ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam được đánh giá là một trong những nước có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú. Theo trung tâm tài nguyên rừng và môi trường – Đại học Quốc gia Hà Nội (2000) đã thống kê nước ta có 3.800 loài thực vật có giá trị dược liệu. Việc sử dụng thảo dược làm thuốc chữa bệnh đã có từ rất xa xưa. Trong những năm gần đây nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm tăng mạnh, việc khai thác nguồn tài nguyên cây thuốc một cách bừa bãi làm cho các loài cây có giá trị dược liệu bị suy giảm nghiêm trọng, một số loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng phải đưa vào danh mục thực vật nguy cấp, quý, hiếm, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại (Nghị định số 32/06/ND-CP ngày 30/3/2006 của chính phủ).
Trước thực trạng đó thủ tướng chính phủ đã ban hành quyết định số 81/2009/ QĐ- TT về việc quy hoạch phát triển ngành công nghiệp hóa dược đến năm 2015 và tầm nhìn đến 2025. Trong đó ưu tiên đầu tư sản xuất nguyên liệu hóa dược để phục vụ sản xuất thuốc thiết yếu… Ưu tiên việc tạo dựng nguồn nguyên liệu ổn định về số lượng và chất lượng để cung cấp cho nhu cầu của nhân dân, các nhà máy chiết xuất… Vì thế công tác giống hết sức quan trọng ngoài việc lựa chọn được các cây trội hoặc cây ưu việt cần xác định được phương pháp nhân giống thích hợp để nhanh chóng cung cấp giống tốt cho sản suất. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô là một công cụ để đáp ứng nhu cầu trên. Bằng phương pháp này có thể dùng các chồi non, cây mầm, vỏ cây, thậm chí là từ bao phấn và chỉ nhị để tạo thành cây mới với hệ số nhân giống cao, cây nuôi cấy mô thường được trẻ hóa, sạch bệnh và mang đầy đủ các đặc tính tốt của cây lấy vật liệu ban đầu.
Chi Bình vôi (Stephania) gồm nhiều loài với tên khác nhau, có tác dụng an thần, chữa ho, sốt, kiết lỵ, dạ dày, mất ngủ… Trên thế giới, chi Bình vôi có hơn 40 loài. Ở Việt Nam, chi Bình vôi có 13 loài với 4 loài đã có tên trong “Sách đỏ Việt Nam”. Hiện nay việc nghiên cứu về phương pháp nhân giống các tài liệu ghi chép về loài còn hạn chế. Loài Bình vôi là một trong những cây thuốc có tiềm năng đang bị khai thác suy giảm nghiêm trọng ngoài tự nhiên.
Trước nhu cầu lớn về dược liệu của cây Bình vôi việc nghiên cứu áp dụng công nghệ nhân giống của loài cây này có ý nghĩa rất lớn nhằm góp phần bảo tồn 1 nguồn gen và phát triển loài cây thuốc quý hiếm này. Bên cạnh đó sự hiểu biết về tầm quan trọng, lợi ích và công tác nhân giống, đặc biệt là nhân giống bằng phương pháp nuôi cây mô của loài cây này không chỉ giúp cho công tác bảo tồn mà còn tạo ra nguồn nguyên liệu đảm bảo cả chất lượng và số lượng cho việc sản xuất hóa dược với quy mô lớn. Chính vì những lý do trên đây đề tài “Xây dựng quy trình nhân nhanh invitro cây bình vôi trắng (Stephania grabra(Roxb.) Miers)" được thực hiện nhằm cung cấp thêm những kiến thức kỹ thuật nhân giống về loài cây này nói riêng và công tác bảo tồn và phát triển cây dược liệu ở nước ta nói chung. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 1.
Mục đích Xây dựng được quy trình nhân nhanh in vitro cây bình vôi trắng Stephania glabra (Roxb. Yêu cầu Xác định được cách khử trùng mẫu để tạo nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy in vitro. Xác định được môi trường tái sinh chồi in vitro thích hợp. Xác định được môi trường nhân nhanh in vitro thích hợp cho hệ số nhân cao.
Xác định môi trường ra rễ in vitro Xác định được thời vụ ra cây in vitro Xác định được giá thể trồng cây in vitro 1. Ý NGHĨA KHOA HỌC, THỰC TIỄN CỦA ĐỂ TÀI 1. Ý nghĩa khoa học Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về nhân giống in vitro cây bình vôi trắng tại Hà Giang. Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm tài liệu khoa học về khả năng ứng dụng của kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro đối với cây bình vôi trắng nói riêng và các loài cây dược liệu nói chung, đồng thời nó cũng là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về đối tượng tiềm năng này.
Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là tài liệu tham khảo, phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học và giảng dạy ở trường Đại học, Cao đẳng và Trung cấp chuyên nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Ý nghĩa thực tiễn Bình vôi trắng là loại bình vôi hiện nay được thu mua số lượng lớn và là cây trồng có sãn nguồn mẫu tại địa phương. Theo dược điển của Việt Nam ở bình vôi có hàm lượng Rotunđin là 1,2 đến 1,5%. Ở Hà giang qua Kết quả phân tích mẫu bình vôi trắng có hàm lượng rotundin đạt 2.9% cao hơn so với dược điển của Việt nam là 1,5 đến 1,7 % (tes mẫu ngày 25/7/2019) của đề tài sẽ góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen cây bình vôi trắng, thúc đẩy sản xuất trên quy mô lớn, chủ động trong khâu sản xuất, cung cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, với giá thành cạnh tranh, tạo nguồn nguyên liệu bình vôi trắng cho ngành Dược Việt Nam để góp phần phòng chống bệnh tật cho cộng đồng và mang lại giá trị về kinh tế cho xã hội.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính cây trồng invitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bao gồm: (i) Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành (ii) Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
(iii) Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành (iv) Nuôi cấy mô sẹo (callus) Nuôi cấy tế bào đơn (vi) Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong tế bào thực vật sâu khi đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần. Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm (invitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm (invivo). Khác với các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống invitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm.
Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật Haberlandt là người đầu tiên đưa ra quan niệm cho rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang trong mình toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó.
Nhờ đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Khả năng này được gọi là tính toàn năng (totipotence) của tế bào (Haberlandt, 1902). Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn 4 toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào đơn.
Các bước cơ bản của quá trình nhân giống in vitro Quá trình nhân giống invitro được chia làm 5 giai đoạn (George, 1993) Lấy mẫu và xử lý mẫu Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý khử trùng mẫu. Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, sạch bệnh, trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…, cây ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu nuôi cấy.
Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của giai đoạn này là tái sinh có định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Cân bằng hormone nghiêng về phía auxin sẽ kích thích ra rễ và mô sẹo, nếu nghiêng về phía cytokinin sẽ kích thích sự hình thành chồi. Bên cạnh đó, cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy.
Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành. Nhân nhanh Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nhân giống. Để tăng hệ số nhân, người ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau sao cho cân bằng hormone nghiêng về phía cytokynin, cũng như các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết hoa quả, nấm men kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Cây nhân giống in vitro là cây ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài.