ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan do virut C là có ảnh hưởng lớn đến tình trạng sức khỏe của con người trên toàn thế giới , bởi vì sau khi bị nhiễm virus viêm gan C cấp tính thì có khoảng 70-90% bệnh nhân chuyển từ giai đoạn cấp tính sang giai đoạn mạn tính và có tới 20-25% trong số bệnh nhân này sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan và ung thư gan [17,33,36]. Theo tổ chức y tế thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm virut viêm gan C (HCV), tương ứng với khoảng 2-3% tổng dân số toàn thế giới [14,26].Theo ghi nhận về tình hình nhiễm virut viêm gan C ở Việt Nam thì tỉ lệ người bình thường bị nhiễm căn bệnh này là khoảng 6% [42], xem như là thuộc nhóm các quốc gia có tỉ lệ nhiễm viêm gan C cao trên thế giới [13,42]. HCV là một virut có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virut phải sử dụng men ARN polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50] và con đường lây nhiễm chủ yếu của HCV là qua đường máu. Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian điều trị cần thiết là định lượng số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) [1,37].
Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa lý, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen nổi trội riêng [41,43]. Hiện nay trên thế giới đã biết được 6 loại genotypes và khoảng hơn 50 subtype (dưới type)[3,7], ở Việt Nam phổ biến genotypes 1,2, và 6, kiểu genotype 3 hiếm gặp [1,50]. Để xác định được genotypes HCV thì ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử đã phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes HCV với độ chính xác cao.
Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên chưa được áp dụng rộng rãi. Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing). Kỹ thuật Sequencing trong chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên cứu. Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm PCR do dễ thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6.
Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với những mục tiêu như sau : 1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe. 2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn gen NS5B. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV) 1.
Lịch sử nghiên cứu và phân loại Vào năm 1970, Harvey J.Alter Trưởng khoa nhiễm trùng của bộ phận truyền máu Viện Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ chứng minh là nhiễm virut sau truyền máu phần lớn là do virut viêm gan không phải là A và cũng không phải là B và được đặt tên là virut không A-không B.Mười bảy năm sau (năm 1987) Michael Houghton, Qui-lim Choo và tập đoàn, Gorge K dung sinh học phân tử định clon để định tính virus không A không B , năm 1989 đã xác định virut không A không B có tên chính thức là virut viêm gan C và được công bố bằng 2 bài trên báo Science[7]. Virus viêm gan C ( Hepatitis C virus - HCV) thuộc nhóm IV (+ssARN) virus ARN. Họ Flaviridae, cùng họ với virus Dengue, Flavivirus West Nile, virus tiêu chảy ở bò ( Bovine viral diarrhea - BVDV). Thuộc loài Hepacivirus[4,8,9].
Virut Viêm gan C hiện nay được xem là nguyên nhân phổ biến nhất gây bệnh viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát [6,12]. Hình thái cấu trúc virut viêm gan C Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát hiện HCV có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1 Hình thái của HCV dƣới kính hiển vi điện tử 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein và màng vỏ (Hình 1. Màng vỏ glycoprotein Core Màng vỏ ARN virus Kích thước khoảng 60nm Hình 1. Cấu trúc của virut viêm gan C 1.
Genome HCV Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính phân cực dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa diện đều và gói lại bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb. Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut khác, tổ chức genome của virut viêm gan C cũng mang vai trò như một ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein của virut [17,40,47]. Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm: - Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo nuclecapsit. - Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33.
- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70. Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm: 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học - Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23). - Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72). - Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa cho protein p27.
- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép. Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading frame), mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1. Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt bởi enzyme virut giống như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) và bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31]. Một protein khác (kí hiệu F-Temed) hoặc ARF (khung đọc thay thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế riboxome trong quá trình sao chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46].
Cấu trúc Không cấu trúc Tổng hợp chuỗi polyprotein Protein Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica và ARN-polymerase Hình 1.3: Tổ chức genome HCV 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là E1,E2 được đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã hóa cho các protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1. Các protein cấu trúc là hợp phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết với virut xong lại cùng nằm trong quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50]. ORF (Open reading frame) được cố định ở các vùng không bị mã hóa là vùng 5’ và vùng 3’ (NCRs- Noncoding regions) bao gồm các chuỗi nucleotit có liên quan đến sự điều chỉnh quá trình sao chép của virut. Tất cả các NCR đều có chứa các vùng miền bảo tồn cao so với các vùng protein mã hóa của genome HCV.
Mức độ chuyển hóa cao của các NCRs làm cho chúng thành mục tiêu nghiên cứu: + Nâng cao chất lượng việc chẩn đoán phân tử. + Nghiên cứu cho việc điều trị kháng virut. + Nghiên cứu kháng sinh chống HCV. Phần 5’ NCR có khoảng 341 nucleotit và nó có một cấu trúc phức thứ hai với bốn vùng khác nhau (I-IV) [30], 125 nucleotit đầu tiên của 5’ NCR được phân ba đều ra các vùng I và II là phần cơ bản của quá trình sao chép ARN trong virut [ 21,52].
Chuỗi 3’ NCR có chứa ba vùng chức năng khác nhau: một vùng có thể thay đổi, một chuỗi U/UC có chiều dài thay đổi và đuôi X đã chuyển đổi ở mức độ cao tại đuôi 3’ của hệ gen HCV, vùng thay đổi có chứa khoảng 40 nucleotit và không quan trọng đối với quá trình sao chép ARN. Tuy nhiên nếu bỏ đi chuỗi này có thể dẫn đến việc giảm sút đáng kể hiệu quả của quá trình sao chép[21]. Chiều dài của chuỗi vùng U/UC thay đổi theo các chuỗi HCV khác nhau và nằm trong khoảng từ 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 30- 80 nucleotit [35]. Chiều dài nhỏ nhất trong vùng này đối với quá trình sao chép ARN được cho là có chứa 26 nucleotit homouridine trong môi trường tế bào [22,49].
Đuôi X với mức chuyển hóa cao có khoảng 98 nucleotit có chứa ba stem-loops (SL1-SL3) [23] và quá trình tiêu hủy hoặc thay thế nucleotit trong các vùng này thường không gây tử vong [23]. Một cách gọi tên khác của quá trình tương tác giữa đuôi 3’ X và SL2 là “ kissing-loop” và một phần phức hợp của vùng mã hóa NS5B đã được mô tả [23,35]. Sự tương tác này bao gồm một cấu trúc ARN tertiary của genome HCV, đây chính là phần quan trọng của quá trình sao chép HCV trong hệ thống môi trường tế bào [23,49].