LỜI MỞ ĐẦU Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) là một loài nấm thƣờng đƣợc tìm thấy ở các nƣớc Á Đông. Hiện nay, Linh Chi đƣợc dùng khắp nơi trên thế giới nhƣ một loại thuốc bổ, thực phẩm chức năng. Hàng triệu ngƣời dùng Linh Chi hàng ngày để tăng sinh lực, cải thiện tiêu hóa và ngủ tốt hơn. Linh Chi đƣợc xếp vào loại thƣợng dƣợc vì không độc, không có tác dụng phụ dù dùng trong một thời gian dài.
Tại Việt Nam, hiện nay nấm Linh Chi đƣợc cung cấp trên thị trƣờng chủ yếu dƣới các dạng: nguyên tai, thái lát, viên nang, trà túi lọc và một số loại nƣớc uống từ Linh Chi của các cơ sở chế biến thực phẩm. Một dạng sản phẩm khác là cao Linh Chi cũng bắt đầu đƣợc nhiều ngƣời biết đến, nhƣng dạng sản phẩm này chủ yếu nhập từ các nƣớc nhƣ Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc,… Một vài doanh nghiệp trong nƣớc cũng đã tiến hành sản xuất thử nghiệm thành công cao Linh Chi, tuy nhiên số lƣợng sản phẩm này vẫn còn hạn chế. Thông thƣờng, nƣớc là dung môi đƣợc sử dụng để trích lấy dịch Linh Chi. Tuy nhiên, phƣơng pháp truyền thống này chỉ trích ly đƣợc các hoạt chất phân cực chẳng hạn nhƣ các polysacharide.
Do đó còn khá nhiều các thành phần có giá trị khác còn lại trong bã mà không thể trích ly bằng nƣớc. Đó là các triterpen và các hoạt chất phân cực kém hoặc không phân cực khác. Vì vậy, kỹ thuật khai thác những hợp chất này là rất quan trọng để thu đƣợc hàm lƣợng nhiều nhất và hoạt tính sinh học vẫn đƣợc bảo đảm. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp trích ly dƣới sự hỗ trợ bởi enzyme để chiết suất các hợp chất có hoạt tính sinh học.
Ngoài ra, kỹ thuật trích ly với lƣu chất siêu tới hạn cũng đang trở thành một kỹ thuật phổ biến trên thế giới để thu hồi các hợp chất thiên nhiên nhƣ tinh dầu và các hợp chất tƣơng tự. Đây là phƣơng pháp hứa hẹn để thay thế các phƣơng pháp trích ly bằng dung môi truyền thống. Bởi vì phƣơng pháp này có khả năng hòa tan chọn lọc các cấu tử, thân thiện với môi trƣờng, an toàn cho con ngƣời đồng thời chất lƣợng sản phẩm cao hơn phƣơng pháp truyền thống. xv Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu phương pháp trích ly các hoạt chất từ nấm Linh Chi”.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng trích ly các hoạt chất từ nấm Linh Chi đƣợc hỗ trợ bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L và bằng CO2 siêu tới hạn có sử dụng ethanol là đồng dung môi. Chúng tôi hy vọng rằng nghiên cứu này sẽ làm cơ sở cho việc đánh giá các phƣơng pháp trích ly hoạt chất từ nấm Linh Chi. Từ đó ứng dụng phƣơng pháp thích hợp nhất vào trong sản xuất cao Linh Chi trên quy mô công nghiệp. xvi Chƣơng 1.
Nấm Linh Chi 1. Nguồn gốc, phân loại Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) là một loài nấm thƣờng đƣợc tìm thấy ở các nƣớc Á Đông. Từ xƣa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và một số nƣớc châu Á khác đã sử dụng nấm Linh Chi nhƣ một loại thảo dƣợc để giúp tăng cƣờng sức khỏe và kéo dài tuổi thọ. Đây là một loại nấm lớn.
Tai nấm có dạng hình quạt hoặc thận. Mặt trên mũ có vân đồng tâm và trơn bóng. Mặt dƣới phẳng, có nhiều lỗ nhỏ li ti. Cuống nấm đặc và cứng, cũng trơn bóng và sậm màu (Sissi và cộng sự, 2011).
Linh Chi từ xƣa đƣợc xem nhƣ thần dƣợc, có khả năng làm trẻ hóa, kéo dài tuổi thọ, trị bá bệnh nên còn có các tên gọi Linh Chi thảo, bất lão thảo, tiên thảo, thần thảo, vạn niên nhung,… (Wasser và cộng sự, 2005). Ngày nay, theo phân loại nấm Linh Chi của Trung Quốc, các nhà nghiên cứu đã chia nấm Linh Chi ra làm 6 loại theo màu sắc: Xanh, đỏ, vàng, trắng, đen và tím (Upton 2000; Woo và cộng sự 1999, Zhao và Zhang 1994).1 Nấm Linh Chi đỏ 1 Chƣơng 1. Tổng quan Bảng 1.1 Đặc điểm của các loại nấm Linh Chi (Thần nông bản thảo, đời nhà Châu 25 – 22 TCN) Tên gọi Màu sắc Đặc tính Thanh chi hay Long chi Xanh Vị chua, tính bình, không độc. Chủ trị sáng mắt, bổ gan khí, an thần, tăng trí nhớ Hồng chi, Xích chi hay Vị đắng, tính bình, không độc.
Tăng trí nhớ, Đỏ Đơn chi dƣỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực. Hoàng chi hay Kim chi Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc. An thần, ích tì khí Vị cay, tính bình, không độc. Ích phổi, thông Bạch chi hay ngọc chi Trắng mũi, cƣờng ý chí, an thần, chữa ho nghịch hơi.
Vị mặn, tính bình, không độc. Trị chứng bí tiểu, Hắc chi hay Huyền chi Đen ích thận khí Vị ngọt, tính ôn, không độc. Trị đau nhức khớp Tử chi hay Mộc chi Tím xƣơng, gân cốt. Thành phần hóa học của nấm Linh Chi Theo Borchers và cộng sự (1999) trong nấm Linh Chi tƣơi, nƣớc là thành phần chủ yếu chiếm 90% khối lƣợng.
Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo chiếm từ 2 - 8%, carbonhydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lƣợng tro chiếm 8 - 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác nhƣ kali, can-xi, phốt pho, ma-giê, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất. Trong một nghiên cứu khác về những thành phần các hợp chất không bay hơi của nấm Linh Chi, Mau và cộng sự (2001) đã xác định đƣợc tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm Linh Chi gồm: tro (1,8%), carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 - 8%). Đặc biệt thành phần protein của nấm Linh Chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine. Hàm lƣợng chất béo thấp nhƣng chứa nhiều acid béo không bão hòa nhiều nối đôi, đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con ngƣời (Chang và cộng sự, 1996; Borchers và cộng sự, 1999; Sanodiya và cộng sự, 2009).
Bên cạnh đó, nấm Linh Chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính 2 Chƣơng 1. Tổng quan sinh học nhƣ các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của chúng. Hoạt tính sinh học của nấm Linh Chi có đƣợc chủ yếu là do các polysaccharides, peptidoglycan và các triterpenes mang lại (Boh và cộng sự, 2007; Zhou và cộng sự, 2007). Theo nghiên cứu của Chang và Buswell (2008) thì điều kiện môi trƣờng, giống loài của nấm Linh Chi đƣợc xem là yếu tố ảnh hƣởng đến hàm lƣợng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh Chi.2 Hàm lƣợng triterpen và polysacharide của 11 loại nấm Linh Chi thƣơng mại ở Hồng Kông (Chang và Buswell, 2008) Sản phẩm thƣơng mại Triterpen (%) Polysacharide (%) A 1.10 K Không phát hiện 12.
Các polysaccharides và các peptidoglycan Hàm lƣợng carbonhydrate và hàm lƣợng chất xơ có trong nấm Linh Chi đƣợc xác định lần lƣợt từ 26- 28% và 59% (Mau và cộng sự, 2001). Nấm Linh Chi có chứa rất nhiều polysaccharide có khối lƣợng phân tử lớn, các hợp chất này mang hoạt tính sinh học và đƣợc tìm thấy ở tất cả các bộ phận của nấm Linh Chi. Nhiều nhóm polysaccharides có thể đƣợc chiết xuất từ thân nấm, bào tử và khuẩn ty. Các polysaccharides của nấm Linh Chi có tác dụng sinh học nhƣ chống viêm, hạ đƣờng huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u và tăng cƣờng khả năng miễn dịch (Wachtel-Galor và cộng sự , 2004).
Theo kết quả phân tích, thành phần đƣờng chủ yếu trong polysaccharides của nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum-polysaccharides: GL-PSs) là đƣờng glucose (Bao và cộng sự, 2001). Ngoài ra, GL-PSs cũng có cấu trúc polymer mạch thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị trí liên kết β hoặc α khác nhau nhƣ 1-3, 1-4 và 1-6 với các dạng đồng phân -D hay -L (Bao và cộng sự, 2002). Khả năng chống lại sự hình thành khối u của GL-PSs phụ thuộc vào cấu hình mạch nhánh cũng nhƣ tính tan của polysaccharide này (Bao và cộng sự, 2001). Ngoài ra, nấm Linh Chi cũng có chứa một mạng lƣới chitin, đây là thành phần mà cơ thể ngƣời không tiêu hóa đƣợc và đóng vai trò tạo nên độ cứng cho nấm Linh Chi (Upton và cộng sự, 2000).
Có rất nhiều peptidoglycan có hoạt tính sinh học trong nấm Linh Chi đã đƣợc phân lập, bao gồm proteoglycan (GLPG) có tác dụng kháng virus, tăng cƣờng miễn dịch (Ji và cộng sự, 2007) và F3 là một glycoprotein trong cấu trúc có chứa fucose (Chien và cộng sự, 2004). Triterpen Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là một bội số của 5, ví dụ nhƣ menthol (monoterpene) và β-carotene (tetraterpene). Phần lớn các terpenoid thuộc nhóm alkene, một số có chứa những nhóm chức năng, đa phần các terpenoid có cấu trúc mạch vòng. Những hợp chất này đƣợc tìm thấy trên rất nhiều loài thực 4 Chƣơng 1.
Tổng quan vật. Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lƣợng chất béo. Terpenoid đƣợc tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch quả, ví dụ nhƣ hƣơng thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe (Haralampidis và cộng sự, 2002). Triterpen là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30.
Khối lƣợng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpen có cấu trúc hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato và cộng sự, 1997; Zhou và cộng sự, 2007). Trong nấm Linh Chi, cấu trúc hóa học của triterpenes có dạng lanostane, đây là chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis và cộng sự, 2002). Có hơn 50 triterpenes đƣợc tìm thấy trong nấm Linh Chi. Đa số các triterpenes là các acid ganoderic và lucidenic, nhƣng cũng có một số loại khác nhƣ là acid ganoderal, ganoderiol và ganodermic (Chen và cộng sự, 2010).2 Công thức cấu tạo của một số triterpen trong nấm Linh Chi (Kubota và cộng sự, 1982; Nishitoba và cộng sự, 1984;Sato và cộng sự, 1986; Budavari và cộng sự, 1989) Nấm Linh Chi rất giàu hàm lƣợng các triterpen, những chất này cũng góp phần tạo nên vị đắng của nấm Linh Chi.
Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, nhƣ khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lƣợng chất béo trong cơ thể. Tổng quan Tuy nhiên, hàm lƣợng triterpen trong nấm Linh Chi lại không ổn định. Chúng phụ thuộc rất nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng nhƣ phƣơng pháp chế biến (Chen và cộng sự, 1999).