Luận văn thạc sĩ hus xác định kiểu gen virus viêm gan c trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan c bằng kỹ thuật sinh học phân tử rt pcr

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật RT-PCR, góp phần nâng cao chẩn đoán.

• Tác giả: Phương Thị Hà
• Người hướng dẫn: Ts.Bs Nguyễn Văn Tiến
• Trường học: Đại học quốc gia hà nội - trường đại học khoa học tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà nội

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV)
• 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và phân loại
• 1.1.2. Hình thái cấu trúc virut viêm gan C
• 1.1.3. Genome HCV
• 1.1.4. Gen và Protein
• 1.1.5. Vòng đời của virut viêm gan C

Tóm tắt

I. Tổng quan về xác định kiểu gen virus viêm gan C bằng RT PCR

Virus viêm gan C (HCV) là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan. Việc xác định kiểu gen của virus này là rất quan trọng trong việc điều trị và tiên lượng bệnh. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) đã trở thành phương pháp phổ biến để xác định kiểu gen HCV trong huyết thanh bệnh nhân. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện virus mà còn xác định được nồng độ virus trong máu, từ đó hỗ trợ bác sĩ trong việc đưa ra phác đồ điều trị phù hợp.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus viêm gan C

Virus viêm gan C thuộc họ Flaviviridae, có cấu trúc ARN và có khả năng biến đổi gen cao. HCV được phân loại thành nhiều kiểu gen khác nhau, trong đó các kiểu gen 1, 2 và 6 là phổ biến ở Việt Nam. Việc hiểu rõ về đặc điểm sinh học của virus giúp nâng cao hiệu quả trong việc chẩn đoán và điều trị.

1.2. Tầm quan trọng của việc xác định kiểu gen HCV

Xác định kiểu gen HCV là cần thiết để đánh giá mức độ nặng của bệnh và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp. Mỗi kiểu gen có đặc điểm sinh học và đáp ứng điều trị khác nhau, do đó việc phân loại chính xác là rất quan trọng.

II. Thách thức trong việc xác định kiểu gen virus viêm gan C

Mặc dù kỹ thuật RT-PCR đã được áp dụng rộng rãi, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định kiểu gen HCV. Một số vấn đề chính bao gồm độ chính xác của phương pháp, khả năng phân biệt giữa các subtype và chi phí thực hiện xét nghiệm. Đặc biệt, việc phân loại sai kiểu gen có thể dẫn đến những sai lầm trong điều trị.

2.1. Độ chính xác của phương pháp RT PCR

Độ chính xác của RT-PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng mẫu, quy trình thực hiện và thiết bị sử dụng. Việc đảm bảo các yếu tố này là rất quan trọng để có được kết quả chính xác.

2.2. Khó khăn trong việc phân biệt các subtype

Một trong những thách thức lớn nhất là khả năng phân biệt giữa các subtype của HCV. RT-PCR có thể không đủ nhạy để phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các subtype, điều này có thể ảnh hưởng đến quyết định điều trị.

III. Phương pháp RT PCR trong xác định kiểu gen HCV

RT-PCR là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép phát hiện và định lượng virus viêm gan C trong huyết thanh. Phương pháp này sử dụng Taqman probe để phát hiện ARN của virus, từ đó xác định kiểu gen một cách nhanh chóng và hiệu quả. RT-PCR có nhiều ưu điểm như dễ thực hiện, chi phí thấp và không yêu cầu thiết bị phức tạp.

3.1. Quy trình thực hiện RT PCR

Quy trình thực hiện RT-PCR bao gồm các bước như tách chiết ARN, tổng hợp cDNA và khuếch đại sản phẩm. Mỗi bước cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

3.2. Ưu điểm của RT PCR so với các phương pháp khác

RT-PCR có nhiều ưu điểm so với các phương pháp khác như giải trình tự gen. Phương pháp này nhanh chóng, tiết kiệm chi phí và có thể thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm, giúp mở rộng khả năng tiếp cận cho bệnh nhân.

IV. Ứng dụng thực tiễn của việc xác định kiểu gen HCV

Việc xác định kiểu gen HCV có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Nó không chỉ giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp mà còn giúp theo dõi hiệu quả điều trị và phát hiện các biến thể gen mới. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh dịch bệnh viêm gan C đang gia tăng trên toàn cầu.

4.1. Lựa chọn phác đồ điều trị dựa trên kiểu gen

Mỗi kiểu gen HCV có đáp ứng điều trị khác nhau. Việc xác định chính xác kiểu gen giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân, từ đó nâng cao tỷ lệ thành công trong điều trị.

4.2. Theo dõi hiệu quả điều trị

Xác định kiểu gen HCV cũng giúp theo dõi hiệu quả điều trị. Bác sĩ có thể đánh giá sự giảm tải virus trong máu và điều chỉnh phác đồ điều trị nếu cần thiết.

V. Kết luận và tương lai của xác định kiểu gen HCV

Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bằng RT-PCR là một bước tiến quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Với sự phát triển của công nghệ sinh học, các phương pháp mới hứa hẹn sẽ nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong việc xác định kiểu gen HCV. Tương lai của việc nghiên cứu và ứng dụng các kỹ thuật mới sẽ mở ra nhiều cơ hội trong việc kiểm soát và điều trị bệnh viêm gan C.

5.1. Xu hướng phát triển công nghệ trong xác định kiểu gen

Công nghệ sinh học phân tử đang phát triển nhanh chóng, mở ra nhiều cơ hội mới trong việc xác định kiểu gen HCV. Các phương pháp mới như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) có thể cung cấp thông tin chi tiết hơn về kiểu gen và biến thể của virus.

5.2. Tương lai của điều trị viêm gan C

Với sự phát triển của các phương pháp điều trị mới, việc xác định kiểu gen HCV sẽ ngày càng trở nên quan trọng hơn. Điều này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn góp phần vào việc kiểm soát dịch bệnh viêm gan C trên toàn cầu.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Viêm gan virus C (HCV) là một trong những thách thức y tế cộng đồng nghiêm trọng nhất trên phạm vi toàn cầu. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, hiện có khoảng 170 triệu người đang sống chung với virus viêm gan C, tương đương từ 2% đến 3% dân số thế giới. Diễn tiến bệnh học của HCV đặc biệt nguy hiểm khi có khoảng 70% đến 90% trường hợp nhiễm virus cấp tính sẽ chuyển sang giai đoạn mạn tính, trong đó có khoảng 20% đến 25% bệnh nhân mạn tính tiến triển nặng thành xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan nguyên phát. Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HCV trong quần thể dân số bình thường ước tính khoảng 6%, đưa nước ta vào nhóm các quốc gia có gánh nặng dịch tễ viêm gan C ở mức cao.

Trước khi tiến hành can thiệp lâm sàng, việc xác định chính xác hai chỉ số trọng yếu gồm định lượng tải lượng virus trong máu và phân định kiểu gen (genotype) đóng vai trò quyết định đến hiệu quả cũng như thời gian điều trị. Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học của học viên Phương Thị Hà tập trung giải quyết vấn đề phân định kiểu gen HCV trong huyết thanh bệnh nhân thông qua việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử Real-time PCR (RT-PCR) sử dụng mẫu dò Taqman probe trên vùng 5'NC và kiểm chứng lại kiểu gen 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn gen NS5B.

Nghiên cứu được triển khai trên 239 mẫu huyết thanh thu thập từ tháng 1 năm 2011 đến tháng 1 năm 2012 tại Khoa Truyền nhiễm thuộc Bệnh viện Bạch Mai. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu dịch tễ học phân tử xác thực, giúp tối ưu hóa phác đồ điều trị, rút ngắn thời gian dùng thuốc và giảm đáng kể gánh nặng chi phí y tế cho người bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Virus viêm gan C thuộc họ Flaviviridae, chi Hepacivirus, có cấu trúc bộ gen là một sợi đơn ARN dương với kích thước khoảng 9,6 kb. Bộ gen HCV mang một khung đọc mở duy nhất mã hóa cho chuỗi tiền polyprotein gồm khoảng 3000 acid amin, sau đó được phân cắt thành 3 protein cấu trúc (Core, E1, E2) và 7 protein phi cấu trúc (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Trong chu kỳ nhân đôi, enzyme ARN polymerase phụ thuộc ARN (RdRp do gen NS5B mã hóa) thiếu hoạt tính sửa sai, dẫn đến tần suất đột biến rất cao và hình thành nên tính đa dạng di truyền phức tạp.

Hiện nay trên thế giới đã ghi nhận 6 kiểu gen chính (từ type 1 đến type 6) và hơn 50 phân nhóm (subtype). Sự phân bố kiểu gen mang tính đặc thù sâu sắc theo vùng địa lý; trong đó Việt Nam phổ biến các kiểu gen 1, 2 và 6. Kiểu gen HCV chi phối trực tiếp đến độc lực của virus, nguy cơ tiến triển xơ gan và khả năng đáp ứng điều trị phác đồ Interferon kết hợp Ribavirin. Theo các y văn chuyên ngành, bệnh nhân nhiễm kiểu gen 1 có tỷ lệ đáp ứng điều trị thấp, chỉ đạt khoảng 18,1% và cần liệu trình kéo dài 48 tuần, trong khi các kiểu gen khác như kiểu gen 2 và 6 đạt tỷ lệ đáp ứng cao hơn lên đến 54,9% với thời gian điều trị chỉ cần 24 tuần.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng thiết kế mô tả cắt ngang có đối chứng phân tử. Tổng số 239 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có kết quả xét nghiệm Anti-HCV dương tính bằng kỹ thuật miễn dịch ELISA được đưa vào khảo sát. Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiêm ngặt loại trừ các trường hợp đồng nhiễm với virus viêm gan B (HBV), virus viêm gan G (HGV) hoặc virus suy giảm miễn dịch ở người (HIV).

Quy trình thực nghiệm sinh học phân tử được tiến hành qua các giai đoạn chuẩn hóa:

1. Tách chiết và tinh sạch ARN virus từ 100 µl huyết thanh theo nguyên lý biến tính protein bằng Guanidine thiocyanate kết hợp Phenol-Chloroform.
2. Tổng hợp cDNA sợi đơn từ ARN tinh sạch thông qua phản ứng phiên mã ngược sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotide (Random hexamer primers) và enzyme Reverse Transcriptase cùng RNAse H.
3. Định lượng nồng độ HCV-ARN bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR trên hệ thống máy CFX96 với chu trình luân nhiệt 40 chu kỳ. Mẫu đạt ngưỡng tải lượng virus từ 1,0x10^2 copies/ml trở lên (chiếm 228/239 mẫu) được đưa vào định kiểu gen.
4. Định type HCV bằng hệ mồi và mẫu dò Taqman probe đặc hiệu gắn huỳnh quang (FAM, HEX, Cy5, ROX) trên vùng 5'NC.
5. Kiểm chứng chẩn đoán bằng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp Sanger trên đoạn gen NS5B đối với 30 mẫu ngẫu nhiên mang kiểu gen 1 trên hệ thống máy 3130XL sử dụng hóa chất BigDye Terminator v1.3.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phân tích đặc điểm nhân khẩu học trên 239 bệnh nhân Anti-HCV dương tính cho thấy sự chênh lệch rõ rệt về giới tính: nam giới chiếm ưu thế với 171 trường hợp (tỷ lệ 71,55%), trong khi nữ giới có 68 trường hợp (tỷ lệ 28,45%). Độ tuổi của bệnh nhân dao động từ 21 đến 75 tuổi, độ tuổi trung bình là 41 tuổi. Đáng chú ý, virus viêm gan C tập trung cao nhất ở nhóm tuổi lao động chính của xã hội: nhóm 30-39 tuổi chiếm 39,06%, nhóm 40-49 tuổi chiếm 23,24% và nhóm 50-59 tuổi chiếm 18,85%, tổng cộng nhóm tuổi 21-59 chiếm trên 90% số ca bệnh.

Kết quả định lượng cho thấy 95,4% mẫu huyết thanh (228/239 mẫu) có nồng độ virus đạt ngưỡng dương tính trên 1,0x10^2 copies/ml (dao động từ 1,0x10^2 đến 1,2x10^7 copies/ml), phản ánh tỷ lệ viêm gan C mạn tính hoạt động rất cao trong nhóm bệnh nhân có kháng thể Anti-HCV. Chỉ có 4,6% (11/239 mẫu) có tải lượng dưới ngưỡng phát hiện.

Phân định kiểu gen bằng Real-time RT-PCR trên 228 mẫu bệnh phẩm cho kết quả:

• Kiểu gen 1 chiếm tỷ lệ cao nhất với 66,23% (151/228 mẫu).
• Kiểu gen 6 đứng thứ hai với 30,70% (70/228 mẫu).
• Kiểu gen 2 chiếm tỷ lệ thấp với 2,19% (5/228 mẫu).
• Không phát hiện bất kỳ trường hợp nào mang kiểu gen 3 (0%).
• Có 2 mẫu không xác định được kiểu gen (0,88%).

Đặc biệt, kết quả giải trình tự gen đoạn NS5B trên 30 mẫu từng được xác định là kiểu gen 1 bằng RT-PCR vùng 5'NC đã phát hiện: chỉ có 16 mẫu thực sự là kiểu gen 1 (gồm 9 mẫu subtype 1a và 7 mẫu subtype 1b); 11 mẫu thực chất thuộc kiểu gen 6 (gồm 2 mẫu 6k, 6 mẫu 6e, 1 mẫu 6f và 2 mẫu 6h); 3 mẫu không giải trình tự được do tải lượng virus thấp dưới 1,0x10^3 copies/ml. Như vậy, tỷ lệ nhầm lẫn giữa kiểu gen 1 và kiểu gen 6 khi sử dụng RT-PCR vùng 5'NC lên tới 40,74% (11/27 mẫu phân tích thành công).

Thảo luận kết quả

Sự phân bố kiểu gen trong nghiên cứu có tính tương đồng cao với các công bố dịch tễ học trước đây tại Việt Nam. Nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy năm 2006 ghi nhận kiểu gen 1 chiếm 56%, kiểu gen 6 chiếm 30% và kiểu gen 2 chiếm 14%. Tương tự, nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt tại Trung tâm Y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh chỉ ra kiểu gen 1 chiếm 58,4%, kiểu gen 6 chiếm 23,9% và kiểu gen 2 chiếm 13,1%. Các kết quả đều khẳng định kiểu gen 1 và kiểu gen 6 là hai chủng virus chủ đạo lưu hành tại nước tộc ta.

Nguyên nhân chính dẫn đến tỷ lệ nhầm lẫn 40,74% giữa kiểu gen 1 và kiểu gen 6 trong phương pháp Real-time RT-PCR xuất phát từ đặc tính sinh học phân tử của vùng 5'NC. Vùng 5'NC là đoạn gen bảo tồn cao, có độ tương đồng trình tự nucleotide rất lớn giữa kiểu gen 1 và các biến thể của kiểu gen 6 vùng Đông Á. Do đó, các mẫu dò Taqman probe thiết kế trên vùng này dễ xảy ra hiện tượng bắt cặp chéo hoặc cho tín hiệu huỳnh quang dương tính đồng thời cả hai kênh.

Ngược lại, đoạn gen NS5B có độ biến động di truyền cao hơn (từ 20% đến 35%), cho phép kỹ thuật Sequencing phân tách chính xác tuyệt đối các subtype và loại bỏ hoàn toàn sự nhầm lẫn giữa type 1 và type 6. Về mặt trình bày dữ liệu, các bảng phân bố đa chiều kết hợp biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ kiểu gen theo nhóm tuổi và biểu đồ phân tán nồng độ virus đã minh họa rõ nét tính độc lập giữa tải lượng virus và loại kiểu gen.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán và hiệu quả điều trị viêm gan virus C tại Việt Nam, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp cụ thể:

1. Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán hai bước tại các cơ sở y tế chuyên khoa: Áp dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR vùng 5'NC như một xét nghiệm sàng lọc ban đầu nhanh, chi phí hợp lý để phát hiện sự có mặt của HCV và định type sơ bộ. Đối với tất cả các mẫu có kết quả định type 1 bằng RT-PCR và có tải lượng virus đạt trên 1,0x10^3 copies/ml, bệnh viện cần chỉ định xét nghiệm kiểm chứng lại bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger trên vùng NS5B trước khi đưa ra quyết định điều trị.
2. Cá thể hóa phác đồ điều trị nhằm tối ưu hóa chi phí và giảm độc tính thuốc: Việc phân biệt chính xác kiểu gen 6 khỏi kiểu gen 1 giúp bác sĩ rút ngắn thời gian điều trị từ 48 tuần xuống còn 24 tuần cho nhóm bệnh nhân kiểu gen 6. Giải pháp này giúp người bệnh tiết kiệm từ 30% đến 50% tổng chi phí thuốc, hạn chế các tác dụng phụ nghiêm trọng của thuốc kháng virus và nâng cao tỷ lệ đáp ứng virus bền vững.
3. Đầu tư nâng cấp năng lực phòng xét nghiệm sinh học phân tử: Các bệnh viện tuyến tỉnh và khu vực cần trang bị hệ thống Real-time PCR đạt chuẩn, tập huấn đội ngũ kỹ thuật viên tuân thủ nghiêm ngặt quy trình chống ngoại nhiễm chéo, đồng thời thiết lập liên kết gửi mẫu giải trình tự gen đến các trung tâm nghiên cứu chuyên sâu khi gặp các ca lâm sàng phức tạp.
4. Xây dựng chương trình giám sát dịch tễ học phân tử quốc gia: Bộ Y tế và các viện vệ sinh dịch tễ cần triển khai các nghiên cứu dịch tễ mở rộng định kỳ 2 năm một lần trên phạm vi toàn quốc nhằm theo dõi sự biến dịch của các phân nhóm kiểu gen 6 mới phát sinh, phục vụ chiến lược quản lý bệnh viêm gan virus đến năm 2030.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn mang lại giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn sâu rộng cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Bác sĩ lâm sàng chuyên khoa Truyền nhiễm và Tiêu hóa - Gan mật: Cung cấp bằng chứng thực chứng về nguy cơ chẩn đoán nhầm giữa kiểu gen 1 và kiểu gen 6, giúp bác sĩ thận trọng hơn khi chỉ định thời gian và phác đồ điều trị thuốc cho bệnh nhân.
2. Kỹ thuật viên và chuyên viên Sinh học phân tử y học: Tham khảo quy trình chuẩn về tách chiết ARN virus, tối ưu hóa điều kiện phản ứng Real-time RT-PCR mồi ngẫu nhiên và kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp trên đoạn gen NS5B.
3. Học viên cao học, nghiên cứu sinh và sinh viên ngành Vi sinh, Công nghệ sinh học, Y sinh: Nguồn tài liệu học thuật giá trị về cấu trúc hệ gen HCV, cơ chế đột biến di truyền của virus ARN và phương pháp luận thiết kế nghiên cứu dịch tễ phân tử.
4. Nhà quản lý y tế và hoạch định chính sách bảo hiểm y tế: Cung cấp số liệu phân bố dịch tễ thực tế tại Việt Nam để dự toán ngân sách chi trả thuốc kháng virus và xây dựng hướng dẫn chẩn đoán, điều trị chuẩn quốc gia.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao bắt buộc phải xác định kiểu gen HCV trước khi bắt đầu điều trị?

Kiểu gen HCV quyết định trực tiếp đến độ nhạy cảm của virus với thuốc, thời gian liệu trình và khả năng thành công của điều trị. Kiểu gen 1 chỉ đạt tỷ lệ đáp ứng khoảng 18,1% và cần điều trị 48 tuần, trong khi kiểu gen 6 và kiểu gen 2 đạt tỷ lệ đáp ứng tới 54,9% với liệu trình 24 tuần. Xác định đúng kiểu gen giúp ngăn ngừa tình trạng điều trị kéo dài không cần thiết hoặc thất bại điều trị.

Nguyên nhân nào khiến kỹ thuật Real-time RT-PCR vùng 5'NC dễ nhầm lẫn giữa kiểu gen 1 và kiểu gen 6?

Vùng 5'NC là đoạn gen có mức độ bảo tồn rất cao giữa các chủng virus nhằm duy trì cấu trúc không gian cho quá trình dịch mã. Sự khác biệt về trình tự nucleotide giữa kiểu gen 1 và các biến thể của kiểu gen 6 tại vùng này rất nhỏ, khiến mẫu dò Taqman probe dễ xảy ra phản ứng chéo, dẫn đến tỷ lệ chẩn đoán nhầm lên đến 40,74%.

Kỹ thuật giải trình tự gen NS5B có ưu điểm và giới hạn kỹ thuật gì?

Ưu điểm lớn nhất của giải trình tự đoạn NS5B là độ chính xác tuyệt đối, phân định chi tiết đến từng phân nhóm (1a, 1b, 6a, 6e, 6k...) và khắc phục hoàn toàn sự nhầm lẫn giữa type 1 và type 6. Tuy nhiên, giới hạn của phương pháp là chi phí cao, đòi hỏi trang thiết bị giải trình tự hiện đại và chỉ thực hiện được khi tải lượng virus đạt trên 1,0x10^3 copies/ml.

Ngưỡng tải lượng virus tối thiểu để thực hiện xét nghiệm định kiểu gen HCV là bao nhiêu?

Đối với kỹ thuật Real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman probe, ngưỡng tải lượng virus tối thiểu là 1,0x10^2 copies/ml. Đối với kỹ thuật giải trình tự gen Sanger đoạn NS5B, nồng độ virus cần đạt từ 1,0x10^3 copies/ml trở lên để đảm bảo phản ứng khuếch đại và đọc trình tự chính xác.

Tỷ lệ phân bố các kiểu gen HCV tại miền Bắc Việt Nam qua nghiên cứu này như thế nào?

Trong số 228 bệnh nhân được khảo sát, kiểu gen 1 chiếm tỷ lệ áp đảo với 66,23%, tiếp theo là kiểu gen 6 chiếm 30,70%, kiểu gen 2 chiếm tỷ lệ nhỏ 2,19% và không ghi nhận ca bệnh nào nhiễm kiểu gen 3. Nhóm tuổi từ 30 đến 49 chiếm tới hơn 62% tổng số ca nhiễm virus.

Kết luận

• Luận văn đã xác định cấu trúc phân bố kiểu gen HCV tại miền Bắc Việt Nam với ưu thế tuyệt đối thuộc về kiểu gen 1 (66,23%) và kiểu gen 6 (30,70%), trong khi kiểu gen 2 chỉ chiếm 2,19% và kiểu gen 3 hoàn toàn không xuất hiện.
• Nghiên cứu chỉ ra tỷ lệ nhiễm HCV mạn tính chiếm tới 95,4% ở nhóm bệnh nhân có kháng thể Anti-HCV dương tính, tập trung chủ yếu ở nam giới (71,55%) và độ tuổi lao động từ 21 đến 59 tuổi (chiếm hơn 90%).
• Phát hiện đột phá của đề tài là tỷ lệ nhầm lẫn đáng kể lên tới 40,74% giữa kiểu gen 1 và kiểu gen 6 khi chỉ sử dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR trên vùng 5'NC, khẳng định vai trò kiểm chứng không thể thay thế của kỹ thuật giải trình tự gen trên đoạn NS5B.
• Đề xuất áp dụng quy trình chẩn đoán kết hợp hai bước giúp tối ưu hóa thời gian điều trị từ 48 tuần xuống 24 tuần cho bệnh nhân kiểu gen 6, tiết kiệm chi phí và nâng cao tỷ lệ khỏi bệnh.
• Các nhà nghiên cứu và cơ sở y tế cần tiếp tục mở rộng quy mô giải trình tự gen trên toàn quốc nhằm hoàn thiện bản đồ dịch tễ học phân tử HCV và cập nhật các hướng dẫn điều trị chuẩn xác cho người bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan do virut C là có ảnh hưởng lớn đến tình trạng sức khỏe của con người trên toàn thế giới , bởi vì sau khi bị nhiễm virus viêm gan C cấp tính thì có khoảng 70-90% bệnh nhân chuyển từ giai đoạn cấp tính sang giai đoạn mạn tính và có tới 20-25% trong số bệnh nhân này sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan và ung thư gan [17,33,36]. Theo tổ chức y tế thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm virut viêm gan C (HCV), tương ứng với khoảng 2-3% tổng dân số toàn thế giới [14,26].Theo ghi nhận về tình hình nhiễm virut viêm gan C ở Việt Nam thì tỉ lệ người bình thường bị nhiễm căn bệnh này là khoảng 6% [42], xem như là thuộc nhóm các quốc gia có tỉ lệ nhiễm viêm gan C cao trên thế giới [13,42]. HCV là một virut có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virut phải sử dụng men ARN polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50] và con đường lây nhiễm chủ yếu của HCV là qua đường máu. Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian điều trị cần thiết là định lượng số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) [1,37].

Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa lý, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen nổi trội riêng [41,43]. Hiện nay trên thế giới đã biết được 6 loại genotypes và khoảng hơn 50 subtype (dưới type)[3,7], ở Việt Nam phổ biến genotypes 1,2, và 6, kiểu genotype 3 hiếm gặp [1,50]. Để xác định được genotypes HCV thì ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử đã phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes HCV với độ chính xác cao.

Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên chưa được áp dụng rộng rãi. Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing). Kỹ thuật Sequencing trong chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên cứu. Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm PCR do dễ thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6.

Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với những mục tiêu như sau : 1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe. 2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn gen NS5B. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV) 1.

Lịch sử nghiên cứu và phân loại Vào năm 1970, Harvey J.Alter Trưởng khoa nhiễm trùng của bộ phận truyền máu Viện Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ chứng minh là nhiễm virut sau truyền máu phần lớn là do virut viêm gan không phải là A và cũng không phải là B và được đặt tên là virut không A-không B.Mười bảy năm sau (năm 1987) Michael Houghton, Qui-lim Choo và tập đoàn, Gorge K dung sinh học phân tử định clon để định tính virus không A không B , năm 1989 đã xác định virut không A không B có tên chính thức là virut viêm gan C và được công bố bằng 2 bài trên báo Science[7]. Virus viêm gan C ( Hepatitis C virus - HCV) thuộc nhóm IV (+ssARN) virus ARN. Họ Flaviridae, cùng họ với virus Dengue, Flavivirus West Nile, virus tiêu chảy ở bò ( Bovine viral diarrhea - BVDV). Thuộc loài Hepacivirus[4,8,9].

Virut Viêm gan C hiện nay được xem là nguyên nhân phổ biến nhất gây bệnh viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát [6,12]. Hình thái cấu trúc virut viêm gan C Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát hiện HCV có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1 Hình thái của HCV dƣới kính hiển vi điện tử 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein và màng vỏ (Hình 1. Màng vỏ glycoprotein Core Màng vỏ ARN virus Kích thước khoảng 60nm Hình 1. Cấu trúc của virut viêm gan C 1.

Genome HCV Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính phân cực dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa diện đều và gói lại bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb. Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut khác, tổ chức genome của virut viêm gan C cũng mang vai trò như một ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein của virut [17,40,47]. Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm: - Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo nuclecapsit. - Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33.

- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70. Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm: 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học - Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23). - Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72). - Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa cho protein p27.

- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép. Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading frame), mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1. Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt bởi enzyme virut giống như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) và bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31]. Một protein khác (kí hiệu F-Temed) hoặc ARF (khung đọc thay thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế riboxome trong quá trình sao chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46].

Cấu trúc Không cấu trúc Tổng hợp chuỗi polyprotein Protein Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica và ARN-polymerase Hình 1.3: Tổ chức genome HCV 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là E1,E2 được đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã hóa cho các protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1. Các protein cấu trúc là hợp phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết với virut xong lại cùng nằm trong quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50]. ORF (Open reading frame) được cố định ở các vùng không bị mã hóa là vùng 5’ và vùng 3’ (NCRs- Noncoding regions) bao gồm các chuỗi nucleotit có liên quan đến sự điều chỉnh quá trình sao chép của virut. Tất cả các NCR đều có chứa các vùng miền bảo tồn cao so với các vùng protein mã hóa của genome HCV.

Mức độ chuyển hóa cao của các NCRs làm cho chúng thành mục tiêu nghiên cứu: + Nâng cao chất lượng việc chẩn đoán phân tử. + Nghiên cứu cho việc điều trị kháng virut. + Nghiên cứu kháng sinh chống HCV. Phần 5’ NCR có khoảng 341 nucleotit và nó có một cấu trúc phức thứ hai với bốn vùng khác nhau (I-IV) [30], 125 nucleotit đầu tiên của 5’ NCR được phân ba đều ra các vùng I và II là phần cơ bản của quá trình sao chép ARN trong virut [ 21,52].

Chuỗi 3’ NCR có chứa ba vùng chức năng khác nhau: một vùng có thể thay đổi, một chuỗi U/UC có chiều dài thay đổi và đuôi X đã chuyển đổi ở mức độ cao tại đuôi 3’ của hệ gen HCV, vùng thay đổi có chứa khoảng 40 nucleotit và không quan trọng đối với quá trình sao chép ARN. Tuy nhiên nếu bỏ đi chuỗi này có thể dẫn đến việc giảm sút đáng kể hiệu quả của quá trình sao chép[21]. Chiều dài của chuỗi vùng U/UC thay đổi theo các chuỗi HCV khác nhau và nằm trong khoảng từ 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 30- 80 nucleotit [35]. Chiều dài nhỏ nhất trong vùng này đối với quá trình sao chép ARN được cho là có chứa 26 nucleotit homouridine trong môi trường tế bào [22,49].

Đuôi X với mức chuyển hóa cao có khoảng 98 nucleotit có chứa ba stem-loops (SL1-SL3) [23] và quá trình tiêu hủy hoặc thay thế nucleotit trong các vùng này thường không gây tử vong [23]. Một cách gọi tên khác của quá trình tương tác giữa đuôi 3’ X và SL2 là “ kissing-loop” và một phần phức hợp của vùng mã hóa NS5B đã được mô tả [23,35]. Sự tương tác này bao gồm một cấu trúc ARN tertiary của genome HCV, đây chính là phần quan trọng của quá trình sao chép HCV trong hệ thống môi trường tế bào [23,49].