Luận án: Ứng dụng kỹ thuật công nghệ sinh học trong nhân giống cây kiwi tại Lâm Đồng

Công nghệ sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc nhân giống cây kiwi, đặc biệt tại Lâm Đồng. 144 trang · Học viện Khoa học và Công nghệ · 2022.

• Tác giả: Nguyễn Thị Mỹ Hạnh
• Người hướng dẫn: GS. Dương Tấn Nhựt
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
• Đề tài: Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Nhân Giống Cây Kiwi Tại Lâm Đồng
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• Lý do chọn đề tài
• Mục tiêu, yêu cầu của đề tài
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
• Đối tượng nghiên cứu của đề tài
• Phạm vi nghiên cứu của đề tài
• Ý nghĩa khoa học
• Ý nghĩa thực tiễn
• Những đóng góp mới của luận án
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về cây Kiwi
• 1.1.1. Phân bố cây Kiwi
• 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của trái Kiwi
• 1.1.3. Giá trị kinh tế
• 1.2. Các kỹ thuật nhân giống Kiwi
• 1.2.1. Nhân giống bằng phương pháp truyền thống
• 1.2.1.1. Giâm cành bánh tẻ
• 1.2.2. Vi nhân giống cây Kiwi
• 1.2.2.1. Giới thiệu chung
• 1.2.2.2. Ứng dụng vi nhân giống một số đối tượng Kiwi
• 1.3. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào
• 1.3.1. Giới thiệu chung
• 1.3.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong vi nhân giống một số đối tượng cây trồng
• 1.4. Phát sinh phôi soma
• 1.4.1. Giới thiệu chung
• 1.4.2. Ứng dụng phát sinh phôi soma trong vi nhân giống một số đối tượng cây trồng
• 1.5. Đánh giá đa dạng di truyền và xác định giới tính thực vật
• 1.5.1. Giới thiệu chung
• 1.5.2. Ứng dụng sinh học phân tử và phương pháp xác định giới tính ở một số đối tượng cây trồng
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Vật liệu thực vật
• 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất
• 2.1.2.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Nhận diện các loài Kiwi tại Việt Nam và xác định giới tính cây Kiwi dựa trên chỉ thị phân tử
• 2.2.2. Ứng dụng vi nhân giống cây Kiwi phục vụ công tác nhân giống
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 2.3.1.1. Nhận diện các loài Kiwi tại Việt Nam và xác định giới tính cây Kiwi dựa trên chỉ thị phân tử
• 2.3.1.2. Ứng dụng vi nhân giống cây Kiwi phục vụ công tác nhân giống
• 2.3.2. Phương pháp quan sát giải phẫu hình thái phát sinh phôi soma
• 2.3.3. Phương pháp ghi nhận số liệu
• 2.3.4. Môi trường nuôi cấy/trồng
• 2.3.5. Điều kiện nuôi cấy
• 2.3.6. Phân tích thống kê
• 2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Đánh giá đa dạng di truyền và xác định giới tính cây Kiwi dựa trên chỉ thị phân tử
• 3.1.1. PCR và giải trình tự DNA
• 3.1.2. Đánh giá, định danh, phân tích mối quan hệ di truyền của các mẫu cây Kiwi
• 3.1.2.1. Kết quả phân tích sự khác biệt giữa các trình tự rbcL của 19 mẫu Kiwi thu thập
• 3.1.2.2. Kết quả phân tích sự khác biệt giữa các trình tự matK của 16 mẫu Kiwi thu thập
• 3.1.2.3. Kết quả phân tích sự khác biệt giữa các trình tự ITS của 15 mẫu Kiwi thu thập
• 3.1.2.4. Vùng matK + ITS
• 3.1.2.5. Vùng rbcL + matK + ITS
• 3.2. Ứng dụng vi nhân giống cây Kiwi phục vụ công tác nhân giống
• 3.2.1. Tạo nguồn mẫu in vitro
• 3.2.1.1. Khử trùng bề mặt mẫu cấy và tái sinh chồi
• 3.2.1.2. Tăng sinh cụm chồi
• 3.2.2. Hiệu quả sự hình thành và phát sinh phôi soma của Kiwi từ gân lá chính và cuống lá thông qua công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL)
• 3.2.2.1. Phát sinh phôi vô tính thông qua nuôi cấy gân lá chính mv-tTCL và mv-lTCL
• 3.2.2.2. Phát sinh phôi vô tính thông qua nuôi cấy cuống lá p-tTCL và p-lTCL
• 3.2.2.3. Hệ số điều chỉnh tăng trưởng của phát sinh phôi vô tính
• 3.2.3. Ảnh hưởng của BA và TDZ lên quá trình tái sinh chồi
• 3.2.4. Ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ in vitro
• 3.2.5. Sự thích nghi và sự phát triển cây trong nhà kính
• 3.2.6. Sơ đồ quy trình vi nhân giống Kiwi thông qua phát sinh phôi vô tính của mẫu TCL (mv-tTCL và mv-lTCL) đối với mẫu cấy gân lá chính; (p-tTCL và p-lTCL) đối với mẫu cấy cuống lá)
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Công nghệ sinh học trong nhân giống cây kiwi

Công nghệ sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc nhân giống cây kiwi, đặc biệt tại Lâm Đồng. Các kỹ thuật như vi nhân giống và nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) được ứng dụng để tăng hiệu quả sản xuất cây giống. Công nghệ sinh học giúp tối ưu hóa quy trình nhân giống, đảm bảo chất lượng cây con và rút ngắn thời gian sản xuất. Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng các kỹ thuật hiện đại để phát triển cây kiwi tại Lâm Đồng, một vùng có tiềm năng lớn về nông nghiệp công nghệ cao.

1.1. Kỹ thuật vi nhân giống

Kỹ thuật vi nhân giống được sử dụng để tạo ra số lượng lớn cây con từ mẫu mô nhỏ. Phương pháp này giúp duy trì đặc tính di truyền của cây mẹ và tăng tốc độ nhân giống. Trong nghiên cứu, các mẫu mô từ cây kiwi được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng đặc biệt, kích thích sự phát triển của chồi và rễ. Kết quả cho thấy, vi nhân giống là công cụ hiệu quả để sản xuất cây giống chất lượng cao, phù hợp với điều kiện khí hậu và đất đai tại Lâm Đồng.

1.2. Nuôi cấy lớp mỏng tế bào TCL

Nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) là kỹ thuật tiên tiến được áp dụng để tạo ra các mẫu mô có khả năng tái sinh cao. Phương pháp này sử dụng các lớp tế bào mỏng từ gân lá và cuống lá của cây kiwi để kích thích sự hình thành phôi soma và chồi. Nghiên cứu đã chứng minh rằng, TCL không chỉ tăng hiệu suất nhân giống mà còn giúp cải thiện chất lượng cây con. Đây là bước đột phá trong việc phát triển cây kiwi tại Lâm Đồng, góp phần thúc đẩy nông nghiệp công nghệ cao.

II. Phát triển cây kiwi tại Lâm Đồng

Lâm Đồng là vùng đất lý tưởng để phát triển cây kiwi nhờ điều kiện khí hậu và đất đai phù hợp. Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng công nghệ sinh học để tối ưu hóa quy trình trồng và chăm sóc cây kiwi. Các biện pháp như nhân giống in vitro và sản xuất cây giống được áp dụng để đảm bảo năng suất và chất lượng trái. Lâm Đồng có tiềm năng trở thành trung tâm sản xuất kiwi hàng đầu tại Việt Nam, góp phần phát triển nông nghiệp công nghệ cao.

2.1. Đặc điểm cây kiwi

Cây kiwi có đặc điểm sinh trưởng và phát triển phù hợp với điều kiện khí hậu mát mẻ tại Lâm Đồng. Nghiên cứu đã xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây kiwi, bao gồm nhiệt độ, độ ẩm và chất lượng đất. Cây kiwi tại Lâm Đồng cho trái có chất lượng cao, giàu dinh dưỡng và có giá trị kinh tế lớn. Việc hiểu rõ đặc điểm cây kiwi giúp tối ưu hóa quy trình trồng trọt và chăm sóc, đảm bảo năng suất và chất lượng trái.

2.2. Thị trường cây kiwi

Thị trường cây kiwi tại Việt Nam đang có tiềm năng phát triển lớn, đặc biệt tại Lâm Đồng. Nghiên cứu đã phân tích nhu cầu thị trường và xu hướng tiêu dùng đối với kiwi. Kết quả cho thấy, kiwi Lâm Đồng có thể cạnh tranh với các sản phẩm nhập khẩu nhờ chất lượng cao và giá thành hợp lý. Việc phát triển thị trường cây kiwi không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn góp phần thúc đẩy nông nghiệp công nghệ cao tại địa phương.

III. Ứng dụng công nghệ trong sản xuất cây giống

Ứng dụng công nghệ trong sản xuất cây giống là yếu tố then chốt để phát triển cây kiwi tại Lâm Đồng. Nghiên cứu này tập trung vào việc sử dụng các kỹ thuật hiện đại như vi nhân giống và nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) để tăng hiệu quả sản xuất. Các biện pháp này giúp tạo ra số lượng lớn cây con chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường. Công nghệ nhân giống không chỉ rút ngắn thời gian sản xuất mà còn đảm bảo tính ổn định về mặt di truyền, góp phần phát triển bền vững cây kiwi tại Lâm Đồng.

3.1. Tăng năng suất cây kiwi

Tăng năng suất cây kiwi là mục tiêu chính của nghiên cứu này. Các kỹ thuật như vi nhân giống và nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) được áp dụng để cải thiện hiệu suất sản xuất. Kết quả cho thấy, việc sử dụng công nghệ sinh học giúp tăng số lượng cây con và cải thiện chất lượng trái. Tăng năng suất cây kiwi không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn góp phần phát triển nông nghiệp công nghệ cao tại Lâm Đồng.

3.2. Biện pháp nhân giống hiệu quả

Biện pháp nhân giống hiệu quả là yếu tố quan trọng để phát triển cây kiwi tại Lâm Đồng. Nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của các phương pháp như vi nhân giống và nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL). Kết quả cho thấy, các biện pháp này không chỉ tăng hiệu suất sản xuất mà còn đảm bảo tính ổn định về mặt di truyền. Biện pháp nhân giống hiệu quả giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất, góp phần phát triển bền vững cây kiwi tại Lâm Đồng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Cây Kiwi (chi Actinidia) là loài thực vật thân gỗ leo, đơn tính sống lâu năm, có giá trị dinh dưỡng cao và tiềm năng thương mại lớn. Chi Actinidia có phạm vi phân bố rộng và tính biến đổi sinh học phong phú với 54 loài và 75 phân loài. Hai loài có giá trị thương mại chủ yếu trên thế giới gồm Actinidia chinensis var. chinensis và Actinidia chinensis var. deliciosa. Do đặc tính dễ giao phấn tự nhiên giữa các loài trong chi, nguồn gốc phát sinh và mối quan hệ di truyền giữa các taxon trở nên phức tạp. Bên cạnh đó, cây Kiwi là loài đơn tính (hoa cái có hạt phấn lép không thụ tính, hoa đực có nhụy thoái hóa), dẫn đến việc không thể nhận diện giới tính ở giai đoạn cây con nếu chỉ dựa vào hình thái học bên ngoài cho đến khi cây ra hoa sau nhiều năm sinh trưởng.

Các phương pháp nhân giống truyền thống như gieo hạt, giâm cành hay ghép cành bộc lộ nhiều hạn chế về khả năng ra rễ, hệ số nhân giống thấp và tốn nhiều thời gian. Tại Việt Nam, mặc dù đã ghi nhận sự phân bố tự nhiên của cây Kiwi rừng ở Kon Tum và Lâm Đồng, các nghiên cứu chuyên sâu về đánh giá di truyền nguồn gen bản địa và nhập nội còn rất hạn chế. Đồng thời, các quy trình vi nhân giống cây Kiwi vàng (Actinidia chinensis) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (Thin Cell Layer - TCL) thông qua con đường phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis) chưa từng được công bố trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Xuất phát từ thực tế đó, luận án tiến sĩ sinh học của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Mỹ Hạnh với đề tài "Ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học trong nhân giống cây Kiwi tại Lâm Đồng" đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể gồm:

1. Đánh giá, định danh, phân tích mối quan hệ di truyền của Kiwi bằng kỹ thuật sinh học phân tử theo phương pháp mã vạch DNA (DNA barcode).
2. Ứng dụng kỹ thuật công nghệ sinh học nhằm xác định giới tính của cây Kiwi.
3. Ứng dụng vi nhân giống cây Kiwi nhằm đánh giá hiệu quả sự hình thành và phát sinh phôi soma của Kiwi từ gân lá chính và cuống lá thông qua công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) và tái sinh cây hoàn chỉnh phục vụ công tác sản xuất giống cây Kiwi tại Lâm Đồng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Tập đoàn gồm 20 mẫu cây Kiwi (Actinidia sp.), trong đó có 01 mẫu tự nhiên thu thập tại xã Đắk Long, huyện Kon Plông, tỉnh Kon Tum; 01 mẫu tự nhiên thu thập tại thôn Măng Lin, phường 7, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng; và 18 mẫu Kiwi thương mại nhập nội thu thập từ Trung tâm Phát triển giống cây trồng mới Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội (Trang trại cây giống Xuân Khương, thị trấn Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội).
• Phạm vi nội dung: Đánh giá quan hệ di truyền bằng các vùng mã vạch DNA (rbcL, matK, ITS), sàng lọc xác định giới tính đực/cái bằng chỉ thị phân tử SmY, thiết lập quy trình khử trùng, cảm ứng mô sẹo, phát sinh phôi soma qua kỹ thuật TCL (mv-tTCL, mv-lTCL, p-tTCL, p-lTCL), tái sinh chồi, tạo rễ in vitro và chuyển cây thích nghi ra vườn ươm.
• Phạm vi không gian và thời gian: Các thí nghiệm in vitro được thực hiện tại Phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên và Trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt; các phân tích sinh học phân tử được tiến hành tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP.HCM, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM và Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu mã số NCXS01.03/22-24 (giai đoạn 2022 - 2024), hoàn thành năm 2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế trên bốn nhóm nội dung chính:

Thứ nhất, về phân loại học, phân bố và giá trị dinh dưỡng của chi Actinidia: Các nghiên cứu của Ferguson (1984), Huang và cộng sự (2004) chỉ ra Trung Quốc là trung tâm đa dạng di truyền với hơn 54 loài. Nghiên cứu của Mark McNeilage (1987) đã lai tạo dòng A. chinensis 'Hort16A' (thương hiệu Zespri Gold) và sau đó Carputo cùng cộng sự (2000) chọn lọc dòng 'Zesy002' (Zespri SunGold) mang lại giá trị thương phẩm cao. Về dinh dưỡng, số liệu USDA (2018) và Richardson cùng cộng sự (2018) xác nhận hàm lượng vitamin C trong Kiwi vàng đạt 161,3 mg/100g (cao hơn đáng kể so với Kiwi xanh đạt 92,7 mg/100g), cùng hàm lượng folate (vitamin B9) đạt 25 - 31 µg/100g và alpha-tocopherol (vitamin E) đạt 1,46 - 1,51 mg/100g. Mapu và cộng sự (2019) ghi nhận giá trị kinh tế của vườn Kiwi vàng đạt từ 800.000 đến 1.000.000 USD/ha, gấp 2,5 lần so với giống Kiwi xanh (300.000 - 450.000 USD/ha).

Thứ hai, về công nghệ nhân giống truyền thống và vi nhân giống in vitro: Các tác giả Lawes (1990), Moncalean (2003) và Akbas (2007) đã phân tích những khó khăn khi nhân giống truyền thống bằng hạt (tỷ lệ ngủ nghỉ cao, đòi hỏi xử lý lạnh 4,4°C trong 6 - 8 tuần hoặc GA3 nồng độ 6.000 ppm) và giâm cành bánh tẻ (yêu cầu xử lý IBA 6.000 - 8.000 ppm nhưng tỷ lệ ra rễ dao động). Vi nhân giống trên A. deliciosa được khởi xướng bởi Harada (1975) từ mô phân sinh và chồi mầm. Các nghiên cứu tiếp theo của Ilczuk (2013) trên A. arguta, Liao (2019) trên A. chinensis 'Yangshi Jinhong 50', và Di Marco (2020) trên A. chinensis 'Zes006' sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng như BA, TDZ, zeatin và meta-Topolin (mT). Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt (2020) đã bước đầu khảo sát nuôi cấy tế bào đơn trên cây A. deliciosa.

Thứ ba, về kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) và phát sinh phôi soma: Kỹ thuật TCL do Tran Thanh Van khởi xướng năm 1973 và được Nhut cùng cộng sự (2003, 2013, 2019) mở rộng ứng dụng trên hơn 77 loài thực vật (như Begonia, Hedychium coronarium, Cattleya forbesii, Ficus carica, Ceropegia bulbosa, Cymbidium). Kỹ thuật cắt lớp mỏng ngang (tTCL) và cắt lớp mỏng dọc (lTCL) giúp giảm thể tích mô nội sinh, gia tăng sự tiếp xúc trực tiếp của các tế bào tổn thương với môi trường dinh dưỡng, giải phóng các chuỗi oligosaccharide cảm ứng mạnh mẽ quá trình biệt hóa mô và phát sinh cơ quan. Về phát sinh phôi soma, Oliveira và cộng sự (1992) trên A. deliciosa, Popielarska và cộng sự (2006) trên A. kolomikta, Kumar và cộng sự (2015) trên Sapindus trifoliatus, Liu và cộng sự (2020) trên Litchi chinensis đã chứng minh vai trò cảm ứng quyết định của 2,4-D trong việc phân cực tế bào và hình thành phôi vô tính qua các giai đoạn hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và hình lá mầm.

Thứ tư, về chỉ thị phân tử mã vạch DNA và xác định giới tính: Paul Hebert (2003) đề xuất phương pháp DNA barcoding; Hiệp hội Mã vạch Sự sống (CBOL, 2009) phê chuẩn tổ hợp gen lục lạp matK + rbcL, cùng với đoạn đệm phiên mã nhân ITS (Chen et al., 2010; Li et al., 2015). Về xác định giới tính, chi Actinidia có cơ chế di truyền giới tính hệ XY (cây đực XY, cây cái XX). Các công trình của Shirkot (2002), Atak (2014), Cipriani (2018) và Tahir (2020) đã phát hiện các chỉ thị phân tử gắn liền với nhiễm sắc thể Y như SmY (SmY1) và SyGl, cho phép khuếch đại phân đoạn DNA đặc hiệu ở cây đực bằng phản ứng PCR.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết:

• Đánh giá có hệ thống mối quan hệ di truyền của nguồn gen Kiwi tự nhiên thu thập tại Kon Tum, Lâm Đồng và các giống thương mại nhập nội dựa trên tập hợp đa locus mã vạch DNA (rbcL, matK, ITS).
• Ứng dụng chỉ thị phân tử SmY1 để nhận diện chính xác giới tính cây Kiwi ở giai đoạn vườn ươm trước khi đưa vào nhân giống.
• Thiết lập hoàn chỉnh quy trình công nghệ vi nhân giống cây Kiwi vàng (A. chinensis) thông qua con đường phát sinh phôi soma từ lát cắt mỏng tế bào gân lá chính (mv-TCL) và cuống lá (p-TCL) - một hướng tiếp cận hoàn toàn mới chưa từng được nghiên cứu trên đối tượng này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích:

• Lý thuyết mã vạch DNA (DNA Barcoding): Dựa trên tính bảo tồn và tốc độ tiến hóa khác nhau của các vùng gen lạp thể (rbcL, matK) và vùng đệm phiên mã nhân (ITS), cho phép so sánh mức độ tương đồng chuỗi nucleotide với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) để định danh taxon và xây dựng cây phát sinh chủng loại.
• Cơ chế di truyền xác định giới tính ở thực vật đơn tính: Dựa trên sự hiện diện của đoạn trình tự đặc hiệu trên nhiễm sắc thể Y ở cây đực (yếu tố quyết định giới tính đực SmY), sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt để nhận diện kiểu gen đực (XY) phân biệt với kiểu gen cái (XX).
• Lý thuyết phát sinh hình thái in vitro và công nghệ lớp mỏng tế bào (TCL): Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào soma thực vật dưới tác động phối hợp giữa tổn thương cơ học mô cấy và tỷ lệ cân bằng auxin/cytokinin ngoại sinh (2,4-D, NAA, TDZ, BA), định hướng tế bào phân chia tạo cấu trúc phôi vô tính lưỡng cực độc lập với hệ mạch mô mẹ.

Phương pháp nghiên cứu thực tế:

• Phương pháp sinh học phân tử:

  • Tách chiết DNA tổng số: Áp dụng quy trình CTAB cải tiến (sử dụng 50 mg mô lá non, dung dịch đệm CTAB 2% bổ sung PVP 2%, ủ nhiệt 65°C trong 60 phút, xử lý enzym RNAase ở 37°C trong 5 phút, chiết tách bằng hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol tỷ lệ 24:1, tủa DNA bằng ethanol tuyệt đối và dung dịch NaCl 5M ở điều kiện lạnh).
  • Kiểm tra chất lượng DNA: Đo nồng độ và độ tinh sạch (tỷ lệ hấp thụ quang phổ A260/A280) bằng máy đo quang phổ NanoDrop OneC và BioDrop µLITE.
  • Phản ứng PCR khuếch đại chuỗi DNA: Sử dụng DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) hoặc MyTaq Mix (Bioline), thực hiện trên máy luân nhiệt Eppendorf. Chu trình nhiệt được tối ưu hóa cho từng cặp mồi: rbcL (nhiệt độ bắt cặp Ta = 53°C), matK (Ta = 49°C), ITS (Ta = 54°C), và SmY1 (Ta = 55°C, 35 chu kỳ).
  • Điện di và giải trình tự: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2% - 1,5% trong đệm TAE 0,5X, nhuộm ethidium bromide hoặc GelRed, chụp ảnh trên hệ thống GelDoc-It 2315 UVP. Giải trình tự chuỗi hai chiều tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc).
  • Phân tích tin sinh học: Chỉnh sửa trình tự nucleotide bằng phần mềm ATGC; phân tích độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên NCBI; xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbor-Joining / Maximum Likelihood bằng phần mềm MEGA 7.0 với hệ số lặp lại bootstrap 1.000 lần.

• Phương pháp nuôi cấy mô tế bào và phát sinh hình thái:

  • Khử trùng mẫu cấy: Mẫu lá non được rửa sạch dưới vòi nước chảy, xử lý bằng dung dịch Sunlight 20% (10 phút), cồn 70% (30 giây), sau đó khảo sát so sánh giữa các tác nhân khử trùng bề mặt gồm nano bạc (AgNPs nồng độ 100, 200, 300, 500 ppm), HgCl2 (1 g/L) và NaOCl (10 g/L) trong thời gian 8 phút có bổ sung chất bám dính Tween-80.
  • Cảm ứng mô sẹo và tạo nguồn mẫu in vitro: Mẫu lá sạch (kích thước 0,5 × 1,0 cm chứa gân chính) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,8 mg/L 2,4-D.
  • Khảo sát tăng sinh cụm chồi: Cấy cụm 3 chồi in vitro lên môi trường MS bổ sung dịch chiết chuối xanh và dịch chiết khoai tây ở các tỷ lệ thể tích 5%, 10%, 15%, 20% (v/v).
  • Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL): Cắt lát mỏng theo chiều ngang (tTCL) và chiều dọc (lTCL) từ nguồn mẫu in vitro gồm gân lá chính (mv-tTCL, mv-lTCL) và cuống lá (p-tTCL, p-lTCL) với kích thước định lượng, nuôi cấy trên môi trường phát sinh phôi MSE (MS bổ sung 0,02 mg/L NAA; 0,5 mg/L TDZ; 30 g/L sucrose; 8 g/L agar), đối chứng là đoạn gân lá và cuống lá nguyên khối (1 × 10 mm).
  • Tái sinh chồi và tạo rễ: Khảo sát ảnh hưởng của các cytokinin (BA, TDZ) lên sự nảy mầm của phôi soma; khảo sát ảnh hưởng của auxin (NAA) lên khả năng cảm ứng ra rễ in vitro.
  • Thuần hóa cây con ex vitro: Chuyển cây con in vitro hoàn chỉnh ra nhà kính, trồng trên các công thức phối trộn giá thể gồm đất mùn (HM), xơ dừa (CF) và phân bón vi sinh (BF) ở các tỷ lệ khác nhau.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp các cơ sở lý luận và tài liệu khoa học về vị trí phân loại, nguồn gốc địa lý, đặc tính hình thái học của chi Actinidia. Tác giả phân tích chi tiết giá trị sinh học và kinh tế của trái Kiwi, tổng hợp các số liệu so sánh thành phần dinh dưỡng giữa hai giống thương mại chính dựa trên cơ sở dữ liệu chuẩn USDA (2018):

Thành phần dinh dưỡng	Đơn vị tính / 100g	Kiwi xanh (A. deliciosa - Hayward)	Kiwi vàng (A. chinensis - SunGold)
Canxi (Ca)	mg	34	17,0
Sắt (Fe)	mg	0,31	0,21
Magie (Mg)	mg	17	12,0
Photpho (P)	mg	34	25
Kali (K)	mg	312	315
Natri (Na)	mg	3	3
Vitamin C	mg	92,7	161,3
Vitamin B1 (Thiamine)	mg	0,027	< 0,01
Vitamin B2 (Riboflavin)	mg	0,025	0,074
Vitamin B3 (Niacin)	mg	0,341	0,231
Vitamin B5 (Pantothenic acid)	mg	0,183	0,12
Vitamin B6	mg	0,063	0,079
Vitamin B9 (Folate)	µg, DFE	25	31,0
Vitamin B12	µg	0	0,08
Vitamin A	IU	87	23
Vitamin E (α-tocopherol)	mg	1,46	1,51
Vitamin K	µg	40,3	6,1
Mã số tham chiếu USDA NDB	-	No. 09148	No. 09520

Chương này cũng tổng thuật chi tiết các thành tựu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) trên nhiều nhóm cây trồng và làm rõ các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi vô tính; phân tích các hệ thống chỉ thị phân tử DNA barcode (rbcL, matK, ITS) và cơ chế xác định giới tính cây trồng.

Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn vật liệu gồm 20 mẫu thực vật thu thập thực tế, các trang thiết bị phân tích phân tử, hệ thống hóa chất tách chiết và môi trường nuôi cấy mô thực vật. Tác giả trình bày cấu trúc các cặp đoạn mồi (primer) sử dụng trong phản ứng PCR:

Tên primer	Trình tự nucleotide (5' – 3')	Kích thước sản phẩm (bp)	Vùng gen đích
rbcL1-F rbcL 724-R	ATG TCA CCA CAA ACA GAA AC TCG CAT GTA CCT GCA GTA GC	700 - 800	Vùng gen rbcL (hệ gen lục lạp)
matK-KIM3-F matK-KIM1-R	CGT ACA GTA CTT TTG TGT TTA CGA G ACC CAG TCC ATC TGG AAA TCT TGG TTC	900 - 950	Vùng gen matK (hệ gen lục lạp)
ITS1-5F ITS4-R	GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC	750 - 800	Vùng đệm phiên mã ITS (hệ gen nhân)
SmY1_F SmY1_R	TCG CAA TTC GTT AGG GAT GAT GCG CAT AAT CAA CCA TCC ATA AAA ACC AT	770	Chỉ thị phân tử SmY (nhiễm sắc thể Y)

Chương này quy định cụ thể các bước bố trí thí nghiệm khử trùng bề mặt mô lá bằng AgNPs, HgCl2, NaOCl; kỹ thuật cắt lớp mỏng tế bào ngang và dọc từ gân chính lá (mv-tTCL, mv-lTCL) và cuống lá (p-tTCL, p-lTCL); các chỉ tiêu đo đếm sinh trưởng in vitro và công thức phối trộn giá thể vườn ươm.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm của luận án, được chia thành hai mảng nội dung lớn:

1. Đánh giá đa dạng di truyền và xác định giới tính dựa trên chỉ thị phân tử:

• Hiệu quả tách chiết DNA và khuếch đại PCR: DNA tổng số thu được từ 20 mẫu Kiwi đạt nồng độ cao và độ tinh sạch đạt chuẩn (tỷ lệ A260/A280 dao động từ 1,8 đến 2,0). Tỷ lệ khuếch đại thành công các vùng DNA barcode đạt 19/20 mẫu đối với vùng rbcL, 16/20 mẫu đối với vùng matK, và 15/20 mẫu đối với vùng ITS.
• Phân tích phát sinh loài: Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên từng vùng gen đơn lẻ và tổ hợp đa locus (matK + ITS và rbcL + matK + ITS) với phần mềm MEGA 7.0 (bootstrap 1.000) đã phân định rõ vị trí phân loại của các mẫu Kiwi tự nhiên tại Kon Tum, Lâm Đồng và các mẫu nhập nội, chỉ ra mối quan hệ họ hàng di truyền gần gũi với các loài tham chiếu chuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI.
• Kết quả xác định giới tính bằng chỉ thị SmY1: Phản ứng PCR với cặp mồi SmY1_F/SmY1_R trên 8 mẫu Kiwi đại diện đã phân định rõ ràng 02 mẫu cây đực mang sản phẩm khuếch đại đặc hiệu kích thước 770 bp trên gel agarose và 06 mẫu cây cái hoàn toàn không xuất hiện vạch phân đoạn DNA này.

2. Ứng dụng công nghệ vi nhân giống cây Kiwi:

• Khử trùng bề mặt mô cấy và cảm ứng tạo mô sẹo: Dung dịch nano bạc (AgNPs) ở nồng độ 300 - 500 ppm cho hiệu quả khử trùng tối ưu, tỷ lệ sống sạch và cảm ứng mô sẹo đạt cao sau 4 tuần nuôi cấy, loại bỏ nấm khuẩn hoại tử tốt hơn và hạn chế hiện tượng hóa nâu mô cấy so với nghiệm thức đối chứng sử dụng HgCl2 (1 g/L) và NaOCl (10 g/L).
• Tăng sinh cụm chồi bằng dịch chiết hữu cơ: Bổ sung dịch chiết chuối xanh và khoai tây ở tỷ lệ thích hợp vào môi trường MS giúp cải thiện đáng kể chiều cao chồi, số lá và khối lượng tươi của cụm chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
• Phát sinh phôi soma qua kỹ thuật lớp mỏng tế bào (TCL): Mẫu cấy cắt lớp mỏng tế bào ngang và dọc từ gân chính lá (mv-tTCL, mv-lTCL) và cuống lá (p-tTCL, p-lTCL) trên môi trường MSE (MS + 0,02 mg/L NAA + 0,5 mg/L TDZ) cho tỷ lệ tạo phôi và số lượng phôi soma/mẫu vượt trội hoàn toàn so với mẫu cấy đối chứng nguyên khối (mv và p không cắt lát mỏng). Mô học giải phẫu ghi nhận phôi soma phát triển hoàn chỉnh qua các pha hình thái: cầu (globular), tim (heart), thủy lôi (torpedo) và lá mầm (cotyledonary).
• Tái sinh chồi, tạo rễ và thích nghi nhà kính: Các phôi vô tính nảy mầm và phát triển thành chồi hữu hiệu khi chuyển sang môi trường bổ sung cytokinin (BA, TDZ). Chồi in vitro tái sinh rễ hoàn chỉnh và khỏe mạnh trên môi trường bổ sung auxin (NAA). Cây con hoàn chỉnh chuyển ra nhà kính đạt tỷ lệ sống sót cao sau 6 tuần trên các công thức giá thể phối trộn giữa đất mùn, xơ dừa và phân vi sinh.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về lý luận và khoa học của luận án:

• Đã xác định được mối quan hệ di truyền và phân loại phân tử của tập đoàn mẫu Kiwi tự nhiên tại tỉnh Kon Tum, tỉnh Lâm Đồng và các dòng Kiwi thương mại nhập nội thông qua phân tích tổ hợp trình tự các vùng mã vạch DNA lạp thể và nhân (rbcL, matK, ITS).
• Đã ứng dụng thành công kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi chuyên biệt SmY1_F/SmY1_R nhận diện phân đoạn gen kích thước 770 bp trên nhiễm sắc thể Y, cho phép xác định chính xác giới tính đực và cái ở giai đoạn cây con (xác định được 2 mẫu đực và 6 mẫu cái trong tập đoàn mẫu kiểm tra đại diện).
• Lần đầu tiên trên thế giới và tại Việt Nam, luận án đã xây dựng và chứng minh tính hiệu quả của kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) từ nguồn mẫu gân lá chính (mv-tTCL, mv-lTCL) và cuống lá (p-tTCL, p-lTCL) trong việc cảm ứng phát sinh phôi soma và tái sinh cây hoàn chỉnh ở cây Kiwi vàng (Actinidia chinensis).

Những đóng góp về mặt thực tiễn và kiến nghị:

• Xây dựng hoàn chỉnh sơ đồ quy trình vi nhân giống in vitro cây Kiwi thông qua con đường phát sinh phôi vô tính từ mẫu cắt TCL, cho phép chủ động sản xuất số lượng lớn cây giống đồng nhất, sạch bệnh, đúng giới tính phục vụ nhu cầu phát triển giống cây trồng mới tại Lâm Đồng.
• Khẳng định khả năng ứng dụng dung dịch hạt nano bạc (AgNPs) như một giải pháp khử trùng bề mặt mô thực vật hữu hiệu, thay thế các hóa chất độc hại truyền thống (HgCl2).
• Kiến nghị tiếp tục triển khai trồng khảo nghiệm các dòng cây Kiwi in vitro đã được xác định trước giới tính tại các tiểu vùng sinh thái khác nhau trên địa bàn tỉnh Lâm Đồng để đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học, khả năng sinh trưởng, ra hoa và chất lượng quả trong điều kiện sản xuất thâm canh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Số lượng mẫu Kiwi thu thập ngoài tự nhiên tại Việt Nam còn hạn chế (01 mẫu tại Kon Tum và 01 mẫu tại Lâm Đồng) do phân bố tự nhiên của loài phân tán và khó tiếp cận.
• Thử nghiệm xác định giới tính bằng chỉ thị phân tử SmY1 mới được thực hiện trên tập hợp 08 mẫu Kiwi đại diện.
• Đánh giá khả năng sinh trưởng và thích nghi của cây con có nguồn gốc phôi soma in vitro mới dừng lại ở quy mô nhà kính và vườn ươm sau 6 tuần, chưa theo dõi chu kỳ sinh trưởng dài hạn đến giai đoạn ra hoa kết quả ngoài đồng ruộng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng phạm vi điều tra, thu thập và phân tích đa dạng di truyền nguồn gen cây Kiwi tự nhiên tại các vùng sinh thái rừng núi phía Bắc và Tây Nguyên.
• Ứng dụng chỉ thị phân tử SmY1 trên quy mô lớn để sàng lọc phân loại giới tính hàng loạt cho cây con, thiết lập tỷ lệ bố trí cây đực : cây cái tối ưu (1 : 6 - 8) trong các vườn sản xuất thương phẩm.
• Theo dõi toàn diện các đặc tính nông học, động thái ra hoa, khả năng đậu quả và các chỉ tiêu hóa sinh của trái Kiwi vi nhân giống TCL khi trồng thực địa tại Lâm Đồng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho nhiều đối tượng:

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Sinh lý học thực vật, Công nghệ sinh học, Nông học: Luận án cung cấp khung phương pháp luận kết hợp chặt chẽ giữa sinh học phân tử hiện đại (DNA barcode, chỉ thị phân tử giới tính) với kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (TCL, phát sinh phôi soma) trên cây thân gỗ khó nhân giống.
• Đối với giảng viên và các nhà nghiên cứu: Phần thiết kế mồi, thông số chu trình nhiệt PCR cho các vùng gen rbcL, matK, ITS, SmY và thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào (MS, MSE, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA, TDZ, 2,4-D, BA) là nguồn dữ liệu chuẩn mực để tham khảo và phát triển các nghiên cứu tương tự.
• Đối với các trung tâm giống cây trồng, kỹ sư nông nghiệp và nhà hoạch định chính sách tại Lâm Đồng: Toàn bộ sơ đồ quy trình vi nhân giống TCL và kỹ thuật định giới tính sớm cung cấp cơ sở kỹ thuật hoàn chỉnh để triển khai dự án sản xuất giống Kiwi chất lượng cao phục vụ chuyển đổi cơ cấu cây trồng địa phương.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao việc xác định giới tính sớm bằng chỉ thị phân tử lại có ý nghĩa quyết định đối với cây Kiwi?
Cây Kiwi là loài thực vật đơn tính (cây đực và cây cái riêng biệt). Hoa cái chỉ tạo hạt phấn lép không có khả năng thụ tinh, còn hoa đực có bầu nhụy thoái hóa. Cây trồng từ hạt hoặc vi nhân giống thông thường phải mất nhiều năm mới ra hoa để phân biệt đực/cái bằng mắt thường. Trong khi đó, mô hình canh tác thương mại đòi hỏi tỷ lệ phối hợp chuẩn (1 cây đực xen 6 - 8 cây cái để thụ phấn). Việc sử dụng chỉ thị phân tử giúp xác định chính xác giới tính ngay từ giai đoạn mô cấy và cây con, tiết kiệm chi phí và thời gian chọn giống.

2. Luận án đã sử dụng chỉ thị phân tử nào để xác định giới tính cây Kiwi và cho kết quả ra sao?
Luận án sử dụng cặp mồi chuyên biệt SmY1_F (5'-TCG CAA TTC GTT AGG GAT GAT GCG-3') và SmY1_R (5'-CAT AAT CAA CCA TCC ATA AAA ACC AT-3') để khuếch đại đoạn gen SmY nằm trên nhiễm sắc thể Y. Kết quả điện di trên gel agarose 1,5% ghi nhận phân đoạn DNA đặc hiệu kích thước 770 bp chỉ xuất hiện ở các cá thể đực (2 mẫu) và hoàn toàn vắng mặt ở các cá thể cái (6 mẫu).

3. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) được tác giả triển khai trên các loại mẫu mô nào?
Tác giả đã triển khai kỹ thuật TCL trên hai loại nguồn mẫu in vitro của cây Kiwi gồm gân lá chính (main vein - mv) và cuống lá (petiole - p), thực hiện theo 2 phương thức cắt lát: cắt lát mỏng ngang (tTCL) và cắt lát mỏng dọc (lTCL), tạo thành 4 dạng mẫu cấy thực nghiệm: mv-tTCL, mv-lTCL, p-tTCL và p-lTCL.

4. Thành phần môi trường nào cho hiệu quả cảm ứng phát sinh phôi soma tối ưu từ mẫu cấy TCL cây Kiwi?
Môi trường tối ưu cho quá trình hình thành và phát sinh phôi vô tính từ các mẫu cấy TCL gân lá chính và cuống lá là môi trường MSE, gồm nền khoáng cơ bản Murashige và Skoog (MS) bổ sung 0,02 mg/L NAA; 0,5 mg/L TDZ; 30 g/L đường sucrose và 8 g/L agar.

5. Những vùng gen mã vạch DNA nào được sử dụng để phân tích quan hệ di truyền của các mẫu Kiwi trong nghiên cứu?
Nghiên cứu sử dụng 3 vùng gen mã vạch DNA chuẩn gồm 2 vùng gen lục lạp (rbcL với cặp mồi rbcL1-F/rbcL724-R, matK với cặp mồi matK-KIM3-F/matK-KIM1-R) và 1 vùng đệm phiên mã nhân (ITS với cặp mồi ITS1-5F/ITS4-R). Cây phát sinh loài được phân tích đơn locus và kết hợp đa locus (matK + ITS và rbcL + matK + ITS) bằng phần mềm MEGA 7.0.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Mỹ Hạnh đã giải quyết một cách toàn diện các vấn đề khoa học về phân loại phân tử, nhận diện giới tính sớm và công nghệ vi nhân giống cây Kiwi (Actinidia sp.) tại Lâm Đồng. Bằng việc kết hợp hệ thống mã vạch DNA đa locus (rbcL, matK, ITS) và chỉ thị phân tử SmY1, nghiên cứu đã làm sáng tỏ quan hệ di truyền của nguồn gen Kiwi tự nhiên và thương mại, đồng thời xác định chính xác kiểu gen đực/cái ở giai đoạn cây con. Công trình đã xây dựng thành công quy trình nhân giống vô tính thông qua công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) từ gân lá chính và cuống lá qua con đường phát sinh phôi soma, tạo ra nguồn cây giống hoàn chỉnh thích nghi tốt ngoài vườn ươm. Các kết quả này đóng góp cơ sở dữ liệu học thuật quan trọng và cung cấp giải pháp công nghệ sinh học hữu hiệu phục vụ công tác phát triển giống cây Kiwi tại tỉnh Lâm Đồng và các vùng sinh thái tương đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1. Giới thiệu về cây Kiwi 1. Phân bố cây Kiwi Kiwi là một loại trái cây thuộc chi Actinidia. Đó là một chi được tìm thấy chủ yếu ở miền nam Trung Quốc, bao gồm 54 loài được trồng trong các vườn thương mại của Trung Quốc [1,12].

Ở những môi trường khí hậu và địa lý khác nhau, các loài của chi Actinidia thể hiện sự biến đổi sinh học rất lớn. Ngày nay có hai loài được dùng trong thương mại là: A. Hai loài này đều có giá trị kinh tế cao, kích thước trái lớn so với các loài khác. Actinidia chinensis có nhiều giống như “Guifeng”, “Guilu”, “Guimi” và “Xuzhou 78-3” [1,13] nhưng chúng không được trồng rộng rãi, các giống này được thu thập trong tự nhiên.

Mark McNeilage, 1987 đã lai cây cái A. chinensis CK01 với phấn hoa của cây A. chinensis CK15-01 và được đặt tên là A. “Hort16A” là cây lưỡng bội, trọng lượng trái trung bình 95 - 100g.

Thịt trái có màu vàng lục đến vàng nhạt tùy theo thời gian thu hoạch. Thời gian bảo quản 12 - 16 tuần ở 0 ± 0,5°C. Nhiệt độ bảo quản tối ưu là 1,5 ± 0,5°C [14]. Trái được ra mắt trên thị trường quốc tế với tên Zespri ™ Gold Kiwi.

Tuy nhiên giống này rất dễ bị nhiễm vi khuẩn. Kể từ đó, Carputo và cộng sự, 2000 đã sử dụng giống cây trồng “Hort16A” làm bố mẹ ban đầu tạo con lai “Zesy002”. Sau khi được cấp bằng sáng chế bởi US Plant Patent 22,355 P3, “Zesy002” có tên là Zespri® SunGold Kiwi [1]. Actinidia thường phân bố ở các vùng đất ẩm và tơi xốp với độ cao 800 - 1.400 m đôi khi lên đến 1.950 m so với mực nước biển.

chinensis có nhiều nhất ở những vùng có lượng mưa hàng năm là 1000 - 2000 mm và độ ẩm tương đối là 75 - 85% [1]. Tất cả các loài trong chi Actinidia xuất hiện đều có cây đực và cây cái hiếm khi có các biến thể không phù hợp về giới tính xảy ra. Sự khác biệt về giải phẫu và hình thái của lá và cuống lá kiwi có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc xác định giới tính. Không có sự khác biệt quan trọng giữa cây đực và cây cái trong cấu trúc của hệ thống mạch ở lá và cuống lá.

Vì vậy, độ dày của lá và hình thái bề mặt 7 của biểu bì trên lá có thể được coi là những thông số cấu trúc quan trọng để xác định giới tính. Hoa cái chủ yếu mọc đơn độc hay thành cụm có hai đến ba hoa. Hoa đực mọc thành cụm gồm hai đến ba hoa một cụm, hoa nhỏ hơn hoa cái, bao phấn có màu vàng, bầu nhụy tiêu giảm. Về mặt hình thái, cả hoa đực và hoa cái đều hoàn chỉnh (hữu thụ) và lưỡng tính.

Tuy nhiên, việc rụng phấn hoa đối với hoa cây cái và thoái hóa bầu nhụy với hoa cây đực làm cho cây leo thể hiện chức năng đơn tính [1]. Nhân giống Kiwi bằng phương pháp truyền thống như cắt cành, ghép cành thường không có hiệu quả cao do phải trồng lâu dài và hạn chế về sự hình thành rễ [15]. Phương pháp vi nhân giống Kiwi hiện nay đã đạt được một số kết quả như tái sinh chồi [16], phát sinh cơ quan [17], phát sinh phôi soma [18] và tái sinh cây [17] ở Việt Nam. Hiện nay, ở Việt Nam, chưa có vùng nào trồng thành công Kiwi cho trái thu hoạch mà chủ yếu đang trồng thử nghiệm ở một số vùng núi phía Bắc và Kỳ Sơn thuộc tỉnh Nghệ An.