiểm tra giám sát định kỳ tại các cơ sở nuôi chim yến trên diện rộng.

---

Kết quả và đóng góp của khóa luận

Bảng tổng hợp kết quả phân lập và phát hiện gen độc lực

Chỉ tiêu khảo sát	Mẫu phân ($N_1 = 67$)	Mẫu phết bề mặt tổ ($N_2 = 23$)	Tổng số mẫu ($N = 90$)
Số mẫu phân lập được E. coli sống	52 (77,61%)	0 (0,00%)	52 (57,78%)
Số mẫu dương tính với gen stx2	1 (1,49%)	0 (0,00%)	1 (1,11%)
Số mẫu dương tính với gen escV	13 (19,40%)	6 (26,09%)	19 (21,11%)
Số mẫu dương tính với gen ipaH	0 (0,00%)	0 (0,00%)	0 (0,00%)
Tỷ lệ xác định được EHEC (stx2 + escV)	0 (0,00%)	0 (0,00%)	0 (0,00%)
Tỷ lệ xác định được EIEC (ipaH)	0 (0,00%)	0 (0,00%)	0 (0,00%)

Đóng góp khoa học và thực tiễn

1. Đóng góp về mặt phương pháp: Thiết lập và tối ưu hóa thành công một quy trình Multiplex PCR 3 cặp mồi hoàn chỉnh, có độ nhạy cao (LOD đạt $0,1\text{ fg/}\mu\text{L}$ DNA khuôn) và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện đồng thời 3 gen độc lực stx2, escV và ipaH trong cùng một giếng phản ứng, tiết kiệm thời gian và chi phí so với kỹ thuật PCR đơn lẻ.
2. Đóng góp về mặt dữ liệu dịch tễ: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về sự hiện diện của vi khuẩn E. coli và các gen độc lực đường ruột trong môi trường nhà nuôi chim yến tại khu vực phía Nam Việt Nam (Bình Dương, Đồng Nai, TP.HCM).
3. Ý nghĩa an toàn sinh học: Chứng minh tổ yến thương phẩm có mức độ an toàn vi sinh cao đối với E. coli sống (tỷ lệ nhiễm 0%), đồng thời chỉ ra sự hiện diện của gen stx2 (chủng STEC) và gen escV (chủng aEPEC/EPEC) trong phân chim yến, đặt ra yêu cầu kiểm soát an toàn sinh học cho người nuôi và cộng đồng xung quanh.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

• Hạn chế:
  • Quy mô mẫu dừng lại ở 90 mẫu tại 3 tỉnh thành phía Nam, chưa bao quát toàn bộ các vùng trọng điểm nuôi chim yến khác trên cả nước (như Duyên hải Nam Trung Bộ hay Tây Nguyên).
  • Nghiên cứu tập trung vào 2 kiểu hình EHEC và EIEC nên chưa giải trình tự và xác định đầy đủ các kiểu hình DEC khác khi phát hiện các gen đơn lẻ như escV (liên quan đến EPEC) hay stx2 (liên quan đến STEC).
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Ứng dụng quy trình mPCR để mở rộng khảo sát trên quy mô mẫu lớn hơn và đa dạng hơn về mặt địa lý.
  • Thiết lập thêm các quy trình chẩn đoán phân tử mở rộng nhằm giám sát các chủng E. coli gây bệnh khác (EPEC, ETEC, EAEC) cũng như các mầm bệnh đường ruột quan trọng khác như Salmonella spp. và Clostridium perfringens trong môi trường nhà yến.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Thú y và Y tế Công cộng: Tham khảo chi tiết các bước thực hành tối ưu hóa phản ứng Multiplex PCR (từ nồng độ mồi, gradient nhiệt độ, kiểm tra chéo độ đặc hiệu đến phương pháp xác định LOD bằng phương pháp đo quang và pha loãng bậc 10).
• Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm vi sinh - phân tử: Cung cấp thông số chu trình nhiệt và nồng độ hóa chất cụ thể để áp dụng chẩn đoán trực tiếp các gen stx2, escV, ipaH.
• Nhà quản lý nông nghiệp và người nuôi chim yến: Cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá thực trạng vệ sinh nhà yến, khẳng định chất lượng an toàn vi sinh vật của tổ yến đối với E. coli và xây dựng quy trình thu gom phân yến an toàn sinh học.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Dấu hiệu di truyền nào được sử dụng để xác định kiểu hình EHEC và EIEC trong khóa luận?

Trong nghiên cứu này, kiểu hình EIEC được định danh khi mẫu dương tính với gen ipaH (kích thước amplicon 619 bp). Kiểu hình EHEC được định danh khi mẫu có sự đồng hiện diện (co-detection) của cả hai gen độc lực: gen độc tố stx2 (kích thước amplicon 346 bp) và gen đảo sinh bệnh escV (kích thước amplicon 266 bp).

2. Điều kiện chu trình nhiệt và nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng Multiplex PCR là gì?

• Nồng độ mồi tối ưu: Nồng độ cuối của cả 3 cặp mồi escV, stx2, ipaH trong phản ứng là $0,2\ \mu\text{M}$ (tỉ lệ thể tích 1:1:1).
• Chu trình nhiệt tối ưu: Tiền biến tính ở 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳ gồm biến tính 95°C (30 giây), bắt cặp ($T_a$) 60°C (40 giây), kéo dài 72°C (40 giây); giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 5 phút.

3. Giới hạn phát hiện (LOD) của quy trình Multiplex PCR được xác định là bao nhiêu?

Quy trình mPCR đạt giới hạn phát hiện là $10^{-7}\text{ ng/}\mu\text{L}$ (tương đương $0,1\text{ fg/}\mu\text{L}$) DNA mục tiêu cho mỗi phản ứng, được kiểm chứng qua 3 lần lặp lại độc lập.

4. Kết quả khảo sát 90 mẫu môi trường nhà yến thực tế cho thấy điều gì về sự hiện diện của EHEC và EIEC?

Kết quả khảo sát trên 90 mẫu thực địa (67 mẫu phân, 23 mẫu phết tổ) cho thấy không có mẫu nào dương tính với EIEC (tỷ lệ gen ipaH là 0%) và không có mẫu nào dương tính đồng thời với cả hai gen stx2 và escV (tỷ lệ EHEC là 0%). Tuy nhiên, nghiên cứu phát hiện sự hiện diện đơn lẻ của gen stx2 (1,11% - cảnh báo sự xuất hiện của STEC) và gen escV (21,11% - cảnh báo sự xuất hiện của EPEC/aEPEC).

5. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn E. coli sống trên mẫu phân và mẫu phết bề mặt tổ yến có sự khác biệt như thế nào?

Có sự khác biệt rõ rệt: Tỷ lệ phân lập được E. coli sống từ mẫu phân đạt 77,61% (52/67 mẫu), trong khi 100% mẫu phết bề mặt tổ yến (23/23 mẫu) đều âm tính với việc phân lập E. coli sống (0,00%).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thanh Bình đã thiết lập thành công quy trình Multiplex PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện đồng thời các gen độc lực stx2, escV và ipaH. Mặc dù không phát hiện thấy hai chủng vi khuẩn nguy hiểm EHEC và EIEC trong 90 mẫu khảo sát tại Bình Dương, Đồng Nai và TP.HCM, nghiên cứu đã ghi nhận sự lưu hành của các gen độc lực stx2 và escV trong môi trường nhà yến. Đồng thời, kết quả âm tính với E. coli sống trên toàn bộ các mẫu tổ yến cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng khẳng định chất lượng vệ sinh an toàn sinh học cho sản phẩm yến sào Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES DETERMINE THE PRESENCE OF ENTEROINVASIVE E. coli AND ENTEROHEMORRHAGIC E. coli INSWIFTLET HOUSES USING MULTIPLEX PCR TECHNIQUE Major : BIOTECHNOLOGY Student : LE THANH BINH Student code : 18126011 Academic year : 2018 — 2022 Thu Duc City, March 2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS DETERMINE THE PRESENCE OF ENTEROINVASIVE E. coli AND ENTEROHEMORRHAGIC E.

coli INSWIFTLET HOUSES USING MULTIPLEX PCR TECHNIQUE Advisor Student Dr. DINH XUAN PHAT LE THANH BINH March 2023 ACKNOWLEDGEMENTS I would like to express my sincere gratitude towards the Board of Nong Lam University Ho Chi Minh City and the Board of Faculty of Biological Sciences for creating the most favorable conditions for me to finish this study. In addition, I also want to thank Biomin Veterinary Diagnostics Laboratory, Branch of Biomin Vietnam in Binh Duong (belonging to DSM Group) for providing me the facilities to conduct this research. I am genuine grateful to my advisor Dr.

Dinh Xuan Phat, who has kindly taught and guided me during the period of my thesis. It would be impossible for the study to be completed if it hadn’t been the help of all people who has accompanied with me during this hard time. And for that, I want to send thanks to Ms. Cao Tran Quynh Nhu, Ms.

Nguyen Thi Mi Mi, Mr. Hoang Gia Lam, Ms. Do Thi Trinh, Ms. Tran Ngoc Thao Nguyen, Ms.

Nguyen Thi Thanh Trang and other members of Gene Technology Laboratory BIO313 for helping me to reach my goals. And last but not least, I want to honor my family for giving me all the strength to overcome the challenges along the way. You are the reason why I could go this far, and I promise that I will try harder to become successful and make you proud. CONFIRMATION AND COMMITMENT My name is Le Thanh Binh, Class: DH18SM, Student ID: 18126011.

I guarantee that this research was conducted by myself and that the results presented are utterly truthful and objective. This study was a part of the research “Isolation and molecular identification of potentially pathogenic Escherichia coli, Salmonella, and Clostridium perfrigens on swiftlet house environments in Southern Vietnam”. I will take all responsibilities before the Council for these commitments. Thu Duc City, March 2023 Student’s signature il ABSTRACT The purpose of this study was to construct a multiplex PCR (mPCR) assay to determine the presence of enteroinvasive E.

coli (EIEC) and enterohemorrhagic FE. coli (EHEC) in swiftlet houses in Southern Vietnam. Ninety field samples including 67 fecal samples and 23 nest surface swab samples were collected from swiftlet houses in Binh Duong, Dong Nai, and Ho Chi Minh City. These samples were used for E.

coli isolation and molecular identification through a mPCR assay detecting the virulence genes s/x2 and escV for identification of EHEC and the ipaH gene for identification of EIEC. After optimization, the mPCR functioned well with the thermal conditions as follows: initial denaturation stage at 95°C for 5 minutes; then 35 cycles, each of which consists of denaturation step at 95°C for 30 seconds, annealing step at 60°C for 40 seconds, elongation step at 72°C for 40 seconds; and the final elongation stage at 72°C for 5 minutes. The primer concentration of escV:stx2:ipaH = 0.2uM was chosen to perform the mPCR assays. The limit of detection was determined to be 0.1 fg/uL for each DNA target template per reaction.

At first, the results showed that 52/90 (57.78%) samples collected from swiftlet houses were positive for isolation of E. coli, all of which were feces. The established mPCR assay showed the presence ofvirulence genes with detection rates of 1.11% and 0% (0/90) for the s/x2, escV and ipaH genes, respectively. The mPCR did not detect the escV gene in the stx2-positive E.

coli sample, which indicated that EHEC as well as EIEC was not identified in the collected samples. The study has successfully established a mPCR assay to determine the presence of EHEC and EJEC and provided evidence for the presence of pathogenic E. coli in swiftlet farms.