ĐẶT VẤN ĐỀ Ký sinh trùng đƣờng máu không chỉ là một căn bệnh mà là một nhóm các căn bệnh gây ra bởi nhiều loại ký sinh trùng đƣờng máu khác nhau. Với mỗi một căn nguyên thì có một phác đồ điều trị khác nhau, do vậy việc chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh là quan trọng.Việc chẩn đoán không chính xác và sử dụng thuốc trị ký sinh đƣờng máu và kháng sinh cho thú cƣng bừa bãi sẽ dẫn đến rất nhiều hệ luỵ. Bởi lẽ, các loại thuốc trị ký sinh trùng đƣờng máu hiện nay đều có độc tính và phác đồ điều trị thƣờng kéo dài. Nếu không bị mắc ký sinh trùng đƣờng máu mà vẫn sử dụng những loại thuốc trên trong một thời gian dài sẽ phá hủy chức năng gan, thận, sử dụng quá liều thú cƣng sẽ bị co giật, biếng ăn, tiêu chảy và khó thở.
Nếu không xác định đƣợc căn nguyên, điều trị đúng loại thuốc sẽ dẫn đến lãng phí tiền bạc, thời gian của chủ nuôi cũng nhƣ gây tử vong cho thú cƣng do điều trị không đúng cách. Bên cạnh đó còn có một số mầm bệnh nguy hiểm có thể truyền lây từ thú cƣng sang ngƣời gây bệnh nhƣ sƣng hạch bạch huyết (do vi khuẩn Ehrlichia), bệnh bạch cầu hạt (do vi khuẩn Anaplasma), bệnh thiếu máu truyền nhiễm (do vi khuẩn Haemoplasma). Hiện nay, các bác sĩ thú y có xu hƣớng chẩn đoán những mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bằng phƣơng pháp nhuộm Giem-sa, Diff-quick để phát hiện vì cho kết quả nhanh, giá thành rẻ, thao tác đơn giản. Tuy nhiên, đó là những phƣơng pháp cho độ nhạy rất thấp, phụ thuộc vào tay nghề, trình độ và kinh nghiệm của kỹ thuật viên.
Việc đánh giá bằng hình thái học rất dễ nhầm lẫn do kích thƣớc của những loài ký sinh trùng nhỏ (1,5-4µm), hoặc chỉ có thể quan sát khi mầm bệnh đã nhân lên nhiều trong hồng cầu đồng nghĩa với tiên lƣợng bệnh nặng, tỷ lệ tử vong rất cao ảnh hƣởng nhiều đến việc xác định tác nhân gây bệnh. Thậm chí, với sự phát triển của nhiều công ty thuốc và thiết bị thú y hiện nay đã thổi phồng thái quá về độ hiệu quả của các kit test nhanh xét nghiệm chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng đƣờng máu gây ra. Điều này đã dẫn đến hậu quả là quan niệm sai lệch của các bác sĩ trong việc lựa chọn chẩn đoán đúng về những căn bệnh nguy hiểm này. Những phƣơng pháp sinh học phân tử cho kết quả chính xác hơn với độ đặc hiệu, độ nhạy cao nhƣ phản ứng chuỗi trùng hợp PCR đã lần lƣợt ra đời, dần thay thế cho những kỹ thuật nhƣ nhuộm (Giem-sa, Diffquick) soi kính với độ nhạy rất thấp.
1 PCR có thể giúp phát hiện sớm mầm bệnh từ đó có thể chữa trị kịp thời, về thời gian điều trị có thể nói là rút ngắn hơn rất nhiều so với phƣơng pháp nhuộm truyền thống chỉ phát hiện ra đƣợc mầm bệnh khi tiên lƣợng bệnh đã rất nặng, nguy cơ tử vong cao. Bƣớc tiến này của nền công nghệ hiện đại đã giúp việc chẩn đoán mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu trở nên dễ dàng hơn, giảm thiếu tối đa hiện tƣợng âm tính giả chẩn đoán sai do yếu tố khách quan (kinh nghiệm kỹ thuật viên, hóa chất nhuộm, …) gây nguy hiểm cho sức khỏe của cả vật nuôi và con ngƣời. Để phát hiện nhanh chóng mầm bệnh và chữa trị kịp thời, phƣơng pháp PCR là phƣơng pháp tối ƣu nhất trong việc chẩn đoán các mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu ở thú cƣng. Mặt khác, với ƣu điểm có độ nhạy và độ đặc cao, phƣơng pháp PCR giúp tránh tình trạng bác sĩ thú y sử dụng sai phác đồ điều trị dẫn đến việc điều trị tốn thời gian và không hiệu quả.
Chính vì vậy, đề tài “Thiết lập phản ứng MULTIPLEX – PCR trong chẩn đoán mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu trên chó, mèo” cần đƣợc triển khai để hỗ trợ trong quá trình chẩn đoán và điều trị. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Thiết lập đƣợc phản ứng MULTIPLEX – PCR phục vụ chẩn đoán 04 mầm bệnh mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu phổ biến (Babaesia vogeli, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocyphilum, Mycoplasma haemofelis) ở chó, mèo. 2 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN 2. Bệnh do đơn bào lê dạng trùng lớn (Babesia vogeli) 2.
Đặc điểm hình thái và phân loại 2. Vị trí của Babesia vogeli Về mặt phân loại Babesia thuộc ngành Apicomplexa, lớp Aconoidasida, bộ Piroplasmorida, họ Babesiidae (Taylor & cs. Trƣớc đây, Bệnh lê dạng trùng đƣợc phân loại dựa trên hình thái của tế bào chất trong tế bào hồng cầu là dạng lớn (ví dụ: Babesia canis) hoặc dạng nhỏ (ví dụ: Babesia gibsoni) (Gallego & cs. Sau đó, một số loài Babesia đã đƣợc xác định bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
Babesia canis trƣớc đây đƣợc coi là dạng lớn của Babesia đã đƣợc đƣa vào thành một loài riêng biệt là Babaesia canis, Babaesia rossi và Babaesia vogeli (Carret & cs. Hình thái Nhiều thập kỷ trƣớc, đánh giá hình thái (giai đoạn merozoite trong hồng cầu) qua tiêu bản máu đƣợc xem là phƣơng thức truyền thống để xác định Babesia spp. Thời kỳ đầu, tất cả các chủng Babesia lớn (2,5-5,0 µm) đều đƣợc biết đến với cái tên chung là Babesia canis, các chủng nhỏ (1,0-2,5 µm) đƣợc coi là Babesia gibsoni (Boozer & Macintire, 2003). Tuy nhiên phân tích phân tử và giải trình tự DNA đã phát hiện ra rằng có nhiều loài piroplasmid lây nhiễm sang chó hơn, cụ thể là Babesia gibsoni, Babesia conradae và Babesia vulpes (Poonam & cs., 2019); Babesia microti hay còn đƣợc gọi là Theileria annae (Zahler & cs., 2008) và Babesia spp.
dạng lớn chƣa đƣợc đặt tên (Birkenheuer & cs., 2004); Babesia rossi, Babesia canis và Babesia vogeli trƣớc đây đƣợc coi là phân loài của Babesia canis. Chúng giống hệt nhau về mặt hình thái nhƣng trên cơ sở miễn dịch chéo, xét nghiệm huyết thanh học, tính đặc hiệu của vector và phát sinh loài phân tử và do đó hiện đƣợc coi là riêng biệt loài (Carret & cs. Mới đây, một loài babesia mới trên chó – Babesia negevi đƣợc phát hiện ở Isarel (Gad Baneth & cs. Hình thái của các loài babesia trên chó đƣợc phân biệt dựa trên kích thƣớc của chúng.
Babesia dạng lớn (dài 4-5 µm) dạng hình quả lê, nhọn ở một đầu và làm tròn ở đầu kia. Các dạng Amip đã đƣợc mô tả có đƣờng kính 2–4 μm và thƣờng là chứa một không bào. Babesia dạng lớn Nguồn: Troccap Babesia dạng nhỏ ( 1,5 – 2,5 µm) thiếu hình dạng hình quả lê thông thƣờng, các thể dinh dƣỡng có hình vòng hoặc hình bầu dục, hoặc hình vòng nhẫn có thể xảy ra. Kích thƣớc của babesia dạng nhỏ không lớn hơn 1/8 đƣờng kính của hồng cầu chủ.
Babesia dạng nhỏ Nguồn: Troccap 2. Vòng đời Theo Jalovecka M. là một loài đơn bào kí sinh trong hồng cầu, đƣợc truyền qua ve. Vòng đời của Babesia spp.
là sự kết hợp của hai chu kì sinh sản vô tính và một chu kì sinh sản hữu tính, luân phiên giữa vật chủ là động vật có 4 xƣơng sống và vector truyền bệnh là ve. Vòng đời của Babesia gồm 3 giai đoạn kế tiếp: merogony, gamogony và sporogony. Vòng đời của Babesia đƣợc diễn giải nhƣ sau: Sinh sản vô tính (1) Vật chủ là động vật có xƣơng sống bị nhiễm tử bào tử (sporozoite) từ nƣớc bọt của ve trong quá trình hút máu. (3) Trophozoite phân chia thành mảnh trùng (merozoite) thông qua quá trình sinh sản vô tính (merogony) bằng hình thức trực phân, sau đó thoát ra ngoài và tái nhiễm các hồng cầu vật chủ khác.
Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính (Gamogony) đƣợc bắt đầu bởi sự quy kết giới tính của merozoite thành các tế bào giao tử nội bào, giai đoạn ngắn ngủi lây nhiễm cho ve vector (vật chủ chính thức). (2) Các gametes, đƣợc gọi là thể tia (ray bodies) hoặc Strahlenkörper, hợp nhất và tạo ra một hợp tử di động đƣợc gọi là ookinete. (3) Ookinete thâm nhập vào các tế bào ruột của ve. Khi đã ở bên trong biểu mô, hợp tử trải qua quá trình phân chia giảm phân (meiotic), dẫn đến việc sản sinh ra các kinetes.
(4) Kinetes phát tán qua chất dịch cơ thể ve (haemolymph) đến các mô ngoại vi của ve, bao gồm cả các tế bào trứng. Sự xâm nhập vào buồng trứng của ve dẫn đến nhiễm trùng trứng và lây truyền Babesia từ mẹ sang con cái (transovarial transmission). Song song đó, kinetes sơ cấp xâm nhập vào các cơ quan khác của bọ ve và thông qua sự phân liệt (đa phân hạch), nhân lên để tạo ra các kinetes thứ cấp xâm nhập vào các tuyến nƣớc bọt của ve. (6) Một khi ve bị nhiễm Babesia bắt đầu hút máu vật chủ khác, sporoblast sẽ đƣợc kích hoạt và nhiều sporozoites lây nhiễm liên tục đƣợc tạo ra bởi quá trình sinh bào tử (sporogony) và đƣợc giải phóng vào máu vật chủ.
Nguồn: Trends in Parasitology Hình 1. Vòng đời Lê dạng trùng 2. Con đƣờng truyền lây Ở hầu hết mọi nơi trên thế giới, ve là vật trung gian truyền bệnh chính cho bệnh lê dạng trùng. Các loài nhƣ Rhipicephalus sanguineus, Dermacentor spp.
và Haemaphysalis ellipticum có thể truyền bệnh Babesia lớn của chó, trong khi Babesia gibsoni đƣợc truyền bởi Haemaphysalis bispinosa và Haemaphysalis longicornis. Babesia annae đƣợc cho là do Ixodes hexagonus truyền. Cả hai loại lây truyền là truyền qua các giai đoạn trong vòng đời của ve (trans-stadial transmissions) và truyền từ mẹ sang con (transovarial transmissions) đảm bảo duy trì sự lây truyền Babesia trong vài thế hệ của ve (Poonam Vishwakarma & M. Ở Đông Nam Á, vết cắn của ve dƣờng nhƣ là phƣơng thức lây truyền phổ biến nhất (Konishi K.
Dịch tễ học Đối với bệnh do lê dạng trùng (Babesiosis) là một bệnh đơn bào do ve truyền, ký sinh trong hồng cầu của nhiều loài động vật bao gồm động vật hoang dã và vật nuôi, trong đó có chó. Bệnh do nhiều loài Babesia gây ra, đáng chú ý là một số loài có thể lây truyền cả cho ngƣời. Babesia vogeli, Babesia canis, và Babesia gibsoni là những loài chủ yếu gây bệnh trên ở châu Á (Leonhard Schnittger, 2012). Babesia vogeli là loài đƣợc tìm thấy ở rất nhiều nơi trên thế giới: Pháp, Úc, Nhật Bản, Brazil, Nam Phi và Mỹ và thƣờng gây bệnh nhẹ ở chó trƣởng thành nhƣng bệnh nặng ở một số chó nhỏ (Matjila P.
Ngoài ra, các trƣờng hợp nhiễm Babesia vogeli ở chó đã đƣợc báo cáo ở Thổ Nhĩ Kỳ (Gülanber A., 2006) và là loài đƣợc chẩn đoán thƣờng xuyên nhất ở Châu Đại Dƣơng (Birkenheuer A. Tại học viện cảnh sát K9 ở Cairo, Ấn Độ, tổng cộng 242 mẫu máu đã đƣợc thu thập từ những chú chó cảnh, kết quả cho thấy có 62 trƣờng hợp dƣơng tính với Babesia vogeli, chiếm 25,62%.