Đặt vấn đề Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa.
Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, …thì một số dòng E. coli độc có thể gây bệnh trên người và một số loài động vật. Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E. coli thành nhiều nhóm.
Mỗi nhóm đều có những yếu tố độc lực khác nhau và được quy định bởi những gen độc lực khác nhau. Một số gen độc lực quan trọng của E. coli như: gen ehxA, stx1, stx2, và uid của nhóm STEC (Shiga toxigenic E. coli); gen eae của nhóm STEC và EPEC (Enteropathogenic E.
coli); … Nhìn chung, E. coli có thể được phân lập dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường ô nhiễm phân. coli còn có thể phân lập được từ những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm hữu cơ; vi sinh vật này có thể tồn tại và phát triển rất lâu trong môi trường. Với sự phân bố rộng rãi như vậy, E.
coli dễ dàng vấy nhiễm vào nguyên liệu thức ăn hay nguồn nước nếu quy trình sản xuất không đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt. Từ đó, có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hóa, và nhiễm trùng đường tiết niệu, có trường hợp gây tử vong cho người và gia súc. Do vậy, việc xác định các gen độc lực của E. coli trong phân gia súc bình thường hoặc tiêu chảy là cần thiết, góp phần trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật và đánh giá nguy cơ truyền lây sang người qua con đường thực phẩm.
Từ đó, có những biện pháp phòng ngừa hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người và vật nuôi. Những tiến bộ của công nghệ sinh học hiện nay với phương pháp PCR sẽ giúp chúng ta chẩn đoán chính xác, hiệu quả trong thời gian ngắn hơn so với phương pháp truyền thống (nuôi cấy, phân lập, …). Vì vậy, đề tài tiến hành sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E. coli phân 2 lập được từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò.
Hy vọng trong tương lai, đề tài sẽ được ứng dụng vào thực tiễn chẩn đoán và tầm soát bệnh cho gia súc cũng như cho con người qua con đường thực phẩm. Mục tiêu – yêu cầu 1. Mục tiêu - Phát hiện gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA và uid của E. coli, đặc biệt là nhóm STEC.
Yêu cầu - Phân lập được E. coli từ phân, thịt trên một số loại môi trường chọn lọc (MAC, SMAC, CT - SMAC). - Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR phát hiện một số gen độc lực của E. coli phân lập được.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. coli Vi khuẩn E. coli sống bình thường trong ruột người và động vật, nhiều nhất trong ruột già. Vi khuẩn theo phân ra môi trường bên ngoài gây ô nhiễm cho nước, đất, không khí, dụng cụ giết mổ, các nguyên liệu sử dụng trong chế biến thực phẩm, … 2.
Đặc điểm sinh học Phân loại: vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia. Hình thái: là trực khuẩn, gram âm, di động, không bào tử, giáp mô, có lông tơ xung quanh. Kích thước: khoảng 0,5 m 2 – 3 m.
Đặc tính nuôi cấy: vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi. Có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 15 - 400C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37 0C, pH từ 6,4 – 7,4. Mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, trắng đục, khoảng 2 – 3 mm. Đặc tính sinh hóa: E.
coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrate thành nitrite. coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng thử nghiệm IMViC. coli cho kết quả IMViC là: + + - - hay - + - - (FAO, 1992). Yếu tố kháng nguyên Vi khuẩn đường ruột E.
coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Dựa vào tính chất kháng nguyên, người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết thanh (serotype) khác nhau (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, 1996): Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của kháng nguyên O là: Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2 giờ.
Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%. 4 Bị hủy bởi formol 5%. Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết O.
Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết H. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có hơn 100 loại khác nhau và nằm ngoài kháng nguyên O.
Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein. Nếu kháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn thì sẽ ngăn cản phản ứng ngưng kết O. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu.
Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): có dạng hình sợi, dài khoảng 4 m, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 – 7 nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó, người ta có thể định danh vi khuẩn.
coli Để phân loại E. coli gây bệnh, người ta dựa vào đặc điểm sinh bệnh như: gen độc lực mã hóa các protein gây bệnh cho vật chủ, sự tác động khác nhau lên màng nhầy ruột, hội chứng lâm sàng và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh. coli gây bệnh (Keskimaki, 2001): (1) E. coli sinh độc tố Shiga (STEC- Shiga toxigenic E.
coli hay VTEC- Verotoxigenic E. coli và EHEC Enterohemorrhagic E. coli gây bệnh đường ruột (EPEC- Enteropathogenic E. coli sinh độc tố đường ruột (ETEC- Enterotoxigenic E.
coli bám dính kết tập ở ruột (EAEC hay EaggEC- Enteroaggregative E. coli tấn công hay xâm lấn đường ruột (EIEC- Enteroinvasive E. coli (STEC) Nhóm STEC được kết tội là liên quan đến nhiều đợt dịch bệnh viêm dạ dày, đã và đang đe dọa sức khỏe cộng đồng. Vào những năm đầu thập niên 1980, các dòng STEC gây ra những đợt dịch liên quan đến hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS).
HUS biểu hiện ba triệu chứng điển hình là suy thận cấp, giảm tiểu cầu và thiếu máu tan huyết do tổn thương mao mạch. Bao gồm nhiều serotype khác nhau như O26, O111, O113, O124, O145, O157, … (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, 1996). Hiện nay, người ta công nhận các dòng STEC gây bệnh nghiêm trọng cho con người, đặc biệt O157:H7 là serotype chính của STEC gây nhiều ổ dịch lớn trên khắp thế giới (Smith và ctv, 1988).
Thuật ngữ Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những thuật ngữ khác nhau để gọi tên cho nhóm E. Thuật ngữ Verotoxigenic E. coli hay Verocytotoxigenic E. Thuật ngữ Enterohemorrhagic E.
coli ( EHEC) chỉ những dòng E. coli gây HC và HUS (Nataro và Kaper, 1998). Và thuật ngữ Shiga toxin-producing E. coli (STEC) chỉ những serotype E.
coli sản sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố của vi khuẩn Shigella (Calderwood và ctv, 1996). STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau, và cả hai đều đề cập đến E. coli sản sinh một hay nhiều độc tố gây độc tế bào. Tuy nhiên, không phải chỉ có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác.
coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một hay vài yếu tố độc lực khác của STEC (Beutin và ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998). Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC 2. Độc tố Shiga (Stx) Shigella dysenteriae do Kiyoshi Shiga phát hiện năm 1897, sản sinh độc tố thường được gọi là Shiga.
Và sau này người ta phát hiện ở STEC cũng sản xuất độc tố tác động tương tự như Shiga (Shiga-like toxin) (Nataro và Kaper, 1998). Stx là một ngoại độc tố không bền với nhiệt, tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh trung ương. coli gây tiêu chảy, đồng thời ức chế hấp thu đường và các axit amin ở ruột non. Ở hệ thần kinh, nó gây biểu hiện lâm sàng trầm trọng có thể tử vong (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp.
Hồ Chí Minh, 1996). Trong số hơn 200 serotype E. coli có thể sản sinh độc tố Stx thì có hơn 50 serotype gây HC hay HUS ở người (Nataro và Kaper, 1998). Cấu trúc và tổ chức các gen stx: họ độc tố Stx ở STEC gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2.
Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều biến chủng như Stx2c, Stx2hp, Stx2e. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1 hay Stx2, hoặc cả Stx1 lẫn Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2. Những nghiên cứu đầu thập niên 80 đã xác định Stx1 và Stx2 được mã hóa trên thực khuẩn thể và thực khuẩn thể này chèn vào nhiễm sắc thể của E.1 Danh pháp các thành viên trong họ Stx Tên gọi hiện nay Tên gọi trước đây Gen Protein Shiga toxin (Stx) stx Stx Shiga like toxin I (SLT_I) hay Verotoxin 1 (VT1) stx1 Stx1 SLT_II hay VT2 stx2 Stx2 STL_II c hay VT2c stx2c Stx2c STL_II e hay VT2e stx2e Stx2e (Nguồn: Calderwood và ctv, 1996) 7 Tất cả độc tố Stx đều gồm hai thành phần cấu tạo (Paton và Paton, 1998): - Tiểu đơn vị A , 32 kDa, gồm peptide A 1 28 kDa và peptide A2 4 kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfit. Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B.