MỞ ĐẦU Nhu cầu sử dụng lƣơng thực, thực phẩm và rau xanh ở Việt Nam ngày càng gia tăng. Do đó, trong sản xuất nông nghiệp, ngƣời ta luôn tìm kiếm, nghiên cứu các giải pháp để nâng cao hiệu quả sản xuất cây trồng. Sử dụng chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc xem là một trong những giải pháp tốt trong nông nghiệp để thúc đẩy nhanh quá trình tăng trƣởng của cây. Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là những chất có khả năng điều tiết sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật từ khi nảy mầm đến khi lão hóa và chết.
Trong tự nhiên, các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật còn đƣợc gọi là các hoocmon sinh trƣởng thực vật, là những chất đƣợc sinh ra trong cây. Bằng con đƣờng hóa học nhân tạo, nhiều hợp chất khác nhau, có hoạt tính tƣơng tự với các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật tự nhiên đƣợc tổng hợp nhân tạo và dùng để điều chỉnh quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây nhằm tăng năng suất và phẩm chất của cây trồng. Có hai nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thực vật gồm: nhóm chất kích thích sinh trƣởng thực vật (auxin, gibberellin và cytokinin.), có vai trò thúc đẩy sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật và nhóm chất ức chế sinh trƣởng thực vật (absicic, ethylen và các hợp chất phenol.), có chức năng kìm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật để chuyển sang thời kỳ ra hoa, kết quả, hoặc chín. Trên thị trƣờng, nhiều loại hóa chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc buôn bán và sử dụng ở các dạng khác nhau nhƣ: dạng bột, dạng lỏng hoặc dạng phối trộn cùng với các loại phân bón khác.
Trong đó, nhiều hóa chất đƣợc sản xuất ở Việt Nam, một số loại khác đƣợc nhập khẩu từ các nƣớc trên thế giới và có cả những loại không nhãn mác, không có nguồn gốc xuất xứ. Nếu không đƣợc quản lý chặt chẽ và sử dụng đúng cách thì những chất này có thể tiềm ẩn những nguy cơ dẫn tới ô nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời sản xuất và tiêu dùng. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng từ nhiều năm nay. Việc sử dụng các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp cũng diễn ra khá phổ biến ở Việt Nam, tuy nhiên, rất ít công trình công bố nghiên cứu về phƣơng pháp phân tích và đánh giá dƣ lƣợng của các chất này trong các sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là rau xanh.
Mặt khác, có nhiều loại thuốc điều hòa sinh trƣởng thực vật không 2 có nhãn mác và nguồn gốc xuất xứ vẫn đƣợc nông dân truyền tai nhau sử dụng do hiệu quả nhanh chóng và vƣợt trội của chúng mang lại cho cây trồng. Đây là một trong những nguyên nhân tiềm ẩn có thể gây nên tình trạng ngộ độc thực phẩm và ô nhiễm môi trƣờng liên quan đến dƣ lƣợng của các hóa chất sử dụng trong sản xuất nông nghiệp. Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh”. Nghiên cứu này thành công sẽ là tiền đề cho việc phát triển và ứng dụng phƣơng pháp phân tích đánh giá dƣ lƣợng và thực trạng sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các loại rau xanh, các sản phẩm nông nghiệp và trái cây.
sản xuất ở nƣớc ta cũng nhƣ nhập khẩu từ các nƣớc trên thế giới. Đây cũng chính là cơ sở giúp các cơ quan chức năng, các nhà quản lý ban hành các chế tài và có phƣơng thức giám sát việc sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp một cách hiệu quả, đảm bảo sự phát triển sản xuất, an toàn cho ngƣời tiêu dùng và môi trƣờng sinh thái. Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Nghiên cứu xây dựng và phát triển phƣơng pháp phân tích đồng thời các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong rau xanh bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ bẫy ion. Áp dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để phân tích, đánh giá hiện trạng sử dụng, mức độ tồn dƣ và khả năng tích lũy của một số chất kích thích sinh trƣởng thực vật sử dụng trong rau tại một số quận/ huyện của Hà Nội.
Nội dung nghiên cứu của luận án: 1) Khảo sát các điều kiện tối ƣu của phƣơng pháp phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong rau, gồm: các điều kiện vận hành trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và các điều kiện của phƣơng pháp xử lý mẫu. 2) Xây dựng phƣơng pháp phân tích và đánh giá các thông số của phƣơng pháp. 3) Đánh giá hiện trạng dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh thu thập tại Hà Nội. 4) Đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự sinh trƣởng và phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng trong rau xanh.
Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật Chất kích thích sinh truởng thực vật (KTST) là nhóm các hợp chất hữu cơ nhƣ: auxin, gibberellin, cytokinin, brassinosteroid, jasmonate, salicyclic acid và strigolactone.; có tác dụng kích thích quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây [1]. Những chất này tác động lên sự sinh trƣởng của cây trồng theo cơ chế: (1) Kích thích tăng trƣởng thể tích tế bào ở lá, thân, quả [2-4]; (2) Kích thích hình thành tế bào mới, làm tăng cƣờng sự nảy chồi, đâm rễ, ra hoa [5-7]; (3) Bổ sung và tăng cƣờng hoạt động của các men trong quá trình sinh tổng hợp của cây bằng cách cung cấp thêm các chất vi lƣợng nhƣ Fe, Mn, Cu, Bo, Zn… [1]. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật 1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin α-NAA 2,4-D 2,4,5-T Picloram (C12H10O2) (C8H6Cl2O3) (C8H5Cl3O3) (C6H3Cl3N2O2) Dicama IAA IBA IPA (C8H6Cl2O3) (C10H9NO2) (C12H13NO2) (C11H11NO2) ICA 4-CI-IAA PAA β-IAA (C9H6NO2) (C10H8ClNO2) (C8H8O2) Hình 1.
Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm auxin 4 Auxin là một hoocmon thực vật có nguồn gốc từ axít amin tryptophan, đƣợc xác định và phân lập về mặt hóa học vào những năm 1930. Auxin có trong tất cả các bộ phận của cây với các nồng độ khác nhau, trong đó, nồng độ auxin ở mỗi vị trí là thông tin quan trọng của sự phát triển, đƣợc điều chỉnh chặt chẽ thông qua cả quá trình trao đổi chất và vận chuyển trong cây. Auxin hoạt động kết hợp hoặc đối lập với các hoocmon thực vật khác. Ví dụ, tỷ lệ nhất định của auxin với cytokinin trong các mô thực vật có ảnh hƣởng đến sự hình thành rễ của các cành giâm [8].
Cấu trúc hóa học của các hợp chất auxin đƣợc trình bày ở Hình 1. Ở cấp độ phân tử, tất cả các auxin đều là hợp chất có một vòng thơm và một nhóm axít cacboxylic. Trong đó, indole-3-acetic acid (IAA) là một dẫn xuất của indole-3- acetic acid, là monocacboxylic acid, hợp chất chứa acetic acid đƣợc liên kết với nguyên tử cacbon C3 của indole. IAA đƣợc xem là hợp chất quan trọng nhất của nhóm auxin, có vai trò tạo ra phần lớn các hiệu ứng auxin trong thực vật.
Là một auxin tự nhiên nên trạng thái cân bằng của IAA trong cây có thể đƣợc kiểm soát theo nhiều cách từ tổng hợp cho đến sự phân hủy các phân tử của nó tùy theo điều kiện môi trƣờng [9]. Có 5 hợp chất auxin trong tự nhiên gồm: IAA, 4-chloroindole-3-acetic acid (4-CI-IAA), indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA) và phenylacetic acid (PAA) [10, 11]. Bên cạnh đó, nhiều hợp chất tổng hợp có tính chất tƣơng tự auxin nhƣ: Indole-3-carboxylic acid (ICA); α-naphthaleneacetic acid (α-NAA); 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T); 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (tordon or picloram); 2- Methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid (dicamba), β-Indolyaxetic acid (AIA). Những auxin tổng hợp nhân tạo này cũng có khả năng kích thích sự phát triển của thực vật và đã đƣợc ứng dụng nhiều trong nông nghiệp và thƣơng mại.
Các đặc điểm, tính chất hóa lý nhƣ khối lƣợng mol phân tử, mật độ, diện tích bề mặt, màu sắc, trạng thái, nhiệt độ nóng chảy và độ tan của một số hợp chất auxin đƣợc trình bày ở Bảng 1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin (Nguồn: PubChem) Hợp chất KLPT Mật độ Diện tích Màu sắc, Nóng chảy Độ tan (g.cm-3) bề mặt (Å2) trạng thái (oC) IAA 175,187 1,4±0,1 53,1 Dạng rắn, 168-170 Không tan trong màu trắng nƣớc, tan trong etanol (50 mg.L-1) IBA 203,241 1,252 53,1 Tinh thể màu 125 Trong nƣớc: 250 trắng hơi mg.L-1 ở 20oC; vàng trong benzene: > 1000 g.L-1; Trong acetone, etanol, diethyl: 30-100 g.L-1 IPA 189,214 151,1 53,09 Tinh thể, 134-135 Trong nƣớc: 0,73 màu vàng g.L-1; etanol: 50 đến cam mg.mL-1 ICA 161,15 208 53,1 Tinh thể màu 232-234 Trong nƣớc: 5%; vàng nhạt etanol: 95% 4-CI-IAA 209,63 1,5±0,1 53,1 Dạng bột 179-180 Trong nƣớc: 0,42 màu trắng g.L-1 PAA 136,15 1,1 37,3 Dạng rắn 76-77 15 g.L-1 màu trắng 2,4-D 221,04 1,42 46,5 Màu trắng 140,5 Trong nƣớc: 900 hơi vàng mg.L-1; trong aceton: 67,3 g/400 mL; trong benzene 0,94 g/100 mL α-NAA 186,21 1,2±0,1 37,3 Màu trắng 135 Trong nƣớc: 0,42 g.L-1 (ở 20oC); tan nhẹ trong dung môi hữu cơ: benzene, aceton, acetic acid, chlorofom Dicamba 221,03 1,57 46,5 Màu trắng 114-116 Trong nƣớc: 4500 mg.L-1 ở 25oC; tan trong dung môi hữu cơ: methanol, aceton, chloroform, dichloromethane Picloram 241,45 - 76,2 Màu trắng 218,5 Trong nƣớc: 430 mg.L-1 (ở 25oC); tan trong các dung môi hữu cơ: aceton, acetonitrile, benzene, etanol, isopropanol 2,4,5-T 255,48 1,8 46,5 Màu trắng 154-158 Trong nƣớc: 238 hơi vàng mg. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin Gibberellin (GAs) là nhóm hoocmon thực vật đƣợc phát hiện sau auxin, đƣợc tổng hợp trong các mô non của chồi, có thể có trong rễ, hạt đang phát triển và lá cây [12]. Gibberellin chính là các diterpenoid acid đƣợc tổng hợp từ terpenoid trong thể hạt và sau đó đƣợc biến đổi thành dạng hoạt hóa sinh học trong lƣới nội chất và cytosol [13].
Các gibberellin đều dẫn xuất từ bộ khung ent-gibberellan và đƣợc tổng hợp thông qua ent-kauren. Các gibberellin đƣợc đặt tên theo thứ tự phát hiện của chúng là GA1, GA2, GA3. Trong đó, GA3 là gibberellin đầu tiên đƣợc mô tả cấu trúc và là chất có tác dụng sinh học lớn nhất. Hiện nay, có 126 gibberellin đƣợc xác định từ thực vật, nấm và vi khuẩn với công thức phân tử không chứa nitơ [14].
Gibberellin là các deterpene acid, với sự xuất hiện của cacbon 19 (C-19) hoặc cacbon 20 (C-20).