Luận văn: Tác dụng của Saponin Sâm Vũ Diệp lên ty thể tế bào cơ tim H9C2

Saponin Sâm Vũ Diệp giúp bảo vệ ty thể tế bào cơ tim, hỗ trợ chức năng tim mạch khỏe mạnh. Tìm hiểu cơ chế tác động và lợi ích sức khỏe.

• Tác giả: Dương Ngọc Thành
• Người hướng dẫn: PGS TS. Vũ Thị Thu
• Trường học: Trường Đại học Phenikaa
• Chuyên ngành: Dược lý và Dược lâm sàng
• Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và đánh giá tác dụng của saponin từ Sâm Vũ Diệp tới chức năng ty thể tế bào cơ tim chuột H9C2
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Saponin Sâm Vũ Diệp và Cấu Trúc Ty Thể Tế Bào Cơ Tim

Saponin Sâm Vũ Diệp là các hợp chất hoạt tính sinh học được tách chiết từ cây Sâm Vũ Diệp, có khả năng bảo vệ ty thể tế bào cơ tim hiệu quả. Ty thể là những bào quan quan trọng trong tế bào, đặc biệt là tế bào cơ tim, nơi tham gia vào quá trình sản xuất năng lượng ATP và điều hòa các quá trình sinh hóa. Cấu trúc ty thể bao gồm màng ngoài, màng trong, tiểu phân thể crista và ma trận, mỗi thành phần đều có chức năng riêng biệt. Những tổn thương đến ty thể như thiếu máu cục bộ-tái tưới máu (HR) có thể làm suy giảm chức năng tim vô cùng nghiêm trọng. Saponin từ Sâm Vũ Diệp hoạt động như một chất bảo vệ, giúp duy trì sự ổn định của cấu trúc ty thể và cải thiện khả năng chống oxy hóa của tế bào.

1.1. Thành Phần Hóa Học của Saponin

Saponin là một nhóm glycoside có cấu trúc phức tạp, chứa các aglycone steroid hoặc triterpenoid. Trong Sâm Vũ Diệp, saponin chứa các hợp chất chính như aralosides và các dẫn xuất khác. Các hợp chất này có tính chất amphiphilic, cho phép chúng tương tác với các thành phần lipid của màng ty thể. Cấu trúc đặc biệt này giúp saponin có khả năng ổn định màng và bảo vệ chống lại các tổn thương do stress oxy hóa.

1.2. Vai Trò Bảo Vệ Ty Thể

Bảo vệ ty thể tế bào cơ tim là một trong những tác dụng sinh học quan trọng nhất của saponin. Ty thể bị tổn thương trong các điều kiện thiếu máu sẽ mất khả năng sản xuất ATP, dẫn đến chết tế bào. Saponin Sâm Vũ Diệp giúp giảm stress oxy hóa, ổn định thế năng màng và duy trì tính liên tục của quá trình lưu thông ion Ca2+, từ đó nâng cao tỷ lệ sống của tế bào cơ tim H9C2.

II. Tổn Thương Ty Thể trong Thiếu Máu Cục Bộ Tái Tưới Máu

Thiếu máu cục bộ-tái tưới máu (HR) là một quá trình bệnh lý phổ biến trong các bệnh tim mạch, gây tổn thương nghiêm trọng đến ty thể tế bào cơ tim. Khi cơ tim thiếu oxy, quá trình sản xuất ATP suy giảm, dẫn đến sự tích lũy lactate và H+ ion. Tổn thương ty thể trong điều kiện này bao gồm mở cửa lỗ chuyển tiếp thế năng (MPTP), làm mất thế năng màng trong, rò rỉ cytochrome c và kích hoạt apoptosis. Giai đoạn tái tưới máu càng làm tăng sự tích lũy kali, các gốc tự do và quá tải Ca2+ vào ty thể. Saponin có thể can thiệp vào các quá trình này, bảo vệ ty thể khỏi hư hại ngay cả trong điều kiện stress cao.

2.1. Cơ Chế Hình Thành Gốc Tự Do

Trong quá trình thiếu máu cục bộ, ty thể trở thành một nguồn chính sản sinh gốc tự do reactive oxygen species (ROS). ROS tấn công các lipid membrane, protein, và DNA, gây lDisruption cấu trúc ty thể. Saponin Sâm Vũ Diệp hoạt động như chất chống oxy hóa mạnh, trung hòa ROS và bảo vệ các thành phần ty thể khỏi bị tổn thương.

2.2. Quá Tải Canxi và Độc Tính Ty Thể

Quá tải Ca2+ vào ty thể là một trong những yếu tố chính dẫn đến mở MPTP và chết tế bào. Saponin giúp điều hòa homeostasis Ca2+, giảm sự tích lũy Ca2+ bất thường vào ty thể. Điều này duy trì được chức năng ty thể và tăng khả năng chống chịu của tế bào cơ tim trước tổn thương HR.

III. Quy Trình Chiết Xuất và Phân Lập Saponin Sâm Vũ Diệp

Để đạt được cao saponin từ Sâm Vũ Diệp với độ tinh khiết cao, cần áp dụng các phương pháp chiết xuất và phân lập khoa học. Quy trình bắt đầu từ việc lựa chọn bộ phận thực vật (lá, rễ), sấy khô và tán bột. Chiết xuất sử dụng dung môi thích hợp như ethanol hoặc methanol để hòa tan saponin. Sau đó, cao saponin được tinh chế bằng các kỹ thuật như sắc ký chất lỏng (HPLC) để tách chiết và xác định hai hợp chất saponin chính. Quy trình này giảm thiểu tạp chất đồng thời giữ nguyên hoạt tính sinh học của saponin. Các mẫu được kiểm định bằng phương pháp phổ NMR và mass spectrometry để xác nhận cấu trúc hóa học và độ tinh khiết.

3.1. Các Bước Chiết Xuất Saponin

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu từ Sâm Vũ Diệp tươi, sấy khô ở 60-80°C. Bước 2: Tán bột thành kích thước 200 mesh. Bước 3: Chiết xuất bằng ethanol 70% ở tỷ lệ 1:10 (w/v), khuấy lạnh 24-48 giờ. Bước 4: Lọc và tập trung dưới chân không. Bước 5: Kết tủa saponin bằng acetone hoặc ether, rửa sạch và sấy. Cao saponin được thu nhận với hiệu suất cao và hoạt tính sinh học tốt.

3.2. Phương Pháp Phân Lập Hai Hợp Chất Chính

Sử dụng sắc ký cột (column chromatography) và HPLC để tách chiết hai hợp chất saponin chính từ cao saponin. Các hợp chất được phân lập dựa trên độ phân cực khác nhau, rồi tinh chế để đạt độ tinh khiết >95%. Mỗi hợp chất được phân tích cấu trúc bằng 1H NMR, 13C NMR và LCMS để xác định số khối lượng và công thức phân tử.

IV. Tác Dụng Bảo Vệ Ty Thể và Ứng Dụng Lâm Sàng

Các nghiên cứu in vitro trên tế bào cơ tim chuột H9C2 đã chứng minh rằng saponin Sâm Vũ Diệp và các hợp chất saponin chính có khả năng bảo vệ ty thể trong điều kiện tổn thương HR. Khi xử lý tế bào H9C2 bằng cao saponin với nồng độ 10-50 µg/mL, tỷ lệ sống tế bào tăng đáng kể so với nhóm kiểm soát. Các chỉ số ty thể như thế năng màng ty thể (∆Ψm), lượng ROS, và nội dung ATP đều được cải thiện. Saponin giảm sự mở MPTP, ức chế apoptosis và duy trì chức năng ty thể bình thường. Những phát hiện này mở ra triển vọng ứng dụng saponin Sâm Vũ Diệp trong điều trị bệnh tim mạch, đặc biệt là những bệnh liên quan đến thiếu máu cục bộ.

4.1. Các Chỉ Số Đánh Giá Chức Năng Ty Thể

Thế năng màng ty thể (∆Ψm) được đo bằng dye fluorescent JC-1, phản ánh khả năng hoạt động của ty thể. Nồng độ ROS đo bằng DCFDA fluorescence cho thấy khả năng chống oxy hóa. ATP intracellular được xác định qua bioluminescence assay, đánh giá năng lực sản xuất năng lượng. Lỗ chuyển tiếp thế năng (MPTP) mở ra được phát hiện qua Calcein-AM/CoCl2 assay. Saponin tác động tích cực trên tất cả các chỉ số này.

4.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Lâm Sàng

Saponin Sâm Vũ Diệp có tiềm năng phát triển thành thuốc bảo vệ tim trong điều trị bệnh thiếu máu cục bộ, nhồi máu cơ tim, suy tim và các biến chứng tim mạch khác. Với hoạt tính mạnh bảo vệ ty thể, saponin có thể giảm thiểu tổn thương reperfusion, cải thiện chức năng tim sau cơn nhồi máu. Dược liệu này có thể là giải pháp thảo dược hiệu quả, bổ sung vào các liệu pháp tim mạch hiện đại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, số người chết hàng năm do bệnh tim mạch cao hơn bất kỳ nguyên nhân nào khác. Trong năm 2016, số người chết vì bệnh tim mạch chiếm khoảng 31% trên toàn cầu, tương đương 17,9 triệu người [72]. Tại Việt Nam, bệnh lý này gây ra 31% tổng số ca tử vong tương đương với hơn 170.000 tử vong trong năm 2016 [72].Trong các bệnh tim mạch, thiếu máu cục bộ cơ tim (TMCBCT) là bệnh lý phổ biến với tỷ lệ tử vong cao. Thiếu máu cục bộ cơ tim xảy ra khi lượng máu đến nuôi mô cơ tim bị giảm hoặc dừng đột ngột.

Nguyên nhân chủ yếu là do sự tắc nghẽn một phần hoặc hoàn toàn động mạch vành. Trong giai đoạn thiếu máu, sự thiếu ôxi và chất dinh dưỡng có thể làm tế bào, mô cơ tim bị tổn thương và chết. Điều này dẫn đến rối loạn chức năng tim và người bệnh có thể chết nếu không được cứu chữa kịp thời. Hiện nay, điều trị thiếu máu cục bộ cơ tim là hướng vào việc cải thiện lưu lượng máu đến cơ tim bằng cách sử dụng các thuốc tan huyết khối, các biện pháp nong mạch hoặc phẫu thuật bắc cầu động mạch vành.

Bên cạnh đó, việc lựa chọn lối sống lành mạnh cũng là yếu tố quan trọng trong điều trị và ngăn ngừa thiếu máu cục bộ cơ tim [66]. Tái thông dòng máu giúp tái cung cấp ôxi và dưỡng chất cho mô cơ tim là rất quan trọng để cứu sống người bệnh. Tuy nhiên quá trình này cũng có thể làm trầm trọng hơn những tổn thương gây ra trong giai đoạn nhồi máu trước đó, thậm chí gây chết tế bào. Các tổn thương này được gọi là tổn thương thiếu máu - tái tưới máu (TM- TTM) hay tổn thương thiếu ôxi-tái cung cấp ôxi (Hypoxia/reoxygenation, HR) [22].

Các hoạt chất có trong tự nhiên là đối tượng mà các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm về hoạt tính và khả năng bảo vệ hệ tim mạch cũng như tế bào cơ tim. Giai đoạn đầu chính là giai đoạn sàng lọc, đánh giá và chứng minh những hoạt chất có tiềm năng trong cơ chế bệnh lý thiếu máu cục bộ cơ tim thường được sử dụng mô hình Hypoxia/reoxygenation in vitro trên các dòng tế bào, trong đó có tế bào H9C2. Hiện nay ngoài mô hình Hypoxia/reoxygenation sử dụng hoá chất CoCl2 (Cobalt chloride) thì tại Việt Nam kế thừa mô hình nghiên cứu trên thế giới nhóm nghiên cứu của PGS. Vũ Thị Thu và cộng sự đã xây dựng thành công Hypoxia/reoxygenation, sử dụng mô hình thiếu máu- tái tưới máu in vitro hay còn được gọi là mô hình thiếu ôxi-tái cung cấp ôxi (Hypoxia/Reoxygenation, HR) được tạo ra bằng cách thay đổi nồng độ 1 ôxi trong môi trường nuôi nhờ buồng thiếu ôxi (Whitley H35 hypoxystation) [16].

Từ đó nhiều cao chiết và chất dược liệu tại Việt Nam đã được chứng minh có hiệu quả bảo vệ tế bào H9C2 trong tổn thương Hypoxia/reoxygenation. Do vậy hướng nghiên cứu nhằm giảm thiểu tối đa các tổn thương gây bởi HR đã và đang được quan tâm, phát triển. Thực tế, trong vài thập niên gần đây, việc nghiên cứu tìm kiếm thuốc mới cũng như tối ưu điều kiện sử dụng thuốc nhằm hạn chế tổn thương thiếu máu- tái tưới máu cơ tim đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Tuy nhiên hướng nghiên cứu này vẫn cần được mở rộng để tìm kiếm các hoạt chất có khả năng ứng dụng cao trong lâm sàng.

Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú với nhiều bài thuốc cổ truyền được sử dụng rộng rãi. Trong đó Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem, SVD) thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceace), còn có tên gọi khác là Tam thất hoang, Tam thất lá xẻ, hoàng liên thất, tam thất thùy xẻ lông chim hai lần, vũ diệp tam thất, sâm hai lần chẻ và trúc tiết nhân sâm… Cây thường được phân bố nhiều ở miền Bắc Việt Nam, thường tìm thấy ở các khu rừng ẩm có độ cao từ 1900-2400m. Sâm vũ diệp là loại thảo dược quý được dùng phổ biến trong việc tăng sức đề kháng, bổ huyết nhất là cho người cao tuổi và phụ nữ sau khi sinh [2]. Nghiên cứu của PGS.

Nguyễn Hữu Tùng cùng cộng sự (2011) và Liang Chun (2010) về thành phần hóa học cho thấy SVD có chứa tỷ lệ cao saponin (nhóm chất đã được chứng minh bước đầu có tác dụng chống huyết khối) [31]. Vũ Thị Thu và cộng sự đã có nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ của cao chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem) trong mô hình Hypoxia/reoxygenation [60], cho đến nay chưa có nghiên cứu đánh giá các tác dụng này trên các hợp chất saponin chính của Sâm vũ diệp, do đó để chứng minh tác dụng chống thiếu máu cục bộ cơ tim của hợp chất chính saponin từ Sâm vũ diệp chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và đánh giá tác dụng của saponin từ Sâm Vũ Diệp tới chức năng ty thể tế bào cơ tim chuột H9C2” với mục tiêu sau: - Chiết xuất và phân lập được thành phần saponin từ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem); - Đánh giá được tác dụng của thành phần saponin từ Sâm vũ diệp tới chức năng ty thể trên tế bào cơ tim chuột H9C2 trong điều kiện bệnh lý. Thiếu máu cục bộ cơ tim 1. Bệnh tim mạch và mức độ nguy hiểm của bệnh tim mạch Bệnh tim mạch (cardiovascular disease, CVD) là bệnh lý xảy ra do các rối loạn của tim và mạch máu.

Bệnh tim mạch bao gồm bệnh mạch vành (nhồi máu cơ tim), tai biến mạch máu não (đột quỵ), tăng huyết áp tăng (cao huyết áp), bệnh động mạch ngoại biên, bệnh thấp tim, bệnh tim bẩm sinh và suy tim [69]. Bệnh tim mạch được xếp vào hàng những bệnh nguy hiểm và gây tử vong cao trên thế giới cũng như ở nước ta. Mỗi năm số người chết do bệnh tim mạch nhiều hơn các nguyên nhân gây bệnh khác. Trong số các bệnh về tim mạch thì chủ yếu 85% là do đột quỵ và nhồi máu cơ tim [32].

Do đó việc nghiên cứu nhằm tìm ra các liệu pháp hoặc các thuốc mới điều trị các bệnh tim mạch nói chung, bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim nói riêng đang là mối quan tâm của các nhà khoa học. Bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim Thiếu máu cục bộ (TMCB) có thể xảy ra ở cấu trúc mô-tế bào tại bất kỳ cơ quan nào trong cơ thể, nó có các triệu trứng khác nhau phụ thuộc vào vị trí tại cơ quan đó. Ở tim nó được gọi là bệnh thiếu máu cơ tim hay thiếu máu cục bộ cơ tim (TMCBCT) [56]. Thiếu máu cục bộ (TMCB) làm giảm lưu lượng máu đến mô cơ tim dẫn đến, làm giảm lượng oxi cung cấp cho cơ tim khiến cơ tim bị giảm hoạt động chức năng.

Điều này có thể dẫn đến đau tim, nhịp tim không đều và suy tim. TMCB có thể làm tổn hại đến cơ tim, trầm trọng hơn có thể gây suy tim và gây tử vong cho người bệnh [3]. Phần lớn các trường hợp thiếu máu cục bộ là do hình thành cục máu đông hiện diện trong lòng mạch máu nuôi tim làm tắc mạch máu gây ra. Điều này gây ra sự ngừng trệ đột ngột và nghiêm trọng đối với lưu lượng máu.

Hay một phần cục máu đông có thể bị vỡ, theo dòng máu tới các cơ quan khác của cơ thể làm giảm hoặc tắc nghẽn sự lưu thông bình thường của dòng máu [57]. Ngoài ra xơ vữa động mạch cũng là một trong số những nguyên nhân chính gây ra thiếu máu cục bộ, mảng xơ vữa là những mảng bám cứng, dính, chủ yếu được hình thành từ chất béo. Các mảng xơ vữa hình thành từ từ theo thời gian khiến cho lòng 3 động mạch bị cứng và hẹp, điều này làm giảm khả năng lưu thông dòng máu và cũng đồng thời làm giảm lượng ôxi và chất dinh dưỡng tới cung cấp cho tế bào cơ tim, gây tổn thương hoặc chết tế bào, khiến cơ tim bị giảm hoạt động chức năng. Nếu không được phát hiện sớm và điều trị có thể gây nhiều biến chứng nguy hiểm như nhồi máu cơ tim, suy tim, rối loạn nhịp tim…[3, 56, 58].

Hình 1: Phản ứng của mô đối với thiếu máu cục bộ-tái tưới máu [59]. Mức độ tổn thương tế bào cơ tim phụ thuộc vào thời gian TMCB và liệu pháp tái tưới máu. TMCB xảy ra trong thời gian ngắn (tùy thuộc vào từng loại cơ quan) thì các tế bào vẫn còn khả năng được cứu sống nếu được tái cung cấp máu kịp thời, đó gọi là tổn thương có thể hồi phục. Khi thiếu máu cục bộ- tái tưới máu ở thời gian vừa phải sẽ dẫn tới rối loạn chức năng mô nhưng không viêm hoặc không chết tế bào.

Khi TMCB kéo dài dẫn đến lượng ôxi cung cấp thấp đến một ngưỡng nhất định, tế bào bị chết dần dẫn đến mô bị hoại tử, thời gian càng kéo dài số lượng tế bào chết càng tăng, các tổn thương trở nên không thể phục hồi và được đặc trưng bởi sự không toàn vẹn cấu trúc trong các mô. Vì vậy việc phục hồi lưu lượng máu tới các mô nhanh chóng 4 trước khi tế bào chết là liệu pháp tiên quyết nhằm hạn chế tổn thương do TMCB gây ra (Hình 1) [59]. Hiện nay, nhiều biện pháp đã được sử dụng để để điều trị cũng như làm giảm các tổn thương do thiếu máu cục bộ gây ra. Việc sử việc sử dụng thuốc hay can thiệp lâm sàng sẽ tùy theo tình trạng cụ thể của từng bệnh nhân mà bác sĩ sẽ có những chỉ định phù hợp.

Đối với bệnh TMCBCT có thể được điều trị bằng can thiệp phẫu thuật nong mạch hoặc đặt stent để mở thông động mạch vành bị tắc nghẽn, tái tưới máu cho vùng cơ tim bị tổn thương [61]. Bên cạnh đó việc xây dựng một chế độ dinh dưỡng hợp lý, lối sống lành mạnh, luyện tập thể thao thường xuyên…là những biện pháp hữu hiệu trong để phòng ngừa bệnh lý này [71]. Tổn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu Khái niệm tổn thương tái tưới máu là một chủ đề tranh luận trong ba thập kỷ qua khi một số nhà nghiên cứu tin rằng tất cả các tổn thương phát triển trong thời kỳ thiếu máu cục bộ trong khi những người khác lập luận rằng lưu lượng máu được tái cung cấp trở lại có khả năng mở rộng tổn thương mô [62].