ĐẶT VẤN ĐỀ Glycidyl ester (GE) là các chất sinh ra trong quá trình tinh chế dầu ăn, được xác định lần đầu tiên trong dầu cọ [35]. Sau đó, GE cũng được phát hiện với lượng đáng kể trong nhiều loại dầu thực vật tinh chế khác [23, 26, 35] và các thực phẩm có chứa dầu [21, 33, 34]. Độc tính của GE chưa được nghiên cứu đầy đủ, nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy phần lớn các GE sẽ chuyển hóa thành glycidol trong quá trình tiêu hóa [4, 7]. Chất chuyển hóa glycidol này được cho là một chất gây ung thư do tác động trên gen [12, 32] và đã được Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A (nhóm chất có khả năng gây ung thư cho người) [20].
Điều này đã dấy lên những lo ngại về nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe con người [41]. Vì vậy, tháng 2 năm 2018, Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã ban hành quy định ngưỡng tối đa đối với GE (tính theo glycidol) [14]. Hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam chưa có quy định chính thức nào về hàm lượng GE trong thực phẩm. Chính vì vậy, việc phát triển phương pháp định lượng để khảo sát hàm lượng GE trong các sản phẩm trên thị trường là rất cần thiết để cung cấp dữ liệu đánh giá nguy cơ, là cơ sở để cơ quan quản lý đề xuất ngưỡng an toàn của GE trong thực phẩm, đặc biệt là trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức.
Trong nhiều năm qua, có rất nhiều phương pháp định lượng GE đã được nghiên cứu và phát triển trên thế giới. Tuy nhiên, phần lớn các phương pháp hiện có chỉ xác định được GE trong dầu tinh chế, trong khi việc định lượng trên các nền mẫu phức tạp như thực phẩm (đặc biệt là các sản phẩm dinh dưỡng công thức) còn hạn chế. Cho đến nay, tại Việt Nam vẫn chưa có phương pháp phân tích tiêu chuẩn về xác định GE trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức. Vì vậy, khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng GC-MS/MS” được thực hiện với 2 mục tiêu sau: 1.
Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng GC-MS/MS. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng glycidyl ester trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức trên thị trường. Giới thiệu về glycidyl ester 1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa ❖ Công thức cấu tạo Glycidyl ester (GE) là ester của glycidol và các acid béo.
R: gốc acid béo Hình 1. Công thức cấu tạo của glycidyl ester + Glycidol có công thức cấu tạo là C3H6O2 và khối lượng phân tử là 74,08. Tên IUPAC của glycidol là oxiranylmethanol. Glycidol có các đồng phân quang học là (R) - (+) - glycidol và (S) - (-) – glycidol.
Glycidol (R) - (+) – glycidol (S) - (-) – glycidol Hình 1. Công thức cấu tạo của glycidol + Các acid béo tham gia ester hóa phụ thuộc vào loại dầu nhưng chủ yếu là các acid béo phổ biến như acid lauric, acid myristic, acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic và acid linolenic. ❖ Tính chất vật lý Các GE có độ phân cực và độ tan tương tự với các acylglycerol tương ứng. GE tan trong dung môi không phân cực như diethyl ether, hexan/ aceton, ethyl acetat và tan kém trong nước.
Điểm nóng chảy của GE hơi thấp hơn so với các acylglycerol tương ứng. Chiều dài của chuỗi acyl càng tăng thì độ phân cực càng giảm và nhiệt độ nóng chảy của GE càng tăng [12, 18]. Glycidol là chất lỏng không màu, tan trong nước và hầu hết các dung môi phân cực [12]. ❖ Tính chất hóa học Nhóm epoxid của GE phản ứng rất mạnh với nhiều loại nucleophile (như H2O, alcol, thiol, amin, acid…) gây mở vòng [40].
Ngoài ra, trong môi trường kiềm, khi có mặt Cl-, một lượng GE sẽ chuyển thành 3-MCPD [22, 35]. Nguồn gốc Hình 1. Sự hình thành GE từ DAG và MAG Nguồn GE duy nhất được xác định trong thực phẩm là từ dầu tinh chế, chúng được hình thành trong quá trình đun nóng diacylglycerol (DAG) hoặc monoacylglycerol (MAG) để loại bỏ một acid béo hoặc nước ở nhiệt độ cao (> 200°C) [8, 9, 27]. Tốc độ và mức độ hình thành GE phụ thuộc vào sự có mặt của tiền chất acylglycerol, thời gian và nhiệt độ [8, 19, 35].
GE không được phát hiện trong dầu thô, nguyên chất (chưa tinh chế) [35, 41]. Sự xuất hiện của glycidyl ester trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức Để đảm bảo cung cấp đủ chất dinh dưỡng cần thiết như vitamin A, D, E, K… cho người dùng, các sản phẩm dinh dưỡng công thức thường được bổ sung dầu thực vật tinh chế trong thành phần, dẫn đến sự xuất hiện một lượng đáng kể GE trong các sản phẩm này [5, 25, 30, 36, 39]. Độc tính ❖ Độc động học GE sau khi thủy phân thành glycidol sẽ được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa [4, 7]. Sự chuyển hóa của glycidol diễn ra nhanh bằng một số con đường enzyme (như liên hợp glutathione, hình thành mercapturate).
Phần lớn glycidol được bài tiết qua nước tiểu, lượng nhỏ bài tiết qua phân và qua hơi thở dưới dạng CO2. Ngoài ra, nhờ cấu trúc vòng epoxid, glycidol có thể liên kết cộng hóa trị với các đại phân tử của tế bào (như DNA và hemoglobin), do đó có thể gây đột biến gen và gây ra độc tính. ❖ Độc tính bán trường diễn 3 Ở cả chuột đực và chuột cái được sử dụng glycidol với liều khoảng 150 - 300 mg/ kg thể trọng/ ngày trong 16 ngày, các tổn thương thần kinh trung ương và thoái hóa tế bào ống thận đã được quan sát thấy. Thậm chí, liều trên 400 mg/ kg thể trọng/ ngày có thể gây chết tế bào thần kinh.
Sự thoái hóa ống thận cũng được thấy ở liều 400 mg/ kg thể trọng mỗi ngày sau 13 tuần điều trị. Độc tính thần kinh được quan sát thấy sau 28 ngày điều trị trên chuột cống với liều 200 mg/ kg thể trọng mỗi ngày với những bất thường trong dáng đi cùng các tổn thương của hệ thần kinh trung ương và ngoại vi [7, 12]. ❖ Độc tính trường diễn - Nguy cơ gây ung thư của glycidol Sử dụng glycidol trong thời gian dài làm tăng tỷ lệ mắc ung thư trên một số mô của chuột cống và chuột nhắt, thông qua cơ chế gây độc gen. Các nghiên cứu về khả năng gây ung thư ở chuột nhắt (liều 25 và 50 mg/ kg thể trọng mỗi ngày) và chuột cống (liều 37,5 và 75 mg/ kg thể trọng mỗi ngày) trong 2 năm cho thấy sự xuất hiện các khối u trên nhiều cơ quan ở chuột cả hai giới như u trung mô tinh hoàn, u xơ tuyến vú, u thần kinh đệm… Một nghiên cứu ngắn hạn khác trên dòng chuột chuyển gen cũng đã tìm thấy “bằng chứng rõ ràng” ở giống đực và “một số bằng chứng” ở giống cái về khả năng gây ung thư của glycidol [7, 12].
Đánh giá về nguy cơ gây ung thư của GE trên người cũng đã được thực hiện bởi Ủy ban chuyên gia về Phụ gia thực phẩm của FAO và WHO (JECFA) và Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA). Cả hai cơ quan khoa học đều áp dụng phương pháp tiếp cận biên độ phơi nhiễm (MoE) bằng cách sử dụng kết quả từ Chương trình Độc chất Quốc gia (NTP) về khả năng gây ung thư và đều kết luận rằng glycidol có nguy cơ gây độc gen và ảnh hưởng với sức khỏe con người [12, 29, 38]. - Độc tính sinh sản Giảm khả năng sinh sản ở giống đực đã được ghi nhận trên chuột cống và chuột nhắt (mức thấp nhất gây độc quan sát được (LOAEL) là 25 mg/ kg thể trọng mỗi ngày ở chuột có thể dẫn đến giảm 36% số lượng tinh trùng ở mào tinh) [12]. ❖ Phân loại về độc tính của glycidol Glycidol được Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A, ''có thể gây ung thư cho người” [20].
Ủy ban MAK của Đức đã xếp glycidol vào loại 2 (các chất được coi là chất gây ung thư cho người). Trong khung luật hóa chất của Châu Âu, glycidol đã được đưa vào Phụ lục I Hướng dẫn 67/548/EEC - các chất có đặc tính gây ung thư, đột biến và ảnh hưởng trên sinh sản (CMR), và được phân loại là Carc. Trong đánh giá an toàn thực phẩm có chứa DAG (2015), Ủy ban An toàn thực phẩm Nhật Bản (FSCJ) đã kết luận glycidol là chất gây 4 ung thư gây độc gen. Do đó, mức độ phơi nhiễm GE nên được giữ ở mức thấp nhất có thể theo nguyên tắc ALARA (thấp nhất có thể đạt được).
Quy định hiện hành Do nguy cơ đối với sức khỏe của GE, tháng 2 năm 2018, Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã quy định ngưỡng tối đa đối với GE (tính theo glycidol) [14] như sau: Bảng 1. Quy định ngưỡng tối đa đối với GE (tính theo glycidol) của EFSA Giới hạn tối đa của GE STT Loại thực phẩm (tính theo glycidol) (µg/kg) Dầu thực vật ở dạng sản phẩm cuối, hoặc dùng 1 làm nguyên liệu thực phẩm (trừ các đối tượng ở 1 000 mục 2) Dầu và chất béo thực vật dùng để sản xuất thức 2 ăn trẻ em và sản phẩm dinh dưỡng công thức 500 cho trẻ sơ sinh, trẻ em Sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ nhỏ, sản phẩm công thức Dạng bột 50 3 và thực phẩm cho mục đích y tế đặc biệt dùng cho trẻ sơ sinh và Dạng lỏng 6,0 trẻ em Hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam chưa có quy định chính thức nào về hàm lượng GE trong thực phẩm. Chính vì vậy, việc phát triển phương pháp định lượng để khảo sát hàm lượng GE trong các loại sản phẩm trên thị trường là việc rất cần thiết để cung cấp dữ liệu đánh giá nguy cơ, là cơ sở để cơ quan quản lý đề xuất ngưỡng an toàn của GE trong sản phẩm dinh dưỡng công thức. Phương pháp xác định glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức GE trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức thường được xác định bằng cách chiết chất béo từ nền mẫu, sau đó tiến hành định lượng GE trong dầu.
Chiết xuất chất béo từ sản phẩm dinh dưỡng công thức Sữa công thức là một nền mẫu phức tạp vì có thành phần đa dạng và hàm lượng chất béo rất khác nhau. Bên cạnh đó, các phương pháp chiết xuất chất béo truyền thống cũng có thể gây biến đổi GE trong mẫu. Điều này khiến cho việc xác định GE trong sữa công thức rất khó khăn.