Luận Văn Thạc Sĩ: Thiết Lập Phương Pháp ELISA Để Chẩn Đoán Porcine Circovirus Type 2

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua thiết lập phương pháp elisa sử dụng kháng nguyên tự chế để chẩn đoán porcine circovirus type 2, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

• Tác giả: Lý Đức Việt
• Người hướng dẫn: Ts. Bùi Khánh Linh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Thiết lập phƣơng pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế để chẩn đoán porcine circovirus type 2
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
• 3. PHẦN 3: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp ELISA Chẩn Đoán Porcine Circovirus Type 2

Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus gây ra, đặc biệt là Porcine Circovirus Type 2 (PCV2). Việc sử dụng kháng nguyên tự chế trong phương pháp này không chỉ giúp nâng cao độ chính xác mà còn giảm chi phí cho người chăn nuôi. Nghiên cứu này nhằm thiết lập một quy trình ELISA hiệu quả, sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp từ virus PCV2, nhằm phát hiện kháng thể trong huyết thanh lợn.

1.1. Khái Niệm Về Virus Porcine Circovirus Type 2

Virus PCV2 là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến ở lợn, dẫn đến nhiều vấn đề nghiêm trọng trong chăn nuôi. Virus này có kích thước nhỏ, không có vỏ bọc và chứa ADN đơn. Việc hiểu rõ về virus này là cần thiết để phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Phương Pháp ELISA Trong Chẩn Đoán

Phương pháp ELISA cho phép phát hiện kháng thể kháng virus trong huyết thanh lợn một cách nhanh chóng và chính xác. Đặc biệt, việc sử dụng kháng nguyên tự chế giúp giảm thiểu chi phí và tăng tính khả thi trong việc áp dụng tại các trang trại.

II. Thách Thức Trong Việc Chẩn Đoán Bệnh Do Porcine Circovirus

Mặc dù phương pháp ELISA đã được áp dụng rộng rãi, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc chẩn đoán bệnh do Porcine Circovirus gây ra. Một trong những vấn đề lớn nhất là độ nhạy và độ đặc hiệu của các bộ kit thương mại hiện có. Nhiều bộ kit không đáp ứng được yêu cầu thực tiễn, dẫn đến việc chẩn đoán sai lệch.

2.1. Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Các Bộ Kit Hiện Có

Nhiều bộ kit thương mại có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao, điều này có thể dẫn đến việc bỏ sót các trường hợp nhiễm virus. Việc phát triển một phương pháp ELISA mới với kháng nguyên tự chế có thể giải quyết vấn đề này.

2.2. Chi Phí Cao Của Các Bộ Kit Nhập Khẩu

Chi phí cao của các bộ kit nhập khẩu là một rào cản lớn đối với người chăn nuôi. Việc phát triển kháng nguyên tự chế không chỉ giúp giảm chi phí mà còn tạo ra sản phẩm phù hợp với điều kiện thực tế tại Việt Nam.

III. Phương Pháp ELISA Sử Dụng Kháng Nguyên Tự Chế Để Chẩn Đoán PCV2

Nghiên cứu đã thiết lập một quy trình ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp từ protein ORF2 của virus PCV2. Phương pháp này đã được kiểm tra và cho thấy độ nhạy đạt 100% và độ đặc hiệu đạt 97.16%. Điều này chứng tỏ rằng phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh do PCV2.

3.1. Quy Trình Thiết Lập Phương Pháp ELISA

Quy trình thiết lập phương pháp ELISA bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, xử lý kháng nguyên và thực hiện phản ứng. Việc tối ưu hóa từng bước là rất quan trọng để đạt được kết quả chính xác nhất.

3.2. Đánh Giá Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Phương Pháp

Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế cho thấy kết quả khả quan. Điều này mở ra cơ hội cho việc áp dụng phương pháp này trong thực tiễn chăn nuôi.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp ELISA Trong Chẩn Đoán PCV2

Phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng virus PCV2 mà còn hỗ trợ trong việc điều tra dịch tễ học. Việc áp dụng phương pháp này trong thực tiễn sẽ giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh ở lợn.

4.1. Ứng Dụng Trong Chẩn Đoán Dịch Tễ Học

Phương pháp ELISA có thể được sử dụng để theo dõi sự lây lan của virus PCV2 trong các đàn lợn. Điều này giúp các nhà chăn nuôi có thể đưa ra các biện pháp phòng ngừa kịp thời.

4.2. Tác Động Đến Ngành Chăn Nuôi

Việc áp dụng phương pháp ELISA sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh do PCV2 gây ra, từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam.

V. Kết Luận Về Phương Pháp ELISA Sử Dụng Kháng Nguyên Tự Chế

Phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế đã chứng minh được tính hiệu quả trong việc chẩn đoán Porcine Circovirus Type 2. Nghiên cứu này không chỉ góp phần nâng cao chất lượng chẩn đoán mà còn mở ra hướng đi mới cho ngành thú y tại Việt Nam.

5.1. Tương Lai Của Phương Pháp ELISA Trong Chẩn Đoán

Với những kết quả đạt được, phương pháp ELISA có thể được phát triển thêm để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu, từ đó phục vụ tốt hơn cho công tác chẩn đoán và phòng chống dịch bệnh.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Ngành Chăn Nuôi

Ngành chăn nuôi cần chú trọng đầu tư vào nghiên cứu và phát triển các phương pháp chẩn đoán mới, nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe đàn lợn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hội chứng còi cọc sau cai sữa ở lợn (PMWS) do Porcine Circovirus type 2 (PCV2) gây ra là một trong những mối đe dọa nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuôi lợn toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Virus PCV2 thuộc họ Circoviridae, sở hữu cấu trúc đối xứng hình cầu với đường kính cực nhỏ chỉ khoảng 20 đến 25 nm và hệ gen ADN vòng đơn kích thước 1,7 đến 2,0 kb. Các thống kê dịch tễ học tại Việt Nam ghi nhận tỷ lệ nhiễm PCV2 trên các đàn lợn tăng mạnh từ 38,97% lên mức báo động 90,26% đến 96,47% tại nhiều vùng chăn nuôi trọng điểm. Khi bùng phát, hội chứng này làm suy giảm nghiêm trọng hệ miễn dịch của đàn lợn, gây tỷ lệ tử vong trực tiếp từ 4,6% đến 14,3%, đồng thời làm tăng mạnh nguy cơ bội nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm khác như PRRSV và Mycoplasma hyopneumoniae.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm xuất phát từ thực trạng hầu hết các bộ kit chẩn đoán huyết thanh học ELISA và vaccine phòng bệnh PCV2 tại thị trường trong nước đều phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn nhập khẩu với chi phí đắt đỏ. Điều này tạo gánh nặng tài chính lớn cho người chăn nuôi và gây khó khăn cho công tác giám sát dịch tễ học thú y diện rộng. Nhằm giải quyết triệt để rào cản này, nghiên cứu đặt mục tiêu sản xuất thành công protein capsid ORF2 tái tổ hợp của virus PCV2 bằng hệ thống biểu hiện Baculovirus, từ đó thiết lập quy trình xét nghiệm ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên tự chế đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đề tài được triển khai thực hiện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam phối hợp cùng Phòng Hóa sinh Miễn dịch thuộc Viện Thú y trên tập mẫu gồm 286 mẫu huyết thanh lợn thực địa. Thành công của luận văn mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp sinh phẩm chẩn đoán nội địa đạt độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 97,16%, giúp giảm khoảng 40% đến 50% chi phí xét nghiệm và tạo nguồn nguyên liệu chất lượng cao tiến tới sản xuất vaccine tiểu phần tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử virus học và kỹ thuật miễn dịch học hiện đại, tập trung vào cấu trúc di truyền của PCV2 và công nghệ tái tổ hợp protein. Hệ gen PCV2 chứa hai khung đọc mở chủ đạo, trong đó ORF1 mã hóa protein nhân lên 37,7 kDa và ORF2 mã hóa protein vỏ capsid có kích thước 27,8 kDa gồm 233 amino acid. Protein ORF2 mang toàn bộ các quyết định kháng nguyên (epitope) quan trọng có khả năng kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể trung hòa đặc hiệu cao.

Mô hình công nghệ cốt lõi được áp dụng là hệ thống biểu hiện Bac-to-Bac Baculovirus Expression System kết hợp tế bào côn trùng nhân chuẩn. Khác với hệ thống biểu hiện vi khuẩn E. coli, tế bào côn trùng cho phép thực hiện các biến đổi sau dịch mã chuẩn xác, giúp protein tái tổ hợp cuộn gập đúng cấu trúc không gian ba chiều và bảo tồn nguyên vẹn hoạt tính sinh học tự nhiên. Ba khái niệm chuyên ngành then chốt chi phối toàn bộ tiến trình bao gồm: tái tổ hợp gen chuyển vị điểm đặc hiệu (site-specific transposition) trên plasmid Bacmid, kỹ thuật nhuộm miễn dịch tế bào đơn lớp (ImmunoPeroxidase Monolayer Assay - IPMA), và kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzyme gián tiếp (Indirect ELISA) cố định kháng nguyên trên pha rắn.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm của đề tài bao gồm 286 mẫu huyết thanh lợn thực địa được cung cấp bởi Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương. Cỡ mẫu 286 được tính toán đảm bảo tính đại diện thống kê dịch tễ, thu thập theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên từ các đàn lợn tại các ổ dịch và vùng chăn nuôi tập trung. Máu được lấy từ tĩnh mạch cổ hoặc sau tai, ủ ở 37 độ C trong 60 phút và ly tâm tách huyết thanh ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó bảo quản nghiêm ngặt tại nhiệt độ âm 20 độ C.

Phương pháp phân tích được lựa chọn bao gồm kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gen ORF2 kích thước 702 bp, tách dòng vào vector pFastBac/NT-TOPO và chuyển hóa vào chủng vi khuẩn E. coli DH10Bac. Virus Baculovirus tái tổ hợp sau đó được tạo dòng trên tế bào SF21AE và biểu hiện thu hoạch protein trên dòng tế bào High FIVE ở nhiệt độ 27 độ C trong 72 giờ. Lý do lựa chọn tế bào High FIVE vì dòng tế bào này có năng suất biểu hiện protein cao gấp 10 lần so với tế bào SF9 thông thường và môi trường nuôi cấy không cần bổ sung huyết thanh động vật, tránh tối đa hiện tượng phản ứng chéo ngoài ý muốn. Protein tái tổ hợp gắn đuôi 6xHis-tag được tinh sạch bằng sắc ký ái lực kim loại, kiểm tra hoạt tính qua Western Blot với kháng thể pha loãng 1/5000 và tiến hành chuẩn độ bàn cờ hai chiều (Checkerboard Titration) để tối ưu hóa phản ứng ELISA. Toàn bộ lộ trình nghiên cứu thực nghiệm được hoàn thành đồng bộ trong mốc thời gian từ năm 2015 đến năm 2016.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình triển khai thực nghiệm đã đem lại các kết quả khoa học nổi bật với các số liệu chứng minh rõ ràng:

Thứ nhất, phản ứng RT-PCR đã nhân bản chính xác gen ORF2 với băng điện di sắc nét tại kích thước 700 bp. Trình tự gen giải mã dài 702 nucleotide mã hóa 233 amino acid, khi phân tích so sánh bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy mức độ tương đồng di truyền lên tới 99% so với chủng PCV2 chuẩn lưu hành tại Việt Nam do NAVETCO công bố, chỉ sai khác duy nhất 1 nucleotide.

Thứ hai, việc tạo dòng thành công trên vector chuyển và chuyển nạp vào tế bào côn trùng High FIVE đã biểu hiện mạnh mẽ protein ORF2 tái tổ hợp. Trên thử nghiệm Western Blot, protein tinh sạch thể hiện phản ứng kết hợp đặc hiệu cao duy nhất một băng protein với huyết thanh lợn kháng PCV2. Thử nghiệm IPMA xác nhận các tế bào côn trùng nhiễm virus tái tổ hợp bắt màu nâu đỏ đậm tập trung tại vùng nguyên sinh chất khi ủ với huyết thanh tối miễn dịch PCV2, trong khi các đối chứng âm hoàn toàn không đổi màu.

Thứ ba, chuẩn độ bàn cờ hai chiều đã xác lập được các thông số kỹ thuật tối ưu tuyệt đối cho phản ứng ELISA: nồng độ kháng nguyên ORF2 phủ giếng là 200 nanogram/giếng, độ pha loãng huyết thanh kiểm tra tối ưu là 1/50 và độ pha loãng kháng thể cộng hợp Anti-pig IgG-HRP là 1/6000. Ngưỡng giá trị mật độ quang cắt (cut-off) được xác định chính xác ở mức OD630 bằng 0,2171 dựa trên công thức trung bình mẫu âm cộng 3 lần độ lệch chuẩn.

Thứ tư, khi kiểm tra phân tích trên toàn bộ 286 mẫu huyết thanh thực địa, phương pháp ELISA tự chế phát hiện được 153 mẫu dương tính và 133 mẫu âm tính. Thử nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu chéo với các loại virus gây bệnh phổ biến trên lợn như PCV1, PRRSV và CSFV cho kết quả OD cực thấp chỉ 0,012, chứng minh hệ thống không bị bắt chéo.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân chính dẫn đến sự thành công và độ nhạy vượt trội của quy trình ELISA tự chế là nhờ việc lựa chọn hệ thống biểu hiện Baculovirus trên tế bào High FIVE. Protein capsid ORF2 được tổng hợp và cuộn gập hoàn hảo, bảo tồn trọn vẹn các epitope tự nhiên tương đương với hạt virus thật ngoài thực địa. Dữ liệu đối chiếu được xây dựng thành bảng ma trận 2x2 so sánh trực tiếp với hai phương pháp tham chiếu tiêu chuẩn là kit ELISA thương mại của hãng Shenzhen Lvshiyuan (Trung Quốc) và kỹ thuật IPMA.

Trong khi các phương pháp tham chiếu ghi nhận 149 mẫu dương tính và 137 mẫu âm tính, bộ kit ELISA tự chế đạt độ nhạy chẩn đoán tuyệt đối là 100% và độ đặc hiệu đạt 97,16%. Mức chênh lệch gồm 4 mẫu dương tính giả (chiếm tỷ lệ rất nhỏ khoảng 1,4%) phản ánh độ nhạy phân tích vượt trội của kháng nguyên tái tổ hợp tự chế đối với các mẫu huyết thanh có hiệu giá kháng thể thấp ở giai đoạn đầu nhiễm bệnh. Kết quả nghiên cứu có thể được trực quan hóa sinh động qua biểu đồ phân bố tần số giá trị OD giữa hai nhóm mẫu âm tính chuẩn và dương tính chuẩn với khoảng cách biệt rõ ràng qua đường ngưỡng cut-off 0,2171, cùng sơ đồ bố trí hệ thống kiểm chứng 16 giếng trên đĩa 96 giếng giúp kiểm soát chất lượng phản ứng đạt độ lặp lại cao.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển hóa các kết quả nghiên cứu thành các ứng dụng thực tiễn mang lại giá trị kinh tế cho ngành chăn nuôi, bốn nhóm giải pháp cụ thể được đề xuất:

Chuẩn hóa quy trình sản xuất kháng nguyên ở quy mô pilot: Chủ thể thực hiện là Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch thuộc Viện Thú y phối hợp cùng các phòng thí nghiệm trọng điểm. Mục tiêu đạt sản lượng tinh sạch 500 đến 1000 mg protein ORF2 tái tổ hợp tinh khiết trên mỗi mẻ nuôi cấy bioreactor trong mốc thời gian từ 6 đến 12 tháng tới, đảm bảo độ tinh sạch trên 95% phục vụ sản xuất sinh phẩm.

Thương mại hóa và đóng gói bộ kit ELISA chẩn đoán nội địa: Do các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y trong nước phối hợp với Học viện Nông nghiệp Việt Nam triển khai. Mục tiêu cung cấp ra thị trường bộ kit hoàn chỉnh đạt chứng nhận chất lượng của Cục Thú y trong thời gian 12 đến 18 tháng, giảm giá thành xét nghiệm từ 40% đến 50% so với kit nhập khẩu từ nước ngoài.

Phát triển nguyên liệu cho vaccine tiểu phần tái tổ hợp: Định hướng sử dụng hạt nano protein ORF2 (Virus-Like Particles - VLP) làm kháng nguyên đích để nghiên cứu công thức nhũ hóa vaccine vô hoạt thế hệ mới phòng hội chứng PMWS. Đơn vị chủ trì là các viện nghiên cứu chuyên ngành với lộ trình thử nghiệm tiền lâm sàng trên đàn lợn mục tiêu trong thời gian 24 đến 36 tháng.

Mở rộng mạng lưới giám sát dịch tễ định kỳ: Đề nghị Cục Thú y và các Chi cục Chăn nuôi Thú y địa phương áp dụng quy trình ELISA tự chế vào chương trình tầm soát dịch bệnh quốc gia với tần suất kiểm tra 6 tháng một lần tại các trang trại chăn nuôi quy mô trên 500 lợn nái, nhằm phát hiện sớm và khoanh vùng dập dịch hiệu quả.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo giá trị cao cho bốn nhóm đối tượng chuyên ngành:

Nhà khoa học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Thú y, Công nghệ Sinh học: Tài liệu cung cấp quy trình bài bản từ thiết kế mồi, tách dòng gen, chuyển nạp Bac-to-Bac đến kỹ thuật nuôi cấy tế bào côn trùng High FIVE, làm cơ sở phát triển các hệ thống biểu hiện protein cho nhiều loại mầm bệnh khác.

Cán bộ xét nghiệm tại các trung tâm chẩn đoán thú y trung ương và địa phương: Luận văn cung cấp sổ tay hướng dẫn chi tiết các bước chuẩn độ bàn cờ, xác định ngưỡng cut-off và bố trí hệ thống chứng âm, chứng dương trên đĩa 96 giếng để vận hành xét nghiệm huyết thanh học thường quy.

Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và sinh phẩm thú y: Luận văn mở ra hướng đi thương mại hóa khả thi, cung cấp đầy đủ thông số kỹ thuật tối ưu nồng độ kháng nguyên 200 nanogram và quy trình tinh sạch ái lực His-tag để sản xuất kit chẩn đoán và vaccine tiểu phần với chi phí thấp.

Bác sĩ thú y lâm sàng và chủ trang trại chăn nuôi lợn công nghiệp: Giúp hiểu rõ cơ chế bệnh sinh của PCV2, nhận biết triệu chứng còi cọc sau cai sữa và nắm vững nguyên lý đánh giá hiệu giá kháng thể nhằm xây dựng lịch tiêm phòng vaccine đạt hiệu quả miễn dịch tối đa.

Câu hỏi thường gặp

Virus PCV2 gây ra những tổn thất kinh tế cụ thể nào cho ngành chăn nuôi lợn? Virus PCV2 là căn nguyên chính gây hội chứng còi cọc sau cai sữa ở lợn từ 2 đến 17 tuần tuổi, làm suy giảm nghiêm trọng hệ miễn dịch lympho. Thiệt hại thể hiện qua việc giảm tốc độ tăng trọng hàng ngày, tăng tỷ lệ tiêu tốn thức ăn, nâng tỷ lệ tử vong đàn từ 4,6% lên tới 14,3% và làm lợn nái sảy thai hoặc thai gỗ.

Vì sao protein ORF2 được lựa chọn làm kháng nguyên chẩn đoán thay vì các vùng gen khác? Protein ORF2 mã hóa cho protein capsid vỏ ngoài có trọng lượng phân tử 27,8 kDa, chứa các epitope mang tính đặc hiệu loài cao nhất của virus PCV2. Trong khi ORF1 có độ tương đồng tới 86% với PCV1 không gây bệnh, ORF2 chỉ tương đồng khoảng 65% đến 67%, cho phép chẩn đoán phân biệt chính xác kháng thể kháng PCV2 mà không bị phản ứng chéo.

Hệ thống biểu hiện tế bào côn trùng High FIVE có ưu điểm gì vượt trội so với các hệ vi sinh khác? Tế bào High FIVE có khả năng biểu hiện protein ngoại lai cao gấp 10 lần so với tế bào SF9 hay SF21AE. Đặc biệt, dòng tế bào này có thể phát triển tốt trong môi trường không cần bổ sung huyết thanh động vật và có bộ máy biến đổi sau dịch mã hoàn chỉnh, giúp kháng nguyên tự chế giữ nguyên cấu trúc không gian ba chiều tự nhiên.

Độ tin cậy của phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế được kiểm chứng ra sao? Phương pháp được thẩm định nghiêm ngặt trên 286 mẫu huyết thanh thực địa đối chiếu với kit thương mại quốc tế và IPMA. Kết quả ghi nhận độ nhạy đạt mức 100% và độ đặc hiệu đạt 97,16%, giá trị OD phản ứng chéo với các virus nguy hiểm khác như PRRSV, CSFV và PCV1 chỉ ở mức 0,012, chứng minh độ tin cậy tương đương kit nhập khẩu.

Ngưỡng cut-off của phản ứng ELISA được tính toán dựa trên cơ sở khoa học nào? Ngưỡng cut-off được xác định bằng công thức toán học thống kê: giá trị OD trung bình của mẫu đối chứng âm chuẩn từ lợn sạch mầm bệnh SPF cộng với 3 lần độ lệch chuẩn, đạt giá trị chính xác là 0,2171. Mẫu thử nghiệm được kết luận dương tính khi tỷ số giữa OD mẫu trên OD ngưỡng lớn hơn 1,0.

Kết luận

Luận văn đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu thông qua 5 đóng góp khoa học và thực tiễn cốt lõi:

• Tách dòng và giải mã thành công gen ORF2 kích thước 702 bp mã hóa 233 amino acid với độ tương đồng 99% so với chủng PCV2 chuẩn tại Việt Nam.
• Thiết lập thành công hệ thống biểu hiện Baculovirus trên tế bào High FIVE, tạo nguồn protein capsid ORF2 tái tổ hợp mang đầy đủ đặc tính kháng nguyên tự nhiên.
• Tối ưu hóa chuẩn độ quy trình ELISA với nồng độ kháng nguyên 200 nanogram/giếng, huyết thanh pha loãng 1/50, conjugate 1/6000 và ngưỡng cut-off 0,2171.
• Thẩm định thành công trên 286 mẫu thực địa, xác lập độ nhạy chẩn đoán tuyệt đối 100% và độ đặc hiệu đạt 97,16%, hoàn toàn không phản ứng chéo với PCV1, PRRSV và CSFV.
• Đặt nền móng vững chắc cho việc tự chủ công nghệ sản xuất sinh phẩm chẩn đoán nội địa và cung cấp nguồn nguyên liệu chất lượng cao cho sản xuất vaccine trong 12 đến 24 tháng tới.

Các đơn vị nghiên cứu, phòng chẩn đoán thú y và doanh nghiệp quan tâm có thể khai thác, tiếp nhận chuyển giao quy trình công nghệ này để nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh và tối ưu hóa chi phí chăn nuôi bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirus nhằm mục đích chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp PCV2 dùng cho công tác chẩn đoán cũng như chế tạo văc xin tái tổ hợp phòng PCV2 đã được nghiên cứu và phát triển thành những sản phẩm thương mại ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên đây là hướng đi còn tương đối mới mẻ ở Việt Nam, đặc biệt trong lĩnh vực Thú y. Hiện nay, hầu hết các kít ELISA chẩn đoán PCV2 cũng như vắc xin tiểu phần phòng PCV2 đều phải nhập ngoại với giá thành quá cao, không đáp ứng được nhu cầu giá cả của người chăn nuôi cũng như phục vụ công tác phòng chống dịch PMWS do PCV2 gây ra. Do vây, chúng tôi mạnh dạn đề xuất ứng dụng hệ thống baculovirus nhằm tái tổ hợp các protein của PCV2 nhằm mục đích tạo kháng nguyên tái tổ hợp dùng trong ELISA chẩn đoán và bước đầu sản xuất protein tái tổ hợp có kháng nguyên tính làm nguyên liệu tiến tới sản xuất vắc xin phòng PCV2.

Mục tiêu của luận văn là tạo ra những chế phẩm sinh học có chất lượng tương đương nhưng giá thành thấp hơn so với các sản phẩm cùng loại nhập ngoại. Hơn nữa, việc xây dựng qui trình công nghệ sử dụng hệ thống biểu hiện baculovirus nhằm mục đích tái tổ hợp những protein quan trong dùng trong y tế và thú y là việc làm rất cần thiết, đáp ứng nhu cầu “Tự cung - Tự cấp” các chế phẩm sinh học cũng như tiếp cận và ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật của thế giới vào công tác chẩn đoán và phong trị bệnh cho vật nuôi tại Việt Nam. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trong công tác phòng chẩn đoán và chống các bệnh có liên quan đến vi rút PCV2, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “THIẾT LẬP PHƢƠNG PHÁP ELISA SỬ DỤNG KHÁNG NGUYÊN TỰ CHẾ ĐỂ CHẨN ĐOÁN PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2”. Luận văn gồm hai nội dung chính: A.

Sản xuất protein ORF2 tái tổ hợp của vi rút PCV2 dùng làm nguyên liệu thiết lập ELISA Việc sản xuất kháng nguyên tự chế bằng hệ thống biểu hiện baculovirus là rất quan trọng, quyết định sự thành công của luận văn. Sản phẩm của nội dung này sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để thiết lập ELISA dùng trong chẩn đoán ở nội dung 2. Thiết lập phƣơng pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh lợn bằng kháng nguyên tự chế 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Đây được xem là nội dung then chốt của luận văn. Việc thiết lập thành công ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế nhằm từng bước hoàn thiện và tiến tới chế tạo Kit ELISA chẩn đoán bệnh do vi rút PCV2 gây ra, có ý nghĩa quan trong trong công tác phòng và kiểm soát dịch bệnh của vật nuôi tại Việt Nam trong tương lai 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 2.1 Hiểu biết về vi rút Circo và bệnh do vi rút Circo gây ra 2. Lịch sử căn bệnh Virus PCV1 phát hiện năm 1974 trên môi trường tế bào dòng thận lợn PK15, Tuy nhiên, 8 năm sau đặc điểm của vi rút đã được chứng minh là có hình cầu, rất nhỏ, chứa một sợi ADN đơn và được đặt tên là Porcine circovirus(PCV). Năm 1995 các nhà phân loại học đã chỉ ra họ của vi rút PCV là Circoviridae dựa trên các cấu trúc đặc trưng của vi rút. Các thành viên khác của họ vi rút có thể gây bệnh: bệnh trên chim, bệnh tích ở mỏ và lông vũ trên vẹt, bệnh thiếu máu ở gà và bệnh trên chim bồ câu(John A.Ellis et al.