MỞ ĐẦU Ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirus nhằm mục đích chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp PCV2 dùng cho công tác chẩn đoán cũng như chế tạo văc xin tái tổ hợp phòng PCV2 đã được nghiên cứu và phát triển thành những sản phẩm thương mại ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên đây là hướng đi còn tương đối mới mẻ ở Việt Nam, đặc biệt trong lĩnh vực Thú y. Hiện nay, hầu hết các kít ELISA chẩn đoán PCV2 cũng như vắc xin tiểu phần phòng PCV2 đều phải nhập ngoại với giá thành quá cao, không đáp ứng được nhu cầu giá cả của người chăn nuôi cũng như phục vụ công tác phòng chống dịch PMWS do PCV2 gây ra. Do vây, chúng tôi mạnh dạn đề xuất ứng dụng hệ thống baculovirus nhằm tái tổ hợp các protein của PCV2 nhằm mục đích tạo kháng nguyên tái tổ hợp dùng trong ELISA chẩn đoán và bước đầu sản xuất protein tái tổ hợp có kháng nguyên tính làm nguyên liệu tiến tới sản xuất vắc xin phòng PCV2.
Mục tiêu của luận văn là tạo ra những chế phẩm sinh học có chất lượng tương đương nhưng giá thành thấp hơn so với các sản phẩm cùng loại nhập ngoại. Hơn nữa, việc xây dựng qui trình công nghệ sử dụng hệ thống biểu hiện baculovirus nhằm mục đích tái tổ hợp những protein quan trong dùng trong y tế và thú y là việc làm rất cần thiết, đáp ứng nhu cầu “Tự cung - Tự cấp” các chế phẩm sinh học cũng như tiếp cận và ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật của thế giới vào công tác chẩn đoán và phong trị bệnh cho vật nuôi tại Việt Nam. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trong công tác phòng chẩn đoán và chống các bệnh có liên quan đến vi rút PCV2, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “THIẾT LẬP PHƢƠNG PHÁP ELISA SỬ DỤNG KHÁNG NGUYÊN TỰ CHẾ ĐỂ CHẨN ĐOÁN PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2”. Luận văn gồm hai nội dung chính: A.
Sản xuất protein ORF2 tái tổ hợp của vi rút PCV2 dùng làm nguyên liệu thiết lập ELISA Việc sản xuất kháng nguyên tự chế bằng hệ thống biểu hiện baculovirus là rất quan trọng, quyết định sự thành công của luận văn. Sản phẩm của nội dung này sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để thiết lập ELISA dùng trong chẩn đoán ở nội dung 2. Thiết lập phƣơng pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh lợn bằng kháng nguyên tự chế 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đây được xem là nội dung then chốt của luận văn. Việc thiết lập thành công ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế nhằm từng bước hoàn thiện và tiến tới chế tạo Kit ELISA chẩn đoán bệnh do vi rút PCV2 gây ra, có ý nghĩa quan trong trong công tác phòng và kiểm soát dịch bệnh của vật nuôi tại Việt Nam trong tương lai 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 2.1 Hiểu biết về vi rút Circo và bệnh do vi rút Circo gây ra 2. Lịch sử căn bệnh Virus PCV1 phát hiện năm 1974 trên môi trường tế bào dòng thận lợn PK15, Tuy nhiên, 8 năm sau đặc điểm của vi rút đã được chứng minh là có hình cầu, rất nhỏ, chứa một sợi ADN đơn và được đặt tên là Porcine circovirus(PCV). Năm 1995 các nhà phân loại học đã chỉ ra họ của vi rút PCV là Circoviridae dựa trên các cấu trúc đặc trưng của vi rút. Các thành viên khác của họ vi rút có thể gây bệnh: bệnh trên chim, bệnh tích ở mỏ và lông vũ trên vẹt, bệnh thiếu máu ở gà và bệnh trên chim bồ câu(John A.Ellis et al.
Virus PCV 2 được phân lập tại Pháp năm 1997, những nghiên cứu tiếp theo chỉ ra sự rõ ràng sự hiện diện của kháng thể capsid riêng của PCV 2 và chính bản thân virus trong mô, huyết thanh. PCV 2 trên toàn cầu có sự tương đồng là 96 % và tương đồng ít nhất 60% so với PCV 1, sự khác nhau cơ bản nằm ở trên protein capsid. Nghiên cứu hồi cứu mẫu huyết thanh đã tìm ra kháng thể với PCV2 rất sớm từ năm 1969 ở Belgium,1970 tại Anh, 1973 tại Ireland và 1985 Tây Ban Nha. Kháng thể với PCV2 tìm thấy trong 13,6% từ mô liên kết từ lợn tại Canada năm 1985, dương tính với vi rút PCV2 tăng đến 72,4% năm 1989, và 66,7% năm 1997 (J.
Gillespie et al. Cấu trúc của vi rút PCV2 Hình 1.1: Cấu trúc của vi rút PCV2 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Theo như hình 2.1 (Merial Limited và Merial SAS, 2011) Circo vi rút có kích thước nhỏ, đường kính 20-25 nm, không có vỏ bọc, hình cầu đối xứng. Hạt vi rút cấu tạo bởi 60 tiểu đơn vị capsid, bọc lấy ADN đơn của vi rút, hệ gen bao gồm ADN đơn, kích thước 1,7-2 kb. Hiện nay, các chủng đã phân lập của PCV2 được chia thành 2 nhóm chính là PCV2a và PCV2b, ngoài ra còn có PCV2c và PCV2d ( chủ yếu ở Trung Quốc).
Sự khác nhau về đặc tính di truyền giữa các chủng phân lập là nguyên nhân các chủng có động lực khác nhau.M & McNeilly, (1998) Hệ gen của PCV2 gồm 11 khung dọc mở ORF (open reading frame)mã hóa cho các phân tử protein trong bộ gen, trong đó hai khung dọc mở chính (ORF1 và ORF2) theo hướng ngược nhau. Theo Meehan BM và cs (1999), ORF1 được xác định vị trí trên chuỗi dương tính và định hướng theo chiều kim đồng hồ. ORF1 mã hóa protein có trọng lượng phân tử 37,7 kDa. ORF1 của 2 chủng PCV1 và PCV2 có sự tương đồng về nucleotide và acid amin lần là 86% theo J.
Gillespie et al. Theo Dominique Mahe et al.Rathkjen et al. (2003) ORF2 nằm trên chuỗi bổ sung và định hướng ngược chiều kim đồng hồ, nó mã hóa cho protein cấu trúc của vi rút, chủ yếu liên quan đến sự hình thành vỏ capsid, có trọng lượng phân tử là 27,8 kDa của PCV. PCV1 and PCV2 có mức tương đồng trong ORF2 về trình tự nucleotide và amino acid lần lượt là 67%, 65%.
Trình tự acid amin trong ORF2 giữa 2 chủng PCV1 và PCV2 khác nhau tại vị trí 65-87, 113-139, 193-207 và PCV2 chủng Châu Âu và chủng Bắc Mỹ trong cấu trúc ORF2 tại đoạn acid amin 117-131 khác nhau 1 acid amin, vì vậy người ta sử dụng kháng thể nguồn gốc ORF2 như một công cụ để chẩn đoán phân biệt PCV. (1997) cho biết ORF3 được định vị trên chuỗi bổ sung, định hướng ngược chiều kim đồng hồ và chồng chéo lên ORF1. Nó mã hóa cho protein không phải cấu trúc với chiều dài 105 aa, có trọng lýợng phân tử là 11,8 kDa, không có vai trò trong quá trình nhân lên của vi rút nhưng có tác dụng gây apoptosis ở tế bào nhiễm và ảnh hưởng đến mầm bệnh trong cơ quan của cơ thể sống hay trong ống nghiệm, theo Kwang Soo Lyoo (2009) và Qiang Liu et al. ORF4 mã hóa cho protein có trọng lượng phân tử 6,5 kDa (vị trí nucleotide khoảng từ 912-733) có sự tương đồng về phân tử protein do ORF4 mã hóa với PCV1 là 83%, protein này giàu cysteine nhưng chưa rõ chức năng, theo Meehan B.
4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sức đề kháng PCV2 có sức đề kháng với nhiệt độ cao, formalin, pH thấp (Sebastian Knell et al.Có thể duy trì tính gây nhiễm trong điều kiện pH<2, nhưng giảm đi đáng kể ở pH= 11, gần như biến mất tại pH=12. PCV2 bất hoạt ở nhiệt độ 56°c trong 1h, trong 15’ ở 75°c và bị diệt ở 80°c trong 15’ (Welch J, Bienek và cs , 2006). Trong điều kiện khô, virus chịu được ở 120°c trong 30’.Có thể phân lập vi rút trong mẫu bệnh phẩm bảo quản ở -700 C (Ellis et al.
Virus khó bị tiêu diệt bằng thuốc tẩy rửachứa lipit hoà tan, iodine và phenol nhưng không hoạt động bởi các chất tẩy kiềm ( sodium hydroxide), tác nhân oxyt (sodium hypochlorite), hỗn hợp 1/4 ammonium, 2% các chất diệt trùng hỗn hợp 1(20% glutaraldehyde, 12% 2-propenal, polymervớiformaldehyde), hỗn hợp 2 (55 acidformic%, 7% glyoxylicacid) sau 120 phút ở 200C, nhưng tác dụng rất kém ở 100C (Meehan B. Loài mắc bệnh Theo John A.Ellis (2003) và Jimmerman (2012) thì PCV2 phổ biến trên toàn thế giới, lợn nhà và lợn rừng đều có thể mắc phải. Những loài khác, bao gồm cả con người không dễ mắc PVC2, không thấy các bệnh tích đại thể và tổn thương vi thể sau khi gây nhiễm PCV2 trên cừu và bê, kháng nguyên không tìm thấy trong các mô. Bằng phản ứng ELISA, John A.Ellis et al.
(2001) đã chứng minh ngựa, trâu, bò không cảm nhiễm với bệnh. Chuột lại là trung gian truyền bệnh PCV2, chuật nhắt và chuột nhà quanh những trại lợn dương tính với PCV2 và kháng thể được tìm thấy trong huyết thanh chuột gây nhiễm ( Jun Li et al. Lứa tuổi mắc bệnh Theo John C.Harding et al. (1998) thì hội chứng PMWS do PCV2 thường gây bệnh cho lợn từ 2-17 tuần tuổi, chủ yếu là lợn từ 2-5 tuần, tại thời điểm lợn không còn bú mẹ và không nhận được kháng thể từ mẹ.
Trong lứa tuổi mắc bệnh không có sự ảnh hưởng của tuổi đến số lượng vi rút trong huyết thanh và mức tổn thương mô bào. Chất chứa virus Virus có trong dịch mũi miệng,phân và nước tiểu, hạch amidan, phế quản, chất bài tiết của mắt nước bỏ, sữa, sữa non và tinh trùng của lợn bệnh. Theo 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Timmusk et al. (2006), ở lợn đực gây nhiễm virus được tìm thấy sau 5-35 ngày trong tinh dịch, kháng thể xuất hiện sau 11-90 ngày.
Virus xuất hiện ở máu lợn nái mang thai sau 7-14 ngày sau thụ tinh nhân tạo, trong lợn con chết lưu, thai bị sảy và lơn yếu khi sinh. Kháng nguyên và acid nucleic PCV2 thường được tìm thấy trong các hạch lympho sưng lớn (100%), 88% ở lách, 64% tại phổi, 35% tại thận và 15% tại gan cũng tìm thấy trong các đại thực bào tại trung tâm của các ổ viêm, biểu mô đường hô hấp, tế bào biểu mô, niêm mạc và hạ niêm mạc ruột non (Allan GM, 2000). Triệu chứng bệnh do virus PCV2 gây ra Hội chứng lợn còi cọc sau cai sữa phổ biến trên lợn từ 2-4 tháng tuổi, vào thời gian đó những con lợn bị nhiễm có biểu hiện lâm sàng có lượng virus tập trung trong huyết thanh cao nhất, thải virus ở mức độ cao và chứng minh một phản ứng kháng thể yếu hơn so với những con vật mắc bệnh cận lâm sàng. Lợn sau cai sữa và lợn thịt: bệnh tiến triển chậm.
Lợn kém vận động, gầy, giảm cân,lông thô, da xanh đôi khi trở nên vàng. Đôi khi nhợt nhạt thiếu máu không phục hồi do kết hợp với vi rút tác độngđến tủy xương hoặc do suy dinh dưỡng, (John A.SHarding et al.