Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ký sinh trùng đường máu trên động vật cảnh (chó, mèo) là một hội chứng phức hợp gây ra bởi nhiều nhóm tác nhân khác nhau, bao gồm cả đơn bào (protozoa) và vi khuẩn nội bào (bacteria). Việc xác định chính xác căn nguyên gây bệnh đóng vai trò quyết định đối với hiệu quả điều trị trong thực hành lâm sàng thú y. Các loại thuốc đặc trị ký sinh trùng đường máu hiện hành đều có độc tính cao đối với cơ thể vật nuôi và yêu cầu phác đồ điều trị dài ngày; nếu chẩn đoán sai hoặc lạm dụng thuốc có thể dẫn đến suy giảm chức năng gan, suy thận cấp, ngộ độc thần kinh (co giật), rối loạn tiêu hóa và suy hô hấp. Ngoài ra, một số mầm bệnh có khả năng truyền lây sang người (zoonosis) gây ra các hội chứng nguy hiểm như bệnh bạch cầu hạt ở người (Human Granulocytic Anaplasmosis - HGA do Anaplasma phagocytophilum), viêm sưng hạch bạch huyết do Ehrlichia canis, hay bệnh thiếu máu truyền nhiễm do Mycoplasma haemofelis.

Trong thực tế lâm sàng tại Việt Nam, phương pháp chẩn đoán phổ biến nhất vẫn là nhuộm tiêu bản máu (nhuộm Giemsa, Diff-Quik) và soi kính hiển vi quang học. Tuy nhiên, kỹ thuật này có độ nhạy rất thấp, phụ thuộc lớn vào kỹ năng của kiểm nghiệm viên và chỉ phát hiện được khi mật độ ký sinh trùng trong máu đã ở mức cao, đồng nghĩa với việc bệnh đã chuyển sang giai đoạn nặng. Bên cạnh đó, các bộ kit chẩn đoán nhanh (rapid test kit) dựa trên kháng thể/kháng nguyên thường có độ tin cậy không đồng đều, dễ dẫn đến kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả. Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) đã khắc phục được các nhược điểm trên nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện sớm mầm bệnh ở giai đoạn ủ bệnh hoặc mật độ thấp.

Khóa luận được triển khai nhằm thực hiện nhiệm vụ khoa học cụ thể:

  1. Thiết lập và tối ưu hóa phản ứng Multiplex – PCR (m-PCR) chẩn đoán đồng thời 04 mầm bệnh ký sinh trùng đường máu phổ biến trên chó, mèo bao gồm: đơn bào Babesia vogeli, vi khuẩn Ehrlichia canis, vi khuẩn Anaplasma phagocytophilum và vi khuẩn Mycoplasma haemofelis.
  2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình m-PCR đã thiết lập trong phòng thí nghiệm.
  3. Ứng dụng quy trình m-PCR để sàng lọc và xác định tỷ lệ nhiễm mầm bệnh trên 65 mẫu máu thực địa thu thập từ chó, mèo nghi nhiễm tại các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh, đối chiếu kết quả với phương pháp Singleplex PCR (s-PCR).

Đối tượng nghiên cứu là DNA của 04 mầm bệnh ký sinh trùng đường máu (Babesia vogeli, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum, Mycoplasma haemofelis) và 65 mẫu máu toàn phần chống đông bằng EDTA lấy từ 38 cá thể chó và 27 cá thể mèo có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm bệnh. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Ký sinh trùng thuộc Viện Nghiên Cứu Bảo Tồn Đa Dạng Sinh Học Và Bệnh Nhiệt Đới (Viện BIOD), có sự phối hợp chuyên môn từ Bộ môn Ký sinh trùng (Khoa Thú y) và Bộ môn Sinh học (Khoa Công nghệ Sinh học) - Học viện Nông nghiệp Việt Nam cùng Bệnh viện Thú y Gaia trong giai đoạn 2022 - 2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng sinh học phân tử của kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (Polymerase Chain Reaction - PCR) và kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex PCR). Kỹ thuật m-PCR cho phép sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu trong cùng một hỗn hợp phản ứng để đồng thời nhân bản nhiều đoạn trình tự gen đích khác nhau của các loài vi sinh vật khác nhau mà không làm giảm tính đặc hiệu hay gây ức chế lẫn nhau.

Hệ thống cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong nghiên cứu

Các cặp mồi được tác giả lựa chọn từ các công bố quốc tế chuẩn mực nhằm đảm bảo kích thước sản phẩm khuếch đại của 4 mầm bệnh có sự phân tách rõ ràng trên bản điện di agarose:

Mầm bệnh đích Tên cặp mồi Trình tự mồi (5' - 3') Kích thước sản phẩm (bp) Nguồn tài liệu tham khảo
Babesia vogeli BCV-18S-F
BCV-18S-R		 GTGAACCTTATCACTTAAAGG
CAACTCCTCCACGCAATCG		 602 bp Kan & cs., 2009
Ehrlichia canis EC-virB9-F
EC-virB9-R		 CATAAGCATAGCTGATAACCCTGTTACAA
TGGATAATAAAACCGTACTATGTATGCTAG		 380 bp Kan & cs., 2009
Anaplasma phagocytophilum EHR 521
EHR 747		 TGTAGGCGG TTC GGTAAGTTAAAG
GCA CTC ATC GTT TAC AGC GTG		 247 bp Adaszek & cs., 2009
Mycoplasma haemofelis F
R		 ACGAAAGTCTGATGGAGCAATA
ACGCCCAATAAATCCG(A/G)ATAAT		 190 bp Jensen & cs., 2001

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Sử dụng bộ kit thương mại QIAamp® Micro Kit (Qiagen, Đức) để thu nhận DNA từ 50 - 100 µl máu toàn phần chứa chất chống đông EDTA, theo quy trình ly giải bằng đệm ATL và Proteinase K ở 56°C trong 3 giờ, gắn cột màng silica, rửa giải bằng đệm AW1, AW2 và thu nhận DNA trong 50 µl đệm AE, bảo quản ở nhiệt độ -20°C.
  2. Phương pháp định lượng và chuẩn bị mẫu đối chứng dương: Hàm lượng DNA sau tách chiết được đo bằng phương pháp quang phổ hấp thụ OD ở bước sóng 260/280 nm. Hỗn hợp đối chứng dương được thiết lập bằng cách phối trộn DNA của 4 mầm bệnh theo tỷ lệ thể tích 1:1:1:1 nhằm đảm bảo hàm lượng tương đương.
  3. Phương pháp tối ưu hóa phản ứng s-PCR và m-PCR:
    • Khảo sát nhiệt độ gắn mồi (annealing temperature): Thử nghiệm ở các dải nhiệt độ 56°C, 58°C và 60°C.
    • Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng m-PCR: Thử nghiệm ở 4 nồng độ giảm dần: 10 pmol; 5 pmol; 2,5 pmol và 1 pmol.
    • Chu trình nhiệt phản ứng: Biến tính ban đầu ở 98°C trong 2 phút; 35 chu kỳ gồm (biến tính 98°C trong 10 giây, gắn mồi ở nhiệt độ tối ưu trong 30 giây, kéo dài ở 72°C trong 30 giây); kéo dài kết thúc ở 72°C trong 1 phút.
  4. Phương pháp đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu:
    • Đánh giá độ nhạy: Pha loãng bậc hỗn hợp DNA khuôn ở các tỷ lệ 1:2; 1:20; 1:200; 1:2000 (tương ứng nồng độ DNA từ ~41 - 51,5 ng/µl xuống ~0,041 - 0,0515 ng/µl).
    • Đánh giá độ đặc hiệu: Thử nghiệm m-PCR trên các mẫu dương tính đơn lẻ, mẫu đồng nhiễm 2 hoặc 3 mầm bệnh và mẫu DNA của mầm bệnh ký sinh trùng đường máu khác là Tiên mao trùng (Trypanosoma spp.) nhằm kiểm tra hiện tượng bắt cặp chéo hoặc vạch giả.
  5. Phương pháp điện di gel agarose: Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,2% pha trong đệm TAE 1X, nhuộm bằng chất nhuộm Safe dye, chạy ở hiệu điện thế 128V trong 24 phút, đọc kết quả dưới ánh sáng tia UV bằng máy chụp gel GelSMART - Dlab.
  6. Phương pháp xử lý số liệu: Thu thập dữ liệu thực nghiệm và xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề

Chương 1 làm rõ tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng bệnh ký sinh trùng đường máu diễn biến phức tạp trên chó, mèo nuôi tại Việt Nam. Tác giả phân tích các hạn chế cố hữu của phương pháp xét nghiệm truyền thống (nhuộm máu, soi kính hiển vi) khi ký sinh trùng có kích thước rất nhỏ (1,5 - 4 µm), dễ nhầm lẫn hình thái học và cho kết quả âm tính giả ở giai đoạn đầu của bệnh. Chương này xác định rõ mục tiêu khoa học trọng tâm: xây dựng hoàn chỉnh một quy trình m-PCR có thể phát hiện đồng thời 04 mầm bệnh (Babesia vogeli, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum, Mycoplasma haemofelis) trong một phản ứng duy nhất, giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm, giảm chi phí và nâng cao độ chính xác trong công tác chẩn đoán thú y.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết toàn diện về phân loại học, hình thái, chu kỳ sinh học, phương thức truyền lây và tình hình dịch tễ học trong nước cũng như quốc tế của 4 nhóm mầm bệnh:

  • Babesia vogeli: Thuộc ngành Apicomplexa, bộ Piroplasmorida, ký sinh trong hồng cầu chó. Tác giả phân tích sự phân loại lại của các dạng Babesia lớn (4 - 5 µm) và nhỏ (1,5 - 2,5 µm), chu kỳ sinh sản vô tính trong vật chủ có xương sống kết hợp sinh sản hữu tính trong cơ thể ve (Rhipicephalus sanguineus, Dermacentor spp.).
  • Anaplasma phagocytophilum: Vi khuẩn Gram âm nội bào bắt buộc thuộc họ Anaplasmataceae (tái phân loại năm 2001 từ Ehrlichia phagocytophila), ký sinh tạo thể "phôi dâu" (morulae) trong bạch cầu trung tính và bạch cầu ái toan, lây truyền chủ yếu qua bọ ve chi Ixodes.
  • Mycoplasma haemofelis: Vi khuẩn biểu sinh ký sinh trên màng hồng cầu (trước đây thuộc chi Haemobartonella), kích thước nhỏ (0,3 - 0,8 µm), không có thành tế bào, gây bệnh thiếu máu tan máu truyền nhiễm ở mèo và chó.
  • Ehrlichia canis: Vi khuẩn Gram âm nội bào cư trú trong bạch cầu đơn nhân và đại thực bào, truyền lây qua ve nâu của chó (Rhipicephalus sanguineus), gây hội chứng suy tủy và giảm tiểu cầu.

Ngoài ra, chương này tổng kết nguyên lý của phản ứng PCR, các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả phản ứng (chất lượng DNA khuôn, nồng độ ion $\text{Mg}^{2+}$, nồng độ mồi, chu kỳ nhiệt, enzyme Taq polymerase) cùng các biến thể cải tiến như RT-PCR, Nested PCR, Inverse PCR và Multiplex PCR.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị (máy luân nhiệt Bioer, máy chụp gel GelSMART - Dlab, máy đo quang phổ Eppendorf, máy ly tâm lạnh Hermle) và hóa chất (bộ kit tách chiết QIAamp Micro Kit, enzyme PCRBIO Taq DNA Polymerase 2X). Tác giả mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm gồm 6 bước tách chiết DNA, quy trình thiết lập thành phần phản ứng s-PCR (thể tích 25 µl) và m-PCR (thể tích 50 µl), bảng trình tự các cặp mồi, thiết kế các mẻ phản ứng thăm dò nhiệt độ gắn mồi (56°C, 58°C, 60°C), nồng độ mồi (1 - 10 pmol), dải pha loãng DNA để xác định giới hạn phát hiện và phương pháp điện di trên gel agarose 1,2%.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 là phần nội dung thực nghiệm trọng tâm, được chia thành hai nội dung lớn:

  1. Xây dựng và tối ưu hóa phản ứng m-PCR:
    • Khảo sát nhiệt độ gắn mồi: Cả 3 dải nhiệt độ 56°C, 58°C và 60°C đều cho các vạch sản phẩm đặc hiệu rõ nét, không xuất hiện vạch phụ. Nhiệt độ 58°C được lựa chọn làm nhiệt độ gắn mồi chuẩn cho phản ứng m-PCR.
    • Khảo sát nồng độ mồi: Thử nghiệm từ 1 pmol đến 10 pmol cho thấy phản ứng có thể tạo vạch ở mọi nồng độ, nhưng nồng độ 10 pmol cho độ sáng vạch đậm nhất và đồng đều nhất giữa 4 mầm bệnh.
    • Độ nhạy: Khi pha loãng DNA đối chứng từ ~42 ng/µl xuống mức thấp nhất là 0,041 - 0,042 ng/µl (pha loãng 1:2000), phản ứng m-PCR vẫn khuếch đại rõ ràng cả 4 vạch sản phẩm.
    • Độ đặc hiệu: Phản ứng khuếch đại chính xác từng mầm bệnh đơn lẻ cũng như các tổ hợp mẫu đồng nhiễm 2 và 3 mầm bệnh mà không bị ức chế. Phản ứng hoàn toàn âm tính (không có vạch) khi thử nghiệm đối chứng chéo với mẫu mang DNA của Tiên mao trùng (Trypanosoma spp.).
  2. Đánh giá trên 65 mẫu máu thực địa:
    • Sàng lọc song song bằng hai phương pháp s-PCR và m-PCR cho kết quả trùng khớp 100% về tỷ lệ dương tính và âm tính trên từng cá thể.
    • Tổng tỷ lệ dương tính chung là 40,00% (26/65 mẫu).
    • Tỷ lệ nhiễm theo từng tác nhân: Mycoplasma haemofelis chiếm tỷ lệ cao nhất với 21,54% (14 mẫu: 6 chó, 8 mèo); Anaplasma phagocytophilum đạt 9,23% (6 mẫu trên chó); Ehrlichia canis đạt 6,15% (4 mẫu trên chó); Babesia vogeli đạt 3,08% (2 mẫu trên chó).
    • Phát hiện các trường hợp đồng nhiễm trên chó: 2 ca đồng nhiễm A. phagocytophilum và M. haemofelis (3,08%); 1 ca đồng nhiễm A. phagocytophilum và E. canis (1,54%); 1 ca đồng nhiễm A. phagocytophilum và B. vogeli (1,54%).
    • Trên mèo, 100% các mẫu dương tính (8/27 cá thể mèo) chỉ nhiễm duy nhất mầm bệnh Mycoplasma haemofelis.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Chương 5 đúc kết các thông số kỹ thuật đã được chuẩn hóa của quy trình Multiplex – PCR và khẳng định tính khả thi của kỹ thuật trong việc thay thế phương pháp soi kính truyền thống. Tác giả kiến nghị đưa quy trình vào ứng dụng rộng rãi tại các phòng xét nghiệm và bệnh viện thú y, đồng thời đề xuất mở rộng cỡ mẫu khảo sát dịch tễ trên nhiều vùng địa lý khác nhau cũng như bổ sung thêm các cặp mồi để phát hiện các tác nhân ký sinh trùng đường máu khác.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính của nghiên cứu

Nghiên cứu đã xây dựng thành công bộ thông số tối ưu cho phản ứng Multiplex – PCR phát hiện 4 mầm bệnh ký sinh trùng đường máu:

  • Thành phần phản ứng (tổng thể tích 50 µl): Master mix 2X (25 µl); H2O (12 µl); mỗi cặp mồi xuôi/ngược nồng độ 10 pmol (2 µl cho mỗi loại mầm bệnh, tổng 8 µl); DNA khuôn (5 µl).
  • Chu trình nhiệt tối ưu: 98°C trong 2 phút $\rightarrow$ 35 chu kỳ (98°C trong 10 giây $\rightarrow$ 58°C trong 30 giây $\rightarrow$ 72°C trong 30 giây) $\rightarrow$ 72°C trong 1 phút.
  • Kích thước sản phẩm khuếch đại: Phân tách rõ ràng 4 phân đoạn kích thước gồm 602 bp (B. vogeli), 380 bp (E. canis), 247 bp (A. phagocytophilum) và 190 bp (M. haemofelis).
  • Ngưỡng phát hiện tối thiểu (độ nhạy): Đạt mức nồng độ DNA khuôn xấp xỉ 0,041 - 0,042 ng/µl.
  • Độ đặc hiệu: Đạt 100%, không xảy ra hiện tượng dương tính giả hoặc phản ứng chéo với Trypanosoma spp.

Bảng tổng hợp kết quả sàng lọc 65 mẫu thực địa bằng s-PCR và m-PCR

Tác nhân mầm bệnh Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính trên chó (n=38) Số mẫu dương tính trên mèo (n=27) Tỷ lệ dương tính tổng số (%) Kết quả s-PCR Kết quả m-PCR
Babesia vogeli 65 2 0 3,08% 2 (3,08%) 2 (3,08%)
Ehrlichia canis 65 4 0 6,15% 4 (6,15%) 4 (6,15%)
Anaplasma phagocytophilum 65 6 0 9,23% 6 (9,23%) 6 (9,23%)
Mycoplasma haemofelis 65 6 8 21,54% 14 (21,54%) 14 (21,54%)
Đồng nhiễm A. phago + M. haemofelis 65 2 0 3,08% 2 (3,08%) 2 (3,08%)
Đồng nhiễm A. phago + E. canis 65 1 0 1,54% 1 (1,54%) 1 (1,54%)
Đồng nhiễm A. phago + B. vogeli 65 1 0 1,54% 1 (1,54%) 1 (1,54%)
Tổng số mẫu dương tính 65 18 8 40,00% 26 (40%) 26 (40%)

Đóng góp khoa học và giải pháp ứng dụng

  1. Về mặt kỹ thuật: Khóa luận đã tích hợp thành công 4 cặp mồi vào một phản ứng duy nhất với độ đồng nhất 100% so với phương pháp PCR đơn lẻ. Điều này giúp giảm 4 lần lượng hóa chất tiêu hao, thời gian thao tác máy và chi phí xét nghiệm cho mỗi ca bệnh.
  2. Về mặt thực tiễn thú y: Cung cấp quy trình xét nghiệm sinh học phân tử có độ tin cậy cao, hỗ trợ các bác sĩ thú y phát hiện sớm mầm bệnh ở giai đoạn chưa biểu hiện triệu chứng điển hình, xác định chính xác các ca đồng nhiễm phức tạp để đưa ra phác đồ kháng sinh/kháng đơn bào chuẩn xác, tránh lạm dụng thuốc gây suy gan, suy thận cho thú cưng.
  3. Về mặt dữ liệu dịch tễ: Đóng góp số liệu thực nghiệm bước đầu về tỷ lệ lưu hành của Anaplasma phagocytophilum và Mycoplasma haemofelis trên động vật cảnh tại Việt Nam — những mầm bệnh trước đây còn ít được công bố bằng phương pháp sinh học phân tử trong nước.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Cỡ mẫu khảo sát thực địa còn ở mức trung bình (65 mẫu máu), chủ yếu tập trung tại một số cơ sở thú y thuộc hai đô thị lớn (Hà Nội và TP. Hồ Chí Minh), chưa phản ánh toàn diện bức tranh dịch tễ ký sinh trùng đường máu trên phạm vi cả nước. Phản ứng m-PCR mới chỉ tích hợp 4 tác nhân chính, chưa bao gồm các loài ký sinh trùng khác như Hepatozoon canis, Babesia gibsoni hay Anaplasma platys.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng phạm vi thu thập mẫu thực địa với số lượng lớn hơn tại nhiều tỉnh thành.
    • Nghiên cứu thiết kế và tích hợp thêm các cặp mồi mới nhằm phát hiện thêm các loài piroplasmid và rickettsia khác trong cùng hệ thống xét nghiệm đa mồi.
    • Chuyển giao quy trình kỹ thuật cho các phòng xét nghiệm thú y lâm sàng và các bệnh viện thú y.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Thú y, Ký sinh trùng học thú y và Bệnh truyền nhiễm động vật.
  • Giá trị học thuật: Khóa luận là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình thiết kế, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng Multiplex – PCR (từ chọn mồi, cân bằng nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi đến đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu) và quy trình xử lý mẫu máu toàn phần.
  • Giá trị ứng dụng: Cung cấp thông số kỹ thuật hoàn chỉnh để các phòng xét nghiệm dịch vụ thú y có thể áp dụng trực tiếp vào quy trình chẩn đoán thường quy.

Câu hỏi thường gặp

1. Bốn mầm bệnh đích trong phản ứng Multiplex – PCR này là gì và kích thước các đoạn gen khuếch đại tương ứng là bao nhiêu?
Bốn mầm bệnh đích gồm: Babesia vogeli (kích thước sản phẩm khuếch đại 602 bp), Ehrlichia canis (380 bp), Anaplasma phagocytophilum (247 bp) và Mycoplasma haemofelis (190 bp).

2. Điều kiện chu trình nhiệt và nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR được xác định là gì?
Nồng độ mồi tối ưu cho mỗi cặp là 10 pmol. Chu trình nhiệt tối ưu gồm: biến tính ban đầu ở 98°C trong 2 phút; 35 chu kỳ lặp lại gồm biến tính 98°C trong 10 giây, gắn mồi ở 58°C trong 30 giây, kéo dài ở 72°C trong 30 giây; kéo dài lần cuối ở 72°C trong 1 phút.

3. Ngưỡng phát hiện (độ nhạy) của phản ứng m-PCR đạt mức nào đối với các mầm bệnh?
Phản ứng m-PCR có khả năng phát hiện mầm bệnh ở hàm lượng DNA khuôn tối thiểu xấp xỉ 0,041 đến 0,042 ng/µl (tương đương độ pha loãng 1:2000 từ mẫu DNA gốc ban đầu).

4. Phản ứng m-PCR có bị phản ứng chéo với các tác nhân ký sinh trùng đường máu khác không?
Không. Khi kiểm tra tính đặc hiệu với DNA của Tiên mao trùng (Trypanosoma spp.), sản phẩm điện di không xuất hiện bất kỳ vạch khuếch đại nào, chứng minh phản ứng có độ đặc hiệu tuyệt đối với 4 tác nhân mục tiêu.

5. Kết quả sàng lọc 65 mẫu máu thực địa cho thấy mầm bệnh nào chiếm tỷ lệ cao nhất và có hiện tượng đồng nhiễm không?
Mycoplasma haemofelis chiếm tỷ lệ nhiễm cao nhất với 21,54% (14/65 mẫu, xuất hiện trên cả chó và mèo). Nghiên cứu ghi nhận 4 ca đồng nhiễm trên chó (chiếm 6,16% tổng số mẫu), bao gồm 2 ca đồng nhiễm A. phagocytophilum + M. haemofelis, 1 ca đồng nhiễm A. phagocytophilum + E. canis, và 1 ca đồng nhiễm A. phagocytophilum + B. vogeli.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trịnh Thị Linh Chi đã thiết lập và chuẩn hóa thành công quy trình Multiplex – PCR chẩn đoán đồng thời 04 mầm bệnh ký sinh trùng đường máu phổ biến trên chó, mèo (Babesia vogeli, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum, Mycoplasma haemofelis) với nhiệt độ gắn mồi 58°C và nồng độ mồi 10 pmol. Phương pháp đạt độ đặc hiệu cao, ngưỡng phát hiện DNA đạt mức 0,041 - 0,042 ng/µl và cho kết quả hoàn toàn đồng nhất với kỹ thuật PCR đơn lẻ khi thử nghiệm trên 65 mẫu thực địa (tỷ lệ dương tính 40%). Công trình có giá trị khoa học thực nghiệm vững chắc, mở ra giải pháp chẩn đoán sớm, chính xác và tiết kiệm chi phí cho ngành thú y lâm sàng tại Việt Nam.