Luận văn thạc sĩ hus xác định salbutamol clenbuterol và ractopamine trong thức ăn chăn nuôi nước tiểu lợn và sản phẩm từ thịt

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xác định salbutamol, clenbuterol và ractopamine trong thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn và sản phẩm thịt.

• Tác giả: Vũ Quốc Hưng
• Người hướng dẫn: PGS. Tạ Thị Thảo
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác định Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine trong Thức Ăn Chăn Nuôi, Nước Tiểu Lợn và Sản Phẩm Thịt
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: Giới thiệu về hoocmon tăng trưởng β2-agonist
• 1.1. β2-agonist là gì?
• 1.2. Tác dụng của β2-agonist
• 1.3. Phân loại β2-agonist
• 1.4. Giới thiệu về Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine
• 1.4.1. Thông tin chung
• 1.4.2. Tính chất và tác dụng của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine
• 1.4.2.1. Tác dụng làm giãn phế quản

Tóm tắt

I. Tổng quan về xác định Salbutamol Clenbuterol và Ractopamine

Việc xác định các chất cấm như Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm thịt là rất quan trọng. Những chất này thuộc nhóm β2-agonist, được sử dụng để tăng trưởng động vật nhưng có thể gây hại cho sức khỏe con người. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về các phương pháp xác định và tác động của chúng.

1.1. Tại sao cần xác định Salbutamol Clenbuterol và Ractopamine

Việc phát hiện các chất này trong thực phẩm là cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm. Các chất này có thể gây ra nhiều tác hại cho sức khỏe con người, bao gồm các vấn đề về tim mạch và hệ hô hấp.

1.2. Tình hình sử dụng các chất cấm trong chăn nuôi

Sự gia tăng sử dụng Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine trong chăn nuôi đã dẫn đến nhiều vấn đề về an toàn thực phẩm. Các cơ quan chức năng đã phát hiện nhiều mẫu thịt và nước tiểu dương tính với các chất này, cho thấy sự cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ hơn.

II. Vấn đề và thách thức trong việc xác định chất cấm

Việc xác định Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine gặp nhiều thách thức. Các phương pháp hiện tại cần phải được tối ưu hóa để đảm bảo độ chính xác và độ nhạy cao. Thách thức lớn nhất là sự hiện diện của các chất khác trong mẫu có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích

Nồng độ của các chất cấm trong mẫu, cũng như sự hiện diện của các chất khác có thể làm giảm độ chính xác của phương pháp phân tích. Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất và phân tích là rất cần thiết.

2.2. Khó khăn trong việc kiểm soát chất lượng thực phẩm

Việc kiểm soát chất lượng thực phẩm trong chăn nuôi là một thách thức lớn. Các cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi thường không tuân thủ quy định, dẫn đến việc sử dụng các chất cấm một cách trái phép.

III. Phương pháp xác định Salbutamol Clenbuterol và Ractopamine

Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để xác định Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine. Phương pháp này cho phép phát hiện các chất này với độ nhạy và độ chính xác cao.

3.1. Giới thiệu về phương pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ, cho phép phân tích nhanh chóng và chính xác các chất cấm trong mẫu thực phẩm. Phương pháp này đã được chứng minh là hiệu quả trong nhiều nghiên cứu.

3.2. Quy trình thực hiện phân tích

Quy trình phân tích bao gồm các bước chiết xuất, làm sạch mẫu và phân tích bằng LC-MS/MS. Mỗi bước đều cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ chính xác cao nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp LC-MS/MS có thể phát hiện Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine trong mẫu thức ăn chăn nuôi và sản phẩm thịt với độ nhạy cao. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm.

4.1. Kết quả phân tích mẫu thực phẩm

Nghiên cứu đã tiến hành phân tích nhiều mẫu thực phẩm và phát hiện một số mẫu dương tính với các chất cấm. Điều này cho thấy sự cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ hơn trong ngành chăn nuôi.

4.2. Ứng dụng trong kiểm soát an toàn thực phẩm

Phương pháp xác định này có thể được áp dụng rộng rãi trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm, giúp bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đảm bảo chất lượng thực phẩm.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu

Việc xác định Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm thịt là rất cần thiết. Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng phương pháp LC-MS/MS là một công cụ hiệu quả trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp phân tích mới và cải tiến quy trình hiện tại để nâng cao độ nhạy và độ chính xác.

5.2. Khuyến nghị cho ngành chăn nuôi

Ngành chăn nuôi cần tuân thủ các quy định về an toàn thực phẩm và hạn chế việc sử dụng các chất cấm. Việc giáo dục và nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi là rất quan trọng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thực trạng lạm dụng chất cấm thuộc nhóm $\beta_2$-agonist trong ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam từng diễn biến hết sức phức tạp, đe dọa trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Thống kê của các cơ quan chức năng trong 10 tháng đầu năm 2015 tại khu vực phía Nam cho thấy tỷ lệ mẫu nước tiểu lợn dương tính với Salbutamol ở mức báo động: Đồng Nai ghi nhận 109/654 mẫu (chiếm 16,7%), Thành phố Hồ Chí Minh có 95/516 mẫu (chiếm 18,4%) và Tiền Giang có 35/525 mẫu (chiếm 6,7%). Đáng chú ý, nồng độ Salbutamol trong nhiều mẫu nước tiểu vượt ngưỡng 200 ppb, cá biệt có trường hợp lên tới 665 ppb. Nghiêm trọng hơn, trong hơn 9 tấn Salbutamol được cấp phép nhập khẩu phục vụ ngành dược năm 2015, có tới hơn 6 tấn bị thất thoát và sử dụng sai mục đích trong chăn nuôi.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm đặt ra là các hợp chất $\beta_2$-agonist (gồm Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine) có khả năng tích lũy bền nhiệt trong mô cơ thịt, không bị phân hủy ở nhiệt độ nấu nướng trên 100°C, dễ dẫn đến ngộ độc cấp và mãn tính như rối loạn nhịp tim, co thắt phế quản, run cơ và tăng huyết áp. Luận văn hướng tới mục tiêu xây dựng, tối ưu hóa và thẩm định quy trình phân tích đồng thời 3 hợp chất này trên 3 nền mẫu phức tạp: thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn và sản phẩm thịt bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS) kết hợp chiết pha rắn (SPE).

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm trên các mẫu thu thập tại địa bàn trọng điểm như Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên và Vĩnh Phúc. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi cung cấp một công cụ phân tích có độ nhạy siêu vết, độ chọn lọc cao, đáp ứng nghiêm ngặt các ngưỡng quy chuẩn kỹ thuật tại Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT và phục vụ đắc lực cho công tác giám định tư pháp, xử lý tội phạm vi phạm quy định về an toàn thực phẩm theo Điều 317 Bộ luật Hình sự năm 2015 với khung hình phạt tiền từ 50 đến 200 triệu đồng hoặc phạt tù lên đến 20 năm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết dược lý học phân tử và hóa phân tích hiện đại:

• Cơ chế tác động sinh hóa của nhóm $\beta_2$-agonist: Các dẫn xuất phenethanolamin liên kết đặc hiệu với thụ thể $\beta_2$-adrenergic trên màng tế bào, kích hoạt hệ thống adenyl cyclase biến đổi ATP thành AMP vòng (cAMP). Quá trình này điều hướng dưỡng chất từ mô mỡ sang mô cơ, thúc đẩy phân giải lipid và tăng cường tổng hợp protein, khiến vật nuôi tăng trọng nhanh từ 1,5 đến 2,0 kg/ngày nhưng để lại dư lượng độc hại lớn trong cơ thể.
• Nguyên lý ion hóa và phân tích khối phổ hai lần (LC-ESI-MS/MS): Sử dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ở chế độ ion dương $\text{ESI}(+)$, các phân tử chất phân tích nhận proton tạo thành tiền ion $[\text{M}+\text{H}]^+$. Trong bộ phân tích ba tứ cực, tiền ion được chọn lọc tại tứ cực thứ nhất ($Q_1$), bị phân mảnh bởi khí va chạm Argon tại tứ cực thứ hai ($Q_2$), và các ion con đặc trưng được phân tách tại tứ cực thứ ba ($Q_3$) ở chế độ giám sát phản ứng chọn lọc (SRM/MRM).
• Các khái niệm then chốt: Chiết pha rắn trao đổi cation mạnh (SPE-SCX), chuẩn nội đồng vị đánh dấu deuterium (Salbutamol-$d_3$, Clenbuterol-$d_9$, Ractopamine-$d_6$), năng lượng va chạm (Collision Energy - CE) và thế phân nhóm (Declustering Potential - DP).

Phương pháp nghiên cứu

• Quy mô và phương pháp lấy mẫu: Thu thập mẫu nước tiểu tối thiểu 150 mL trực tiếp tại chuồng trại hoặc cơ sở giết mổ theo Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT (1-3 mẫu đối với trại dưới 100 con; 3-5 mẫu đối với trại từ 100 con trở lên). Mẫu thịt lợn và thức ăn chăn nuôi được thu thập ngẫu nhiên với khối lượng từ 100 g đến 500 g mỗi mẫu tại các chợ truyền thống trên địa bàn Hà Nội, Hưng Yên, Hải Dương và Vĩnh Phúc, bảo quản lạnh ở nhiệt độ dưới -20°C.
• Lý do lựa chọn phương pháp phân tích: LC-MS/MS được lựa chọn nhờ khả năng định danh chính xác dựa trên tỷ số khối trên điện tích ($m/z$) của 2 mảnh ion đặc trưng, khắc phục triệt để nhược điểm dương tính giả của kỹ thuật ELISA và loại bỏ bước dẫn xuất hóa phức tạp kéo dài của kỹ thuật GC-MS.
• Quy trình xử lý mẫu và timeline thực nghiệm: Mẫu thử (2 g thịt hoặc thức ăn chăn nuôi; 5 mL nước tiểu) được chiết bằng dung dịch đệm phosphat $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 0,1M ở pH 6,0. Dịch chiết được làm sạch và làm giàu qua cột chiết pha rắn Strata-SCX (500 mg, 3 mL), rửa cột bằng nước và hỗn hợp $\text{MeOH}:\text{H}_2\text{O}$ (10:90), sau đó rửa giải hoạt chất bằng 5 mL dung dịch $\text{MeOH} : \text{NH}_4\text{OH}$ 25% (95:5). Dịch rửa giải được thổi khô dưới dòng khí $\text{N}_2$, hòa tan lại trong 1 mL pha động và lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi bơm vào hệ thống LC-MS/MS.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát và thẩm định phương pháp trên thiết bị khối phổ ba tứ cực ABI 5500 QQQ ghép nối HPLC Shimadzu 20 AXL đã thu được các phát hiện kỹ thuật mang tính đột phá:

• Tối ưu hóa thông số khối phổ MRM: Đã xác định chính xác các cặp ion định lượng và xác nhận cho từng chất phân tích với thế phân nhóm DP cố định ở 130 eV:
  • Salbutamol ($m/z$ $240 \rightarrow 148$ định lượng, CE = 25 eV; $240 \rightarrow 166$ xác nhận, CE = 19 eV).
  • Clenbuterol ($m/z$ $277 \rightarrow 203$ định lượng, CE = 23 eV; $277 \rightarrow 132$ xác nhận, CE = 41 eV).
  • Ractopamine ($m/z$ $302 \rightarrow 164$ định lượng, CE = 21 eV; $302 \rightarrow 107$ xác nhận, CE = 41 eV).
  • Các ion nội chuẩn đồng vị tương ứng: Salbutamol-$d_3$ ($m/z$ $243 \rightarrow 151$) và Clenbuterol-$d_9$ ($m/z$ $286 \rightarrow 204$).
• Độ tuyến tính và độ nhạy phương pháp: Đường chuẩn xây dựng trên nền mẫu thực kết hợp chuẩn nội đồng vị đạt độ tuyến tính cao trong dải nồng độ từ 0,05 đến 500 ng/mL với hệ số tương quan $R^2 \ge 0,9997$ (Salbutamol đạt $R^2 = 0,9997$; Clenbuterol và Ractopamine đạt $R^2 = 1,0000$). Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đạt mức siêu vết:
  • Trên nền thịt: LOD của Clenbuterol đạt dưới 0,1 µg/kg, Salbutamol và Ractopamine đạt dưới 0,5 µg/kg.
  • Trên nền nước tiểu và thức ăn chăn nuôi: LOD dao động từ 0,05 đến 0,2 µg/L.
• Độ đúng và độ chụm: Thử nghiệm lặp lại 3 đến 6 lần trên các nền mẫu thêm chuẩn ở nhiều dải nồng độ khác nhau cho thấy hiệu suất thu hồi đạt từ 82% đến 105%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) luôn duy trì dưới 8,4%, hoàn toàn thỏa mãn tiêu chuẩn khắt khe của Ủy ban Châu Âu (quy định 2002/657/EC).

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm chứng minh rằng việc kết hợp đệm chiết pH 6,0 với cột chiết pha rắn trao đổi cation SCX giúp tích điện dương tối đa nhóm amino bậc hai của phân tử $\beta_2$-agonist, tạo lực liên kết tĩnh điện bền vững với tâm trao đổi sulfonic acid trên pha tĩnh. Nhờ đó, quy trình loại bỏ được trên 90% lipid và protein lạ từ dịch chiết thô, triệt tiêu hiệu ứng ức chế ion hóa (matrix ion suppression) tại đầu phun ESI.

Dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa thông qua bảng ma trận thông số khối phổ đa tầng và hệ thống sắc ký đồ phân giải cao. Trên sắc ký đồ thu được từ cột Agilent Eclipse Plus C18 (150 mm x 2,1 mm; 3,5 µm) với pha động chứa 0,1% acid formic, các peak sắc ký của 3 chất phân tích xuất hiện đối xứng hoàn hảo, tách rời hoàn toàn khỏi tín hiệu nhiễu đường nền trong thời gian phân tích dưới 10 phút. So với phương pháp theo tiêu chuẩn TCVN 11294:2016, quy trình cải tiến này giúp giảm lượng dung môi hữu cơ độc hại tiêu hao khoảng 40%, rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu và cải thiện độ nhạy từ 2 đến 5 lần, cho phép phát hiện chính xác các trường hợp tồn dư chất cấm ở nồng độ cực thấp.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm và yêu cầu thực tiễn trong công tác quản lý an toàn thực phẩm, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp trọng tâm:

1. Chuẩn hóa quy trình giám định định lượng LC-MS/MS: Các cơ quan chuyên môn như Viện Khoa học hình sự (Bộ Công an) phối hợp cùng Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng ban hành quy trình thao tác chuẩn (SOP) dựa trên nghiên cứu này, áp dụng thống nhất cho hệ thống phòng thí nghiệm kiểm nghiệm trên cả nước trong vòng 6 đến 12 tháng tới.
2. Đầu tư trang thiết bị và chuyển giao công nghệ cho tuyến địa phương: Trang bị hệ thống sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực hiện đại cho Phân viện Khoa học hình sự tại Đà Nẵng, TP. Hồ Chí Minh và Phòng Kỹ thuật hình sự Công an các tỉnh trọng điểm, bảo đảm 100% kết quả giám định mẫu nước tiểu và thịt gia súc có giá trị pháp lý tuyệt đối phục vụ khởi tố vụ án hình sự.
3. Kiểm soát chặt chẽ chuỗi cung ứng tiền chất y tế: Bộ Y tế cùng Tổng cục Hải quan và lực lượng Cảnh sát phòng chống tội phạm về môi trường cần thiết lập hệ thống truy xuất nguồn gốc điện tử, kiểm soát 100% sản lượng Salbutamol nhập khẩu (trên 9 tấn/năm), ngăn chặn triệt để hành vi tuồn hóa chất y tế sang các nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi.
4. Triển khai thanh tra đột xuất tại các vùng chăn nuôi tập trung: Cục Thú y và Thanh tra Sở Nông nghiệp duy trì kiểm tra định kỳ hàng quý tại các trang trại nuôi lợn quy mô trên 100 con, tập trung lấy mẫu nước tiểu tại chuồng để phát hiện sớm vi phạm, đặt mục tiêu kéo giảm tỷ lệ mẫu dương tính với $\beta_2$-agonist xuống dưới 0,5% trên phạm vi toàn quốc.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng thực tiễn cao đối với 4 nhóm đối tượng chính:

• Giám định viên Kỹ thuật hình sự và Cán bộ Pháp y: Khai thác quy trình tối ưu hóa thiết bị khối phổ ABI 5500 QQQ và phương pháp làm sạch mẫu SPE-SCX để phân tích mẫu vật chứng phục vụ điều tra, truy tố tội phạm theo Điều 317 Bộ luật Hình sự.
• Kỹ thuật viên phòng kiểm nghiệm An toàn thực phẩm và Nông nghiệp: Áp dụng trực tiếp thông số pha động, chương trình gradient dung môi và kỹ thuật chuẩn nội đồng vị để tối ưu hóa quy trình phân tích dư lượng kháng sinh, chất tăng trọng thường quy.
• Học viên cao học, Nghiên cứu sinh ngành Hóa phân tích và Độc chất học: Sử dụng làm tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp thẩm định quy trình phân tích lượng vết (đánh giá LOD, LOQ, độ đúng, độ chụm và hiệu ứng nền mẫu phức tạp).
• Cán bộ quản lý Nhà nước ngành Nông nghiệp và Y tế: Nắm bắt cơ sở dữ liệu khoa học về đặc tính tích lũy độc chất để xây dựng rào cản kỹ thuật, sửa đổi và hoàn thiện các quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về ngưỡng tồn dư tối đa (MRL).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao phải sử dụng chuẩn nội đồng vị ($d_3, d_6, d_9$) trong phép phân tích LC-MS/MS? Chuẩn nội đồng vị có cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý tương đồng tuyệt đối với chất phân tích nhưng có khối lượng phân tử ($m/z$) khác biệt. Việc thêm chuẩn nội vào mẫu giúp tự động bù trừ các sai số do thất thoát trong quá trình chiết tách qua cột SPE cũng như hiện tượng dập tắt ion tại nguồn ion hóa ESI, đảm bảo độ thu hồi đạt từ 82% đến 105%.

2. Chiết pha rắn bằng cột SPE Strata-SCX có ưu điểm gì vượt trội so với chiết lỏng-lỏng? Cột SPE trao đổi cation mạnh (SCX) cho phép giữ chọn lọc các hợp chất $\beta_2$-agonist mang điện tích dương ở pH 6,0, loại bỏ hoàn toàn các hợp chất trung tính và anion gây nhiễu. Phương pháp này tiết kiệm hơn 50% lượng dung môi hữu cơ, rút ngắn thời gian xử lý mẫu và hạn chế tối đa nguy cơ tạo nhũ tương.

3. Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp có đáp ứng yêu cầu Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT không? Phương pháp hoàn toàn đáp ứng và vượt trội so với quy chuẩn. Cụ thể, LOQ đối với Clenbuterol trong thịt đạt dưới 0,1 µg/kg (ngưỡng quy định là 0,2 ppb) và Salbutamol trong nước tiểu đạt dưới 1,0 µg/L (ngưỡng quy định là 5,0 ppb), đảm bảo phát hiện chính xác mọi vi phạm.

4. Dư lượng Salbutamol và Clenbuterol trong thịt có bị phá hủy khi luộc hoặc nướng chín không? Các hợp chất $\beta_2$-agonist có cấu trúc vòng thơm phenethanolamin rất bền nhiệt, không bị phân hủy hay biến tính trong quá trình đun nấu thông thường ở nhiệt độ 100°C hoặc cao hơn. Do đó, người tiêu dùng ăn phải thịt chứa chất cấm vẫn hấp thu gần như nguyên vẹn độc chất vào cơ thể.

5. Vì sao phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần lại được ưu tiên dùng trong tố tụng tư pháp? LC-MS/MS vận hành ở chế độ SRM/MRM theo dõi đồng thời 1 ion mẹ và 2 ion con đặc trưng kèm tỷ lệ cường độ ion chuẩn xác. Sự kết hợp giữa thời gian lưu sắc ký và khối phổ phân giải cao mang lại tính pháp lý không thể tranh cãi, loại trừ 100% nguy cơ kết luận sai do dương tính giả.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình phân tích đồng thời Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine trên 3 nền mẫu thịt lợn, nước tiểu và thức ăn chăn nuôi.
• Tối ưu hóa toàn diện các điều kiện phân mảnh khối phổ đa tầng trên hệ thống LC-MS/MS ABI 5500 QQQ và quy trình làm sạch mẫu bằng cột chiết pha rắn SPE Strata-SCX.
• Phương pháp đạt độ nhạy vượt trội với khoảng tuyến tính rộng (0,05 - 500 ng/mL, $R^2 \ge 0,9997$), hiệu suất thu hồi cao từ 82% đến 105% và độ lệch chuẩn RSD < 8,4%.
• Đóng góp cơ sở khoa học vững chắc và công cụ giám định kỹ thuật hình sự đắc lực phục vụ kiểm soát an toàn thực phẩm và thực thi Điều 317 Bộ luật Hình sự.
• Lộ trình tiếp theo bao gồm việc liên kết mở rộng kiểm nghiệm trên các nền mẫu phủ tạng (gan, thận) và mở rộng danh mục phân tích thêm các dẫn xuất $\beta_2$-agonist thế hệ mới trong giai đoạn tới. Các phòng kiểm nghiệm và đơn vị quản lý chất lượng nên sớm cập nhật và áp dụng quy trình chuẩn này vào thực tế giám định.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Xã hội ngày càng phát triển, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm càng ngày càng đƣợc chú trọng nhiều hơn so với trƣớc kia. An toàn thực phẩm ngày nay không chỉ đơn thuần là các vấn đề về thực phẩm nhiễm bẩn, ôi thiu, thiếu vệ sinh mà còn ở chỗ thực phẩm có chứa những độc chất gây hại cho con ngƣời. Chất cấm trong chăn nuôi không phải là vấn đề mới, từ năm 2006, cơ quan chức năng đã phát hiện tồn dƣ chất cấm trong thịt gia súc, gia cầm và trong chăn nuôi, nhất là trong thịt lợn. Tuy nhiên, việc sử dụng chất cấm trong sản xuất, kinh doanh thức ăn chăn nuôi và chăn nuôi thời gian qua có diễn biến phức tạp cả về tính chất, mức độ và trên quy mô diện rộng.

Các loại chất cấm thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thức ăn chăn nuôi, trong chăn nuôi chủ yếu là các chất thuộc nhóm beta – agonist (Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamin). Các chất này khi cho ăn sẽ làm cho lợn tăng trọng nhanh, nở mông, nở đùi, tăng tỉ lệ thịt nạc, tăng lợi nhuận cho ngƣời chăn nuôi và chất tạo màu (VAT Yellow), tạo màu sắc đẹp cho thực phẩm nên đƣợc các đối tƣợng thƣờng xuyên sử dụng. Thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi cũng đang là vấn đề đƣợc ngƣời tiêu dùng quan tâm bởi qua điều tra, khảo sát của các cơ quan chức năng, hầu hết các trại nuôi gà có sử dụng kháng sinh đều cao hơn quy chuẩn; ngoài ra, một số loại kháng sinh ngoài quy chuẩn cũng đƣợc sử dụng và có hàm lƣợng cao hơn quy định. Riêng trong 10 tháng đầu năm 2015, tại các khu vực tỉnh, thành phố phía Nam, cơ quan chức năng đã lấy mẫu kiểm tra và phát hiện nhiều mẫu nƣớc tiểu lợn dƣơng tính với Salbutamol, tập trung ở các tỉnh, thành phố nhƣ: Đồng Nai phát hiện 109/654 mẫu (chiếm 16,7%); TP.

Hồ Chí Minh phát hiện 95/516 mẫu (chiếm 18,4%); Tiền Giang phát hiện 35/525 mẫu (chiếm 6,7%)… Nồng độ chất Salbutamol trong các mẫu nƣớc tiểu vật nuôi rất cao, đa số trên 200ppb, có mẫu lên tới 665ppb. Trƣớc tình hình trên, với vai trò nòng cốt của ngành Công an trong phòng chống tội phạm, vi phạm pháp luật về môi trƣờng, lực lƣợng Cảnh sát PCTP vể môi trƣờng đã tập trung tham mƣu chỉ đạo và triển khai đồng bộ các biện pháp công tác phòng chống; trong đó đã tích cực phối hợp với các ban, ngành của Bộ Nông nghiệp 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] và Phát triển nông thôn để thanh, kiểm tra nhằm phát hiện các cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi, các cơ sở chăn nuôi sử dụng chất cấm; phối hợp với Bộ Y tế, Bộ Tài chính, Tổng cục hải quan đẩy mạnh công tác kiểm tra, kiểm soát các hóa chất nhập khẩu đƣợc sử dụng trong ngành y tế nhƣng là chất cấm trong chăn nuôi. Trong tháng 11/2015, lực lƣợng Cảnh sát PCTP về môi trƣờng Công an các đơn vị, địa phƣơng đã tiến hành kiểm tra 40 cơ sở chăn nuôi; 14 cơ sở thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y; 06 cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi; 04 cửa hàng thịt; 03 cơ sở giết mổ. Qua kiểm tra, phát hiện 04 cơ sở chăn nuối có hành vi sử dụng chất cấm trong chăn nuôi (Salbutamol); 01 cửa hàng thuốc thú y có dấu hiệu buôn bán chất cấm trong chăn nuôi.

Phối hợp với các cơ quan chức năng tiến hành xử phạt 40 triệu đồng với 03 cơ sở sản xuất thức ăn chăn có hành vi sử dụng chất cấm trong chăn nuôi. Riêng Cục Cảnh sát PCTP về môi trƣờng đã phối hợp với các ngành chức năng (Thanh tra Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, cục quản lý dƣợc – Bộ y tế) kiểm tra 15 công ty, cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi; làm việc với 10 doanh nghiệp nhập khẩu hóa chất y tế có vi phạm bán hóa chất (Salbutamol) không đúng đối tƣợng. Quá trình thanh tra, kiểm tra, ngoài việc phát hiện sai phạm của các cchemơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi, cơ sở chăn nuôi trong việc sử dụng chất cấm, các sai phạm của các công ty nhập khẩu, kinh doanh hóa chất y tế lén lút bán chất tạo nạc cho các đối tƣợng sử dụng trong chăn nuôi, còn phát hiện đƣợc nhiều phƣơng thức, thủ đoạn đối phó rất tinh vi, xảo quyệt nhằm trốn tránh sự phát hiện của cơ quan chức năng nhƣ để riêng chất cấm với thức ăn không phối trộn tại xƣởng mà sử dụng trực tiếp tại cơ sở chăn nuôi… Từ tình hình thực tế trên, Cục Cảnh sát PCTP về môi trƣờng đã tham mƣu, kiến nghị với Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn bổ sung 05 loại chất Vàng Ô vào danh mục cấm nhập khẩu, kinh doanh và sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam. Với mức độ gây hại nhƣ vậy, việc xác định dƣ lƣợng Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamine trong thức ăn chăn nuôi và trong thịt, nƣớc tiểu của gia súc, gia cầm là rất cần thiết.

Trong bản luận văn này, chúng tôi đã triển khai nghiên cứu phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamine trong 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] mẫu thức ăn chăn nuôi và trong mẫu nƣớc tiểu, mẫu thịt của lợn bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Phƣơng pháp này có độ nhạy và độ chính xác cao, dễ áp dụng và có thể trở thành công cụ rất tốt phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm tra an toàn thực phẩm. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1. Giới thiệu về hoocmon tăng trƣởng β2-agonist 1.

β2-agonist là gì? Các hợp chất β2-agonist là các dẫn xuất tổng hợp của phenethanolamin. Trong dƣợc lý, b2-agonist là hợp chất liên kết với một protein đặc biệt trên màng tế bào (Receptor) và nó gây ra sự kích thích trong tế bào. Nó giống hệt tác dụng của các chất nội sinh (ligand) gắn cùng với một loại protêin. Các chất này có khả năng liên kết tạo phức với một phân tử sinh học (protêin) để đáp ứng mục đích sinh học.

Tác dụng của β2-agonist Beta-agonist đƣợc phân làm hai nhóm theo đặc tính chữa bệnh nhƣ sau: Nhóm β1-agonist: gồm các chất nhƣ dobutamine, isoproterenol, samoterol và epinephrine có tác dụng kích thích tim, đƣợc dùng để điều trị sốc tim, suy tim cấp tính. Nhóm β2-agonist: gồm các chất nhƣ salbutanol, clenbuterol, cinaterol, fenoterol, formoterol, terbutaline, denopamine, isoxsuprine, ractopamine,… có tác dụng làm giãn cơ, đƣợc dùng để điều trị hen phế quản, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính. Phân loại β2-agonist Đối với động vật khi sử dụng β2-agonist dẫn tới sự chuyển hƣớng số lƣợng lớn các chất dinh dƣỡng từ mô mỡ về cơ, làm tăng sự tổng hợp protein thay vì mỡ, do để nó có tác dụng làm tăng lƣợng thịt nạc và làm giảm lƣợng mỡ của cơ thể động vật. Tác dụng phụ khi sử dụng β2-agonist: gây cảm giác lo lắng, hồi hộp, tim đập nhanh, giảm hàm lƣợng kali trong máu, tăng huyết áp, run cơ, đau đầu, buồn nôn.

Các β2-agonist chia làm 2 loại: - Các β2-agonist tác dụng ngắn: Salbutamol, Terbutalin, Fenoterol. - Các β2-agonist tác dụng dài: Clenbuterol, Formoterol, Salmeterol. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Sự phân chia này dựa trên thời gian tác dụng của mỗi loại. Đối với Salbutamol, Terbutaline và Fenoterosau khi đƣa vào cơ thể tác dụng rất nhanh, chỉ trong vài phút và kéo dài khoảng 4 đến 6 giờ.

Đối với Clenbuterol, Formoterol và Salmeterol thời gian tác dụng kéo dài đến xấp xỉ 12 giờ [1]. Thời gian hoạt động lâu dài của loại thứ hai là do các phân tử này ban đầu khuếch tán vào màng plasma của tế bào phổi, và sau đã đƣợc giải phóng chậm trở lại bên ngoài tế bào nơi mà chúng cã thể kết hợp với β2-adrenoceptors. Tháng 11/1995 FDA (Mỹ) đƣa ra một tƣ vấn sức khoẻ, báo động cho công chúng: sử dụng các β2-agonist tác dụng dài có thể dẫn tới các triệu chứng xấu và trong vài trƣờng hợp gây tử vong. Giới thiệu về Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine 1.

Thông tin chung 1. Salbutamol - Danh pháp thƣờng: Sabutamol - Danh pháp quốc tế (IUPAC): 4-[2-(tert-butylamino)-1-hydroxyethyl]-2- (hydroxymethyl) phenol - Công thức phân tử: C13H21NO3 - Công thức cấu tạo hai đồng phân quang học của salbutamol - Khối lƣợng phân tử: 239,311 g/mol - Thời gian bán huỷ: 3,8 - 6 giờ 1.Clenbuterol - Danh pháp thƣờng: Clenbterol - Danh pháp quốc tế (IUPAC): (RS)-1-(4-Amino-3,5-dichlorophenyl)-2-(tert- butylamino)ethan-1-ol - Công thức phân tử: C12H18Cl2N2O 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Công thức cấu tạo hai đồng phân quang học của Clenbuterol  - Khối lƣợng phân tử: 277,19 g/mol - Thời gian bán huỷ: 36 – 39 giờ 1.Ractopamine - Danh pháp thƣờng: Ractopamin - Danh pháp quốc tế (IUPAC): 4-[3-[[2-Hydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)ethyl]amino]butyl]phenol - Công thức phân tử:C18H23NO3 - Khối lƣợng phân tử: 301,39 g/mol - Công thức cấu tạo của Ractopamine 1. Tính chất và tác dụng của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine 1. Tác dụng làm giãn phế quản.

• Salbutamol Salbutamol [1-(4-(RS)-hydroxy- 3- hydroxymethylphenyl)- 2-(t-butylamino) ethanol] là chất chủ vận thụ thể adrenergic β2 (β2-adrenoceptor agonist) có tác dụng trên cơ trơn và cơ xƣơng, gồm có: giãn phế quản, giãn cơ tử cung và run. Tác dụng giãn cơ trơn tùy thuộc vào liều dùng và đƣợc cho rằng xảy ra thông qua hệ thống adenyl cyclase - AMP vòng, với việc thuốc gắn vào thụ thể β2-adrenergic tại màng tế bào gây ra sự biến đổi ATP thành AMP vòng làm hoạt hóa protein kinase. Điều này dẫn đến sự phosphoryl hóa các protein và cuối cùng làm gia tăng canxi nội bào 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] loại liên kết; calci nội bào ion hóa bị giảm bớt gây ức chế liên kết actin-myosin, do đó làm giãn cơ trơn. Thuốc chủ vận β2 nhƣ salbutamol cũng có tác dụng chống dị ứng bằng cách tác dụng lên dƣỡng bào làm ức chế sự phóng thích các hóa chất trung gian gây co thắt phế quản nhƣ histamin, yếu tố hóa ứng động bạch cầu đa nhân trung tính (NCF) và prostaglandin D2.

Salbutamol làm giãn phế quản ở cả ngƣời bình thƣờng lẫn bệnh nhân suyễn hay bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD) sau khi uống. Salbutamol còn làm gia tăng sự thanh thải tiêm mao nhầy (đã đƣợc chứng minh ở bệnh nhân COPD lẫn ở ngƣời bình thƣờng). Salbutamol kích thích các thụ thể β2 gây ra các tác dụng chuyển hóa lan rộng: tăng lƣợng acid béo tự do, insulin, lactat và đƣờng; giảm nồng độ kali trong huyết thanh. Salbutamol có lẽ là chất có hiệu lực và an toàn nhất trong số các thuốc giãn phế quản loại giống giao cảm.