chương I, thẩm định phương pháp là một công việc rất khó khăn, nhàm chán, và tốn kém tuy nhiên lại là một nội dung quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phân tích. Cần cân nhắc mục đích yêu cầu của từng phương pháp và nguồn lực để lựa chọn thông số thẩm định cho phù hợp. Theo các quy định của USFDA, AOAC, USP và ICH, đối với các phương pháp phân tích hóa học các thông số cần thẩm định bao gồm: - Tính đặc hiệu, tính chọn lọc; (Specifility/Selectivity) - Khoảng tuyến tính và đường chuẩn; (Linearity and Calibration curve) - Giới hạn phát hiện; (Limit of Detection – LOD) - Giới hạn định lượng; (Limit of Quatitation – LOQ) - Độ đúng; (Trueness) - Độ chụm; (Precision) Trang 9 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 10 - Độ vững (ổn định) của phương pháp; (Robustness/Ruggedness) Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào kỹ thuật áp dụng trong phương pháp, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thử nghiệm. Từng trường hợp cụ thể các thông số thẩm định có thể có sự khác nhau.
Mỗi phương pháp phân tích hóa học có một mục đích nhất định, từ việc xác định một chất ở nồng độ thấp đến xác định độ tinh khiết của một chất. Để dễ dàng cho việc lựa chọn các thông số thẩm định, các phương pháp có thể được chia làm 4 nhóm tùy thuộc vào mục đích của chúng. - Các phương pháp phân tích định tính - Các phương pháp phân tích vi lượng - Các phương pháp phân tích đa lượng - Xác định giới hạn tạp chất (thử độ tinh khiết) Các yêu cầu về thông số cần thẩm định cho từng loại phương pháp được mô tả ở bảng 1 (phương pháp không tiêu chuẩn) và bảng 2 (phương pháp tiêu chuẩn). Người thực Trang 10 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 11 hiện thẩm định cần lựa chọn đúng cách thẩm định cho từng thông số và lập kế hoạch cho từng nội dung.
Trang 11 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 12 Bảng 1: Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn Các thông số thẩm Phân tích Phân tích Phân tích Xác định giới định định tính vi lượng đa lượng hạn tạp chất Độ đúng – + + – (Trueness) Độ chụm – + + – (Precision) Độ đặc hiệu, chọn lọc (Specification/Selectivity + + + + ) LOD + + +/- + (Limit of detection) LOQ – + +/- – (Limit of quantitation) Độ tuyến tính – + + – (Linearity/range) Độ vững (ổn định) – + + – Trang 12 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 13 (Ruggedness/ Robustness) (+) Cần thực hiện thẩm định (-) Không cần thực hiện thẩm định Bảng 2: Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp tiêu chuẩn Phân tích Phân tích Phân tích đa Xác định giới Các thông số đánh giá định tính vi lượng lượng hạn tạp chất Độ đúng – + + – (Trueness) Độ chụm – + + – (Precision) Độ đặc hiệu, chọn lọc – – – – (Specification/Selectivity) LOD + – – + (Limit of detection) LOQ – + – – (Limit of quantitation) Trang 13 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 14 Độ tuyến tính – – – – (Linearity/range) Độ vững (ổn định) – – – – (Ruggedness/Robustness) (+) Cần thực hiện thẩm định (-) Không cần thực hiện thẩm định 1. Tính đặc hiệu/chọn lọc Định nghĩa: * Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất. Cụ thể, trong phép phân tích định định đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích. Trong phép phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.
Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích. Trang 14 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 15 * Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc. Như vậy, tính chọn lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu.
Do các phương pháp phân tích thường có nhiều chất cùng xuất hiện nên khái niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn. Cách xác định Trường hợp chung: Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp định tính, định lượng cần bố trí các thí nghiệm như sau: - Phân tích các mẫu trắng, lặp lại tối thiểu 6 lần đối với từng loại nền mẫu. Mẫu trắng phải không được cho tín hiệu phân tích. Nếu mẫu trắng có hơn 10% dương tính hoặc xuất hiện tín hiệu thì cần phải thay đổi phương pháp để loại trừ các ảnh hưởng.
- Phân tích mẫu thử hoặc mẫu trắng thêm chuẩn ở hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần. So sánh kết quả với mẫu trắng, phải cho tín hiệu chất cần phân tích. Trang 15 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 16 - Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu (co-chromatography), cách này thường áp dụng đối với các phương pháp sắc ký. Sau khi chuẩn bị mẫu (mẫu trắng hoặc mẫu thực) và phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký thu được các pic sắc ký, ta thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này.
So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu/chọn lọc. - Phân tích mẫu không có chất phân tích nhưng có chất cấu trúc tương tự chất phân tích (nếu có): Phải cho kết quả âm tính (đối với phương pháp định tính) và không được ảnh hưởng đến kết quả định lượng của chất phân tích (đối với phương pháp định lượng). Trong trường hợp những chỉ tiêu phân tích không thể có mẫu trắng (sample blank) để xác định tính chọn lọc/đặc hiệu, có thể thực hiện các thí nghiệm trên các mẫu trắng thuốc thử (reagent blank), tức là thực hiện phân tích các bước tương tự như khi phân tích mẫu nhưng không có mẫu thử. Các trường hợp đặc biệt: Sắc ký lỏng sử dụng detector DAD (mảng diod) Trang 16 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 17 Tính chọn lọc trong sắc ký lỏng có thể đạt được thông qua việc việc lựa chọn cột tối ưu, điều kiện sắc ký tối ưu, nhiệt độ cột và bước sóng.
Ngoài việc thay đổi điều kiện sắc ký, thì giai đoạn xử lý mẫu cũng phải tối ưu để đạt được tính chọn lọc cao nhất. Trong sắc ký, cần xác định rằng píc sắc ký có phải là một píc đơn hay có lẫn các tạp chất khác. Đối với các hệ thông sắc ký có detector mảng diod (DAD) có thể xác định được tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết (peak purity) của píc, hay so sánh phổ của píc với thư viện phổ sẵn có. Độ phù hợp Độ phù hợp 764 999 Phổ Hình 1: Xác định độ tinh khiết của pic trong sắc ký lỏng HPLC-DAD Bước sóng (nm) Bước sóng (nm) Tín hiệu Không tinh khiết Tinh khiết Độ tinh khiết của píc được xác định bằng các so sánh phổ tại các điểm khác nhau trên pic sắc ký.
Cách phổ biến nhất là chọn tại 3 điểm: đỉnh píc (apex), và hai điểm về hai Thời gian (min) Trang 17 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 18 bên sườn của píc (upslope và downslope). Thông thường chọn 2 điểm tại 2/3 độ rộng của píc về hai phía. Ngoài ra hiện nay đa số các thiết bị đều có phần mềm tính toán độ tinh khiết của píc, có thể dựa vào 3 điểm, 5 điểm, 7 điểm hay tất cả các điểm tạo thành píc. Các thiết bị hiện đại có thể tính toán độ tinh khiết trực tiếp thông qua phần mềm điều khiển.
Hình 2: Các cách xác định độ tinh khiết của pic sắc ký HPLC-DAD So sánh phổ của pic với phổ chuẩn cũng là một cách phổ biến để xác định sự tinh khiết của píc. Một píc được xem là không tinh khiết khi giá trị phù hợp (hệ số match) không đạt xấp xỉ 100%. Tuy nhiên, nếu giá trị này có gần 100% cũng không thể khẳng định được chắc chắn sự tinh khiết của píc, có thể do một trong số các nguyên nhân sau: Trang 18 Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 19 - Tạp chất tồn tại với lượng thấp hơn nhiều so với chất phân tích do đó phổ UV-Vis không ảnh hưởng nhiều đến phổ của chất phân tích. - Phổ của tạp chất và chất phân tích tương tự nhau.
Sắc ký khối phổ Các thiết bị sắc ký khí có gắn detector MS, thường so sánh phổ của chất phân tích với phổ chuẩn có sẵn trong thư viện đi kèm hoặc phổ của chất chuẩn tương ứng. Sử dụng các phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất tốt để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp. Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) đối với các phương pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất.