Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng gc msms

Nghiên cứu phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng kỹ thuật GC-MS/MS, đảm bảo độ chính xác và tin cậy.

• Tác giả: Lê Thu Phương
• Người hướng dẫn: ThS. Ngô Minh Thúy
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Phương Pháp Định Lượng Glycidyl Ester Trong Sản Phẩm Dinh Dưỡng Bằng GC-MS/MS
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Giới thiệu về glycidyl ester
• 1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa
• 1.1.2. Nguồn gốc
• 1.2. Sự xuất hiện của glycidyl ester trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức
• 1.3. Độc tính
• 1.3.1. Độc động học
• 1.3.2. Độc tính bán trường diễn
• 1.3.3. Độc tính trường diễn - Nguy cơ gây ung thư của glycidol
• 1.3.4. Độc tính sinh sản
• 1.3.5. Phân loại về độc tính của glycidol
• 1.4. Quy định hiện hành
• 1.5. Phương pháp xác định glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức
• 1.5.1. Chiết xuất chất béo từ sản phẩm dinh dưỡng công thức
• 1.5.2. Phương pháp xác định glycidyl ester trong dầu
• 1.5.2.1. Định lượng gián tiếp
• 1.5.2.1.1. Thủy phân GE thành dạng glycidol tự do
• 1.5.2.1.1.1. Thủy phân GE bằng xúc tác acid
• 1.5.2.1.1.2. Thủy phân GE bằng xúc tác kiềm
• 1.5.2.2. Định lượng trực tiếp
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
• 2.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
• 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc
• 2.3.3. Chuẩn bị mẫu blank
• 2.4. Dung môi, hóa chất. Thiết bị, dụng cụ
• 2.5. Nội dung nghiên cứu
• 2.5.1. Xây dựng phương pháp phân tích
• 2.5.2. Thẩm định phương pháp phân tích
• 2.5.3. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế
• 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
• 3.2. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện GC-MS/MS
• 3.2.1. Điều kiện sắc kí khí
• 3.2.2. Điều kiện khối phổ
• 3.3. Thẩm định phương pháp
• 3.3.1. Độ phù hợp hệ thống
• 3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
• 3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế
• 3.4.1. Phương pháp xử lý mẫu
• 3.4.2. Phương pháp phân tích
• 3.4.3. Thẩm định phương pháp
• 3.4.4. Phân tích mẫu thực tế
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp Định Lượng Glycidyl Ester Bằng GC MS MS

Glycidyl ester (GE) là một nhóm hợp chất hữu cơ được hình thành trong quá trình tinh chế dầu thực vật. Việc định lượng GE trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức là rất quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm. Phương pháp GC-MS/MS đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác định hàm lượng GE. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện GE mà còn cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc và tính chất của chúng.

1.1. Glycidyl Ester Là Gì Và Tại Sao Quan Trọng

Glycidyl ester là các ester của glycidol và các acid béo. Chúng có mặt trong nhiều loại dầu thực vật và thực phẩm chế biến. Việc xác định hàm lượng GE là cần thiết để đánh giá nguy cơ sức khỏe, đặc biệt là trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức.

1.2. Lợi Ích Của Phương Pháp GC MS MS Trong Định Lượng GE

Phương pháp GC-MS/MS cho phép phân tích chính xác và nhạy cảm các hợp chất hữu cơ. Nó giúp phát hiện GE với độ chính xác cao, từ đó cung cấp dữ liệu cần thiết cho việc đánh giá an toàn thực phẩm.

II. Thách Thức Trong Việc Định Lượng Glycidyl Ester Trong Sản Phẩm Dinh Dưỡng

Việc định lượng GE trong sản phẩm dinh dưỡng công thức gặp nhiều thách thức do tính phức tạp của mẫu. Các thành phần khác nhau trong sản phẩm có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Hơn nữa, các phương pháp chiết xuất truyền thống có thể làm biến đổi GE, dẫn đến kết quả không chính xác.

2.1. Tính Phức Tạp Của Mẫu Sản Phẩm Dinh Dưỡng

Sản phẩm dinh dưỡng công thức thường chứa nhiều thành phần khác nhau, từ protein đến carbohydrate, điều này làm cho việc chiết xuất và phân tích GE trở nên khó khăn hơn.

2.2. Ảnh Hưởng Của Các Phương Pháp Chiết Xuất

Các phương pháp chiết xuất truyền thống có thể gây biến đổi GE, làm giảm độ chính xác của kết quả. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác trong phân tích.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Chất Béo Từ Sản Phẩm Dinh Dưỡng

Chiết xuất chất béo là bước đầu tiên trong quy trình định lượng GE. Có nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau, mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp sẽ ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng.

3.1. Phương Pháp Chiết Xuất Folch

Phương pháp Folch sử dụng hỗn hợp cloroform và methanol để chiết xuất chất béo. Mặc dù hiệu quả, phương pháp này có thể gây biến đổi GE do sự hiện diện của ion Cl-.

3.2. Phương Pháp Chiết Xuất Dubois

Phương pháp Dubois sử dụng ethyl acetat và nước khử khoáng, cho kết quả chiết xuất tốt nhất. Phương pháp này đơn giản và hiệu quả trong việc thu hồi chất béo từ sản phẩm dinh dưỡng.

IV. Phương Pháp Định Lượng Glycidyl Ester Trong Dầu

Có hai phương pháp chính để định lượng GE trong dầu: định lượng gián tiếp và định lượng trực tiếp. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng.

4.1. Định Lượng Gián Tiếp

Phương pháp định lượng gián tiếp bao gồm việc thủy phân GE thành glycidol tự do trước khi phân tích. Phương pháp này thường sử dụng GC-MS/MS để xác định hàm lượng glycidol.

4.2. Định Lượng Trực Tiếp

Định lượng trực tiếp cho phép xác định từng loại GE mà không cần qua bước thủy phân. Phương pháp này thường sử dụng LC-MS/MS, mang lại độ chính xác cao hơn trong việc phân tích.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp Định Lượng GE

Việc áp dụng phương pháp định lượng GE trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức giúp cung cấp dữ liệu quan trọng cho các cơ quan quản lý. Điều này không chỉ giúp đảm bảo an toàn thực phẩm mà còn hỗ trợ trong việc xây dựng các quy định về hàm lượng GE trong thực phẩm.

5.1. Đánh Giá Hàm Lượng GE Trong Sản Phẩm Thực Tế

Phương pháp định lượng GE đã được áp dụng để đánh giá hàm lượng GE trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức trên thị trường, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho người tiêu dùng.

5.2. Hỗ Trợ Xây Dựng Quy Định An Toàn Thực Phẩm

Dữ liệu từ việc định lượng GE sẽ giúp các cơ quan quản lý xây dựng các quy định an toàn thực phẩm, đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng.

VI. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Glycidyl Ester

Nghiên cứu về glycidyl ester và phương pháp định lượng của chúng đang ngày càng trở nên quan trọng. Việc phát triển các phương pháp phân tích chính xác sẽ giúp đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Tương lai của nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc cải thiện các phương pháp hiện có và phát triển các quy định an toàn thực phẩm mới.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Về GE

Nghiên cứu về GE không chỉ giúp hiểu rõ hơn về độc tính của chúng mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp phân tích hiệu quả hơn.

6.2. Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu

Tương lai của nghiên cứu về GE sẽ tập trung vào việc phát triển các phương pháp phân tích mới, cải thiện độ chính xác và độ nhạy của các phương pháp hiện có.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ với đề tài "Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng GC-MS/MS" do sinh viên Lê Thu Phương thực hiện năm 2022 tại Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội phối hợp với Khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của ThS. Ngô Minh Thúy và ThS. Lê Hồng Dũng.

Về bối cảnh thực tiễn, glycidyl ester (GE) là nhóm tạp nhiễm hóa học sinh ra trong quá trình tinh chế dầu thực vật ở nhiệt độ cao (trên 200°C) thông qua phản ứng nhiệt phân tách một phân tử acid béo hoặc nước từ diacylglycerol (DAG) hoặc monoacylglycerol (MAG). GE được phát hiện lần đầu tiên trong dầu cọ và sau đó ghi nhận tồn tại ở hàm lượng đáng kể trong nhiều loại dầu thực vật tinh chế khác cũng như trong các sản phẩm thực phẩm chế biến chứa chất béo. Mặc dù độc tính trực tiếp của GE chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn, các bằng chứng sinh học đã chỉ ra rằng khi đi vào đường tiêu hóa, phần lớn GE sẽ bị thủy phân giải phóng thành glycidol tự do. Glycidol là chất chuyển hóa có khả năng liên kết cộng hóa trị với các đại phân tử tế bào như DNA và hemoglobin, gây đột biến gen và dẫn đến ung thư. Chất này đã được Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A (nhóm chất có khả năng gây ung thư cho người) và được Ủy ban An toàn thực phẩm Nhật Bản (FSCJ) khẳng định là chất gây ung thư gây độc gen, cần duy trì mức độ phơi nhiễm ở ngưỡng thấp nhất có thể đạt được (ALARA).

Trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức dành cho trẻ em và người lớn, dầu thực vật tinh chế thường xuyên được bổ sung vào thành phần nhằm cung cấp năng lượng và hòa tan các vi chất dinh dưỡng thiết yếu tan trong dầu như vitamin A, D, E, K. Điều này dẫn đến sự hiện diện của một lượng đáng kể GE trong thành phẩm. Tháng 2 năm 2018, Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã ban hành quy định ngưỡng tối đa cho phép (ML) đối với GE tính theo glycidol, cụ thể là 50 µg/kg đối với sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột và 6,0 µg/kg đối với dạng lỏng. Tại Việt Nam, Bộ Y tế chưa ban hành quy định chính thức nào về giới hạn hàm lượng GE trong thực phẩm, đồng thời chưa có phương pháp phân tích tiêu chuẩn để định lượng chất này trên các nền mẫu thực phẩm phức tạp.

Khóa luận được xác định thực hiện nhằm hoàn thành hai mục tiêu cụ thể:

1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng GC-MS/MS.
2. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng glycidyl ester trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức trên thị trường.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các glycidyl ester (GE). Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các mẫu sản phẩm dinh dưỡng công thức ở dạng bột đang lưu hành trên thị trường thành phố Hà Nội, gồm 8 sản phẩm được mã hóa thành hai nhóm: nhóm sản phẩm nội địa (ký hiệu NĐ) và nhóm sản phẩm nhập khẩu (ký hiệu NK). Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm trong năm 2022 tại hệ thống phòng thí nghiệm của Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Dinh dưỡng Quốc gia.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của đề tài dựa trên cấu tạo hóa học và tính chất biến đổi của glycidyl ester. GE là hợp chất ester tạo thành giữa glycidol (C3H6O2, phân tử khối 74,08; danh pháp IUPAC là oxiranylmethanol) với các acid béo phổ biến như acid lauric, acid myristic, acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic và acid linolenic. Do mang nhóm chức epoxid có hoạt tính phản ứng cao, GE dễ bị mở vòng khi tiếp xúc với các tác nhân ái nhân (nucleophile) và có xu hướng chuyển hóa thành 3-MCPD trong môi trường kiềm khi có sự xuất hiện của ion Cl-. GE có tính phân cực kém và tính chất vật lý tương tự như acylglycerol nền mẫu, gây cản trở lớn cho việc tách chiết trực tiếp.

Do sự thiếu hụt các chất chuẩn thương mại đối với từng dạng GE riêng lẻ (thị trường chỉ có sẵn khoảng 7 chất chuẩn) và độ chọn lọc thấp của phương pháp tách chiết chất béo, nghiên cứu tiếp cận theo hướng định lượng gián tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý chuyển hóa toàn bộ các dạng GE thành một dẫn chất trung gian duy nhất là glycidol tự do hoặc dẫn chất halogen hóa bền vững, sau đó tiến hành dẫn xuất hóa để phân tích trên hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS).

Quy trình xử lý mẫu thực nghiệm được cải tiến từ phương pháp chiết lỏng - lỏng của Dubois và cộng sự (2019):

• Chiết xuất chất béo: Cân chính xác khoảng 0,50 g mẫu bột dinh dưỡng công thức vào ống falcon 50 ml, bổ sung 50 µL chất chuẩn nội Gly-P-d5 nồng độ 1 µg/ml, thêm 12 ml nước cất và 12 ml ethyl acetat. Hỗn hợp được siêu âm ở nhiệt độ 50°C trong 15 phút, lắc ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 3 phút, thêm 10 g Na2SO4 và ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 10 phút. Dịch chiết ethyl acetat được thu nhận, lặp lại quá trình chiết lần hai, gộp dịch chiết và làm bay hơi dung môi trên máy cô quay chân không ở 40°C.
• Phản ứng brom hóa và thủy phân: Cắn dầu sau cô quay được hòa tan lại trong 4 ml tetrahydrofuran (THF). Hút 2 ml dung dịch này để tiến hành phản ứng chuyển vị trí epoxid của GE thành 3-monobromopropan-1,2-diol ester (3-MBPDE) bằng 30 µL dung dịch NaBr 3 mg/ml trong H2SO4 5% (thể tích/thể tích) cùng 1,0 ml n-heptan. Phản ứng được chặn bằng 3 ml NaHCO3 0,6%. Sau đó, mẫu được thủy phân bằng 1,8 ml dung dịch H2SO4/methanol 1,8% ở 40°C trong 16-20 giờ để giải phóng 3-monobromopropan-1,2-diol (3-MBPD) tự do.
• Dẫn xuất hóa: Hỗn hợp sau thủy phân được trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 bão hòa, rửa tạp kém phân cực bằng n-heptan, sau đó chiết tách 3-MBPD bằng ethyl acetat. Dịch chiết được làm khô và dẫn xuất hóa với 150 µL acid phenylboronic (PBA) 4% trong diethyl ether, siêu âm 5 phút ở nhiệt độ thường, thổi khô bằng khí N2 ở 40°C đến còn khoảng 50 µL, hòa tan lại trong n-heptan và chuyển vào lọ tiêm mẫu sắc ký.

Phương pháp phân tích công cụ sử dụng hệ thống sắc ký khí GC Trace 1310 ghép nối khối phổ ba tứ cực TSQ 8000 Evo của hãng Thermo Fisher Scientific. Cột sắc ký là HP5-MS kích thước 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm (pha tĩnh 5% phenyl methylpolysiloxan). Khí mang Heli độ tinh khiết 99,99% với tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích tiêm 0,5 µL ở chế độ không chia dòng (splitless). Chương trình nhiệt độ lò cột: ban đầu giữ ở 60°C trong 1 phút, tăng 10°C/phút lên 200°C, tiếp tục tăng 25°C/phút lên 250°C và duy trì ở 260°C khi kết thúc phân tích. Đầu dò khối phổ vận hành ở chế độ ion hóa va chạm điện tử (EI, 70 eV), nhiệt độ buồng nguồn ion và đường truyền nhiệt đều đặt ở 280°C, thời gian trễ dung môi là 3 phút.

Phương pháp được thẩm định toàn diện theo các văn bản tiêu chuẩn quốc tế: Quy định Ủy ban châu Âu EC 808/2021, Hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức AOAC (2016) và Tiêu chuẩn tính năng phương pháp chuẩn đối với GE trong sản phẩm dinh dưỡng công thức AOAC SMPR® 2017.017. Các chỉ tiêu thẩm định gồm: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu (điểm nhận dạng IP và tỷ lệ ion), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính của đường chuẩn, độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại RSD).

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu gồm:

• Dữ liệu đo phổ thực nghiệm trích xuất tự động qua phần mềm chuyên dụng Thermo Xcalibur và Thermo TraceFinder.
• Hóa chất chuẩn: Glycidyl palmitat (Gly-P, độ tinh khiết 93,23%, hãng HPC Standards GmbH Đức) và chất chuẩn nội biến tính đồng vị Glycidyl palmitat-d5 (Gly-P-d5, độ tinh khiết 96%, hãng TRC Canada).
• Nền mẫu trắng (blank): Sữa bột nguyên kem Cô gái Hà Lan (không phát hiện có sự hiện diện của GE).

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Tổng quan

Chương này tổng kết cơ sở lý luận về cấu trúc phân tử, tính chất lý hóa, cơ chế hình thành và độc tính học của glycidyl ester. Tác giả chỉ ra rằng nguồn gốc duy nhất sinh ra GE trong thực phẩm bắt nguồn từ khâu khử mùi ở nhiệt độ cao của dầu thực vật tinh chế, hoàn toàn không tìm thấy trong dầu thô chưa qua xử lý nhiệt. Về mặt độc tính học, các công trình nghiên cứu trên động vật thực nghiệm (chuột cống và chuột nhắt) của Chương trình Độc chất Quốc gia Hoa Kỳ (NTP) cho thấy glycidol gây tổn thương hệ thần kinh trung ương, thoái hóa tế bào ống thận ở mức liều 150-300 mg/kg thể trọng/ngày và làm suy giảm 36% số lượng tinh trùng ở mào tinh chuột đực tại mức liều thấp nhất gây độc tính quan sát được (LOAEL = 25 mg/kg thể trọng/ngày). Các nghiên cứu trường diễn 2 năm ghi nhận tỷ lệ xuất hiện các khối u ác tính gia tăng rõ rệt (u xơ tuyến vú, u trung mô tinh hoàn, u thần kinh đệm).

Chương 1 cũng tổng thuật chi tiết các quy định pháp lý quốc tế của EFSA, JECFA và phân loại hóa chất của Liên minh châu Âu (Chỉ thị 67/548/EEC xếp glycidol vào nhóm chất gây ung thư, đột biến và độc tính sinh sản - CMR). Về mặt kỹ thuật phân tích, tác giả so sánh ba phương pháp xác định gián tiếp chính thức được công nhận bởi Hiệp hội Hóa học Dầu mỏ Hoa Kỳ (AOCS): AOCS Cd 29a-13 (phương pháp Unilever dùng thủy phân acid), AOCS Cd 29b-13 (phương pháp SGS dùng thủy phân kiềm ở nhiệt độ -22°C trong 18 giờ) và AOCS Cd 29c-13 (phương pháp DGF dùng thủy phân kiềm nhanh bằng methoxit/methanol). Tác giả phân tích rõ ưu thế của phản ứng mở vòng bằng NaBr và thủy phân acid H2SO4/methanol so với môi trường kiềm, do hạn chế được nguy cơ chuyển hóa không mong muốn giữa GE và 3-MCPD.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương trình bày chi tiết về danh mục trang thiết bị, hóa chất tinh khiết phân tích, phương pháp chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc (1 mg/ml trong toluene), dung dịch chuẩn làm việc Cal 1 (5 µg/ml), Cal 2 (0,1 µg/ml) và chuẩn nội IS (1 µg/ml) tính theo dạng tự do. Quy trình pha dãy dung dịch chuẩn hiệu chuẩn gồm 6 điểm nồng độ (C1 đến C6 tương ứng từ 0,005 µg/ml đến 1,00 µg/ml) được thiết lập cụ thể. Tác giả luận giải việc lựa chọn sữa bột nguyên kem Cô gái Hà Lan làm mẫu blank đại diện dựa trên cơ sở sản phẩm này sản xuất từ sữa tươi nguyên kem đông khô, không bổ sung dầu thực vật tinh chế, kết quả kiểm tra sắc ký không xuất hiện tín hiệu nền tại thời gian lưu của chất phân tích.

Chương này cũng thiết lập cụ thể quy trình thao tác chuẩn cho việc xử lý mẫu thực tế và mẫu thêm chuẩn, đồng thời quy định cụ thể các tiêu chí nghiệm thu kỹ thuật khi thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn quốc tế: độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ phù hợp hệ thống không quá 2,0%; độ đặc hiệu phải đạt tối thiểu 4 điểm nhận dạng (IP) theo EC 808/2021 với độ lệch tỷ lệ ion trong khoảng ± 40%; giới hạn định lượng LOQ phải đạt mức ≤ 15 µg/kg theo tiêu chuẩn AOAC SMPR® 2017.017; hệ số tương quan tuyến tính R ≥ 0,995; độ thu hồi nằm trong dải 70 - 125% và độ lặp lại RSD ≤ 22%.

Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương thực nghiệm tập trung vào quá trình khảo sát điều kiện vận hành thiết bị, quy trình xử lý mẫu, báo cáo dữ liệu thẩm định và phân tích mẫu thương mại.

Về tối ưu hóa thiết bị khối phổ GC-MS/MS, tác giả tiến hành bắn phá phân mảnh các ion mẹ và khảo sát năng lượng va chạm (CE) ở chế độ giám sát chọn lọc ion (SIM/SRM) trên dung dịch chuẩn 300 ppb:

• Đối với dẫn xuất PBA-3-MBPD của chất phân tích: Khảo sát thấy hai mảnh mẹ m/z 240,0 và m/z 147,1. Tuy nhiên chỉ có ion mẹ m/z 240,0 bắn phá tạo ra được hai ion con đặc trưng là m/z 147,1 và m/z 91,1. Nhóm nghiên cứu chọn ion mẹ m/z 240,0 phân mảnh thành ion con định lượng m/z 147,1 (năng lượng va chạm tối ưu CE = 5 eV) và ion con định tính m/z 91,1 (năng lượng va chạm tối ưu CE = 25 eV).
• Đối với dẫn xuất PBA-3-MBPD-d5 của chất chuẩn nội: Khảo sát được ba cặp phân mảnh đặc trưng gồm 150,1 → 93,1; 245,0 → 150,1 và 245,0 → 93,1. Mặc dù mảnh 150,1 → 93,1 cho cường độ tín hiệu cao hơn, phổ sắc ký lại ghi nhận mức độ nhiễu nền lớn. Do đó, nghiên cứu lựa chọn ion mẹ m/z 245,0 phân mảnh thành ion con định lượng m/z 150,1 (CE = 5 eV) và ion con định tính m/z 93,1 (CE = 25 eV) nhằm loại bỏ triệt để nhiễu đường nền.

Về xử lý mẫu, tác giả đã điều chỉnh lượng dung môi hòa tan lại cắn dầu sau khi cô quay chân không từ 2 ml THF (theo nghiên cứu gốc của Dubois) lên 4 ml THF do bình cô quay quả nhót có dung tích lớn (100 ml), việc hòa tan lượng cắn bằng 2 ml gặp nhiều khó khăn kỹ thuật. Sau khi hòa tan bằng 4 ml THF, nhóm nghiên cứu trích 2 ml dung dịch để thực hiện các phản ứng tiếp theo.

Kết quả thẩm định phương pháp thực nghiệm ghi nhận:

• Độ phù hợp hệ thống: Đo lặp lại 6 lần trên mẫu chuẩn nồng độ 0,1 µg/ml cho thời gian lưu trung bình đạt 13,07 phút với RSD = 0,14%; diện tích pic trung bình đạt 903.765 với RSD = 1,95% (đều đạt yêu cầu ≤ 2,0%).
• Độ đặc hiệu: Sắc ký đồ mẫu blank không xuất hiện pic tại thời gian lưu mục tiêu. Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu blank thêm chuẩn và mẫu thử đều xuất hiện pic rõ nét tại thời gian lưu 13,08 phút. Điểm nhận dạng IP của phương pháp đạt 5 điểm (1 điểm từ sắc ký khí + 1 điểm từ ion mẹ + 3 điểm từ hai ion con), vượt mức tối thiểu yêu cầu IP ≥ 4 của EC 808/2021. Tỷ lệ cường độ ion con định tính/định lượng (m/z 91,1 chia cho m/z 147,1) đối với mẫu chuẩn là 36,71%, mẫu thêm chuẩn là 32,92%, độ sai lệch ghi nhận là -10,3%. Đối với chuẩn nội, tỷ lệ ion (m/z 93,1 chia cho m/z 150,1) ở mẫu chuẩn là 28,02%, mẫu thêm chuẩn là 29,89%, độ sai lệch là 6,7%. Cả hai giá trị sai lệch đều nằm trong giới hạn cho phép ± 40% của EC 808/2021.
• Giới hạn phát hiện và định lượng: Tại mức nồng độ nạp chuẩn 15 µg/kg, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) của mảnh định tính đạt 10,58 và mảnh định lượng đạt 60,19. Thử nghiệm hạ mức nồng độ xuống 5 µg/kg cho thấy mảnh định lượng vẫn thu nhận tín hiệu tốt nhưng mảnh định tính bị nhiễu nền nặng, không đảm bảo tính tin cậy nhận dạng. Do đó, nghiên cứu ấn định LOQ của phương pháp là 15 µg/kg và suy ra LOD = LOQ/3 = 5 µg/kg, đáp ứng đúng yêu cầu của AOAC SMPR® 2017.017 (LOQ ≤ 15 µg/kg).
• Khoảng tuyến tính: Xây dựng trên 6 điểm nồng độ từ 0,005 đến 1,00 µg/ml, thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic ngoại chuẩn/nội chuẩn (y) theo nồng độ chất phân tích (x): $y = 19,569x + 0,0202$ với hệ số tương quan $R = 1,00$ ($R^2 = 0,9999$). Độ chệch nồng độ tại điểm gần LOQ (C1 = 0,005 µg/ml) đạt 14,0% (quy định cho phép ≤ ± 20%); độ chệch tại các điểm còn lại dao động từ -8,1% đến 8,3% (quy định cho phép ≤ ± 15%).
• Độ chính xác: Đánh giá trên 7 mẫu độc lập ở mỗi mức nồng độ thêm chuẩn 25, 50 và 75 µg/kg (tương ứng 0,5; 1,0 và 1,5 lần ngưỡng giới hạn tối đa cho phép 50 µg/kg của EFSA). Độ thu hồi trung bình lần lượt đạt 91,4% (dải 80,0 - 95,8%); 98,1% (dải 92,2 - 102,7%) và 86,6% (dải 83,8 - 90,6%), đáp ứng yêu cầu 70 - 125%. Độ lặp lại biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD lần lượt đạt 5,8%; 3,3% và 2,4%, đáp ứng yêu cầu RSD ≤ 22% của AOAC SMPR® 2017.017.

Ứng dụng phân tích mẫu thực tế trên 8 mẫu sữa bột dinh dưỡng công thức thu thập tại Hà Nội ghi nhận 100% mẫu khảo sát (8/8 mẫu) đều phát hiện có chứa GE với nồng độ nằm trong dải từ 17,84 đến 35,81 µg/kg. Tất cả các giá trị đo được đều thấp hơn ngưỡng giới hạn tối đa 50 µg/kg của EFSA. Số liệu sơ bộ cũng chỉ ra xu hướng các mẫu sữa bột công thức nhập khẩu có hàm lượng GE thấp hơn so với các mẫu sản xuất nội địa.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình phân tích và thẩm định đầy đủ tính năng kỹ thuật của phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột. Các kết quả thực nghiệm chính so sánh với các tiêu chuẩn quốc tế được tổng hợp trong bảng sau:

Thông số thẩm định	Quy định tham chiếu	Kết quả thực nghiệm của đề tài	Đánh giá tính năng
Độ phù hợp hệ thống (RSD RT và S pic)	RSD ≤ 2,0%	RSD RT = 0,14%; RSD S pic = 1,95%	Đạt yêu cầu
Điểm nhận dạng đặc hiệu (IP)	IP ≥ 4 (theo EC 808/2021)	IP = 5 điểm	Đạt yêu cầu
Độ sai lệch tỷ lệ ion con	Trong giới hạn ± 40% (EC 808/2021)	-10,3% (3-MBPD); +6,7% (chuẩn nội)	Đạt yêu cầu
Giới hạn định lượng (LOQ)	LOQ ≤ 15 µg/kg (AOAC SMPR® 2017.017)	LOQ = 15 µg/kg (LOD = 5 µg/kg)	Đạt yêu cầu
Khoảng tuyến tính và độ chệch	R ≥ 0,995; Độ chệch ≤ ± 15% (± 20% tại LOQ)	0,005 - 1,00 µg/ml; R = 1,00; Độ chệch: -8,1% đến +14,0%	Đạt yêu cầu
Độ thu hồi (mức 25, 50, 75 µg/kg)	70% - 125% (AOAC SMPR® 2017.017)	80,0% - 102,7% (Trung bình: 91,4%; 98,1%; 86,6%)	Đạt yêu cầu
Độ lặp lại RSD (mức 25, 50, 75 µg/kg)	RSD ≤ 22% (AOAC SMPR® 2017.017)	RSD lần lượt là 5,8%; 3,3%; 2,4%	Đạt yêu cầu

Về mặt đóng góp học thuật và thực tiễn, tác giả đã thiết lập được phương pháp phân tích sắc ký khí khối phổ hai lần ba tứ cực (GC-MS/MS) hoàn chỉnh đầu tiên tại cơ sở nghiên cứu trong nước để định lượng vết tạp chất độc hại GE trên nền mẫu phức tạp là sữa bột dinh dưỡng công thức. Phương pháp giải quyết được khó khăn trong việc chuẩn bị mẫu blank đại diện, đồng thời lựa chọn giải pháp định lượng gián tiếp thông qua chuyển hóa brom hóa và dẫn xuất hóa PBA, giúp vượt qua rào cản khan hiếm chất chuẩn thương mại của phương pháp định lượng trực tiếp bằng LC-MS/MS. Dữ liệu khảo sát thực tế trên 8 sản phẩm sữa bột trên thị trường Hà Nội cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm sơ bộ, hỗ trợ các nhà quản lý y tế và an toàn thực phẩm tại Việt Nam trong việc xem xét ban hành các giới hạn pháp lý về GE trong tương lai.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự chỉ ra một số hạn chế kỹ thuật trong quá trình triển khai:

• Thao tác xử lý mẫu còn kéo dài do bước thủy phân bằng acid sulfuric trong methanol đòi hỏi thời gian ủ từ 16 đến 20 giờ ở 40°C, đi kèm nhiều công đoạn chiết lỏng - lỏng liên tiếp để loại trừ chất béo và làm sạch dung dịch phân tích.
• Việc thay đổi thể tích hòa tan cắn dầu từ 2 ml lên 4 ml THF (để khắc phục diện tích bề mặt lớn của bình cô quay 100 ml) rồi trích 2 ml dung dịch đi làm phản ứng tuy đảm bảo độ đúng nhờ kỹ thuật chuẩn nội, nhưng làm phân tán lượng mẫu phân tích, khiến độ nhạy của phương pháp chưa thể tối ưu sâu hơn mức khuyến cáo của AOAC (giá trị LOQ dừng lại ở mức 15 µg/kg dù S/N của mảnh định lượng tại mức này đạt 60,19).
• Quy mô khảo sát thực tế còn hạn chế khi mới chỉ thực hiện trên 8 mẫu sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột tại địa bàn Hà Nội, chưa khảo sát trên các sản phẩm công thức dạng lỏng và chưa đại diện cho thị trường toàn quốc.

Các hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất bao gồm:

• Tối ưu hóa kỹ thuật xử lý cắn dầu sau cô quay chân không nhằm nâng cao độ nhạy của phương pháp: có thể chuyển dịch chiết sang các bình cô quay thể tích nhỏ trước khi làm bay hơi hoàn toàn dung môi, hoặc sử dụng dòng khí N2 để thổi bốc hơi dịch hòa tan trong THF từ 4 ml xuống 2 ml trước khi tiến hành các phản ứng tiếp theo.
• Mở rộng quy mô khảo sát hàm lượng GE với cỡ mẫu lớn hơn trên các sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột và dạng lỏng trên toàn quốc để phục vụ đánh giá nguy cơ phơi nhiễm toàn diện.
• Tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy trình phân tích định lượng GE bằng GC-MS/MS trên các nền mẫu thực phẩm chế biến chứa chất béo khác.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các đối tượng và mục đích chuyên môn sau:

• Sinh viên, học viên sau đại học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất học, Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm và Công nghệ sau thu hoạch.
• Kiểm nghiệm viên tại các phòng thử nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025 thuộc Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Viện Dinh dưỡng, các Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm - Thực phẩm trên toàn quốc.
• Tài liệu cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về các phản ứng hóa học đặc thù trên phân tử lipid (phản ứng mở vòng epoxid bằng NaBr trong môi trường acid, phản ứng thủy phân ester có xúc tác acid và phản ứng dẫn xuất hóa nhóm diol bằng acid phenylboronic PBA).
• Các chương trình nghiên cứu phân tích vết có thể tham khảo phương pháp xây dựng tiêu chí thẩm định chất lượng phép thử khối phổ hai lần theo đồng thời hai hệ thống tiêu chuẩn quốc tế khắt khe là EC 808/2021 (tính điểm nhận dạng IP, độ lệch tỷ lệ ion) và AOAC SMPR® 2017.017.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu phải thực hiện phản ứng tiền xử lý với NaBr trong môi trường acid trước khi thủy phân ester? Glycidyl ester chứa vòng epoxid kém bền, rất dễ bị biến đổi hoặc mở vòng không kiểm soát trong quá trình xử lý mẫu phức tạp. Phản ứng tiền xử lý với NaBr trong H2SO4 giúp cố định cấu trúc bằng cách mở vòng epoxid chuyển GE ngay thành dẫn chất 3-MBPDE bền vững. Ngoài ra, việc chuyển thành 3-MBPDE trước khi thủy phân giúp hạn chế sự cản trở không gian của chuỗi acid béo, từ đó tăng hiệu suất phản ứng và ngăn ngừa sự chuyển vị tạo thành đồng phân 2-MBPDE.

Các cặp ion phân mảnh và năng lượng va chạm tối ưu được lựa chọn cho 3-MBPD và chuẩn nội trên hệ thống GC-MS/MS là gì? Đối với dẫn xuất PBA-3-MBPD của chất phân tích, ion mẹ được chọn là m/z 240,0; ion con định lượng là m/z 147,1 với năng lượng va chạm CE = 5 eV; ion con định tính là m/z 91,1 với năng lượng va chạm CE = 25 eV. Đối với dẫn xuất PBA-3-MBPD-d5 của chất chuẩn nội, ion mẹ được chọn là m/z 245,0; ion con định lượng là m/z 150,1 với CE = 5 eV; ion con định tính là m/z 93,1 với CE = 25 eV.

Mẫu trắng (blank) được sử dụng trong nghiên cứu là loại mẫu nào và dựa trên cơ sở khoa học nào để lựa chọn? Mẫu trắng được lựa chọn là sữa bột nguyên kem Cô gái Hà Lan. Cơ sở lựa chọn là do sữa bột nguyên kem được sản xuất bằng công nghệ cô đặc và sấy đông khô từ sữa bò tươi thanh trùng, về mặt lý thuyết thành phần không bổ sung dầu thực vật tinh chế nên không chứa GE. Thử nghiệm thực tế trên sắc ký đồ khẳng định mẫu không xuất hiện pic tạp tại thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng tiêu chuẩn mẫu blank.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp là bao nhiêu và có đáp ứng yêu cầu kỹ thuật của AOAC không? Phương pháp đạt giới hạn phát hiện LOD = 5 µg/kg và giới hạn định lượng LOQ = 15 µg/kg. Mức LOQ này đáp ứng yêu cầu của tiêu chuẩn kỹ thuật AOAC SMPR® 2017.017 (quy định ngưỡng LOQ đối với GE trong sản phẩm dinh dưỡng công thức phải ≤ 15 µg/kg).

Kết quả khảo sát trên 8 mẫu sữa bột thực tế tại Hà Nội cho thấy mức độ an toàn như thế nào so với quy chuẩn châu Âu? Tất cả 8/8 mẫu sữa bột dinh dưỡng công thức khảo sát đều phát hiện có chứa GE với hàm lượng từ 17,84 đến 35,81 µg/kg. Toàn bộ các mẫu này đều có hàm lượng thấp hơn ngưỡng giới hạn tối đa cho phép của Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) là 50 µg/kg đối với sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột. Đồng thời, số liệu cho thấy các mẫu sữa nhập khẩu có xu hướng ghi nhận hàm lượng GE thấp hơn các mẫu nội địa.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của Lê Thu Phương đã xây dựng và thẩm định thành công phương pháp định lượng gián tiếp glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột bằng kỹ thuật GC-MS/MS ba tứ cực. Phương pháp đạt độ đặc hiệu cao (IP = 5), giới hạn định lượng LOQ = 15 µg/kg, độ thu hồi đạt từ 80,0% đến 102,7% và độ lặp lại RSD từ 2,4% đến 5,8%, hoàn toàn đáp ứng các tiêu chuẩn tính năng phương pháp của AOAC SMPR® 2017.017 và EC 808/2021. Khảo sát thực nghiệm trên 8 mẫu sữa bột trên thị trường Hà Nội ghi nhận 100% mẫu có sự hiện diện của GE với hàm lượng từ 17,84 đến 35,81 µg/kg, nằm trong ngưỡng an toàn 50 µg/kg theo quy định của châu Âu. Kết quả nghiên cứu đóng góp một quy trình kiểm nghiệm có độ tin cậy cao, tạo tiền đề khoa học cho công tác kiểm soát an toàn thực phẩm và đề xuất quy chuẩn quản lý GE tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Glycidyl ester (GE) là các chất sinh ra trong quá trình tinh chế dầu ăn, được xác định lần đầu tiên trong dầu cọ [35]. Sau đó, GE cũng được phát hiện với lượng đáng kể trong nhiều loại dầu thực vật tinh chế khác [23, 26, 35] và các thực phẩm có chứa dầu [21, 33, 34]. Độc tính của GE chưa được nghiên cứu đầy đủ, nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy phần lớn các GE sẽ chuyển hóa thành glycidol trong quá trình tiêu hóa [4, 7]. Chất chuyển hóa glycidol này được cho là một chất gây ung thư do tác động trên gen [12, 32] và đã được Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A (nhóm chất có khả năng gây ung thư cho người) [20].

Điều này đã dấy lên những lo ngại về nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe con người [41]. Vì vậy, tháng 2 năm 2018, Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã ban hành quy định ngưỡng tối đa đối với GE (tính theo glycidol) [14]. Hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam chưa có quy định chính thức nào về hàm lượng GE trong thực phẩm. Chính vì vậy, việc phát triển phương pháp định lượng để khảo sát hàm lượng GE trong các sản phẩm trên thị trường là rất cần thiết để cung cấp dữ liệu đánh giá nguy cơ, là cơ sở để cơ quan quản lý đề xuất ngưỡng an toàn của GE trong thực phẩm, đặc biệt là trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức.

Trong nhiều năm qua, có rất nhiều phương pháp định lượng GE đã được nghiên cứu và phát triển trên thế giới. Tuy nhiên, phần lớn các phương pháp hiện có chỉ xác định được GE trong dầu tinh chế, trong khi việc định lượng trên các nền mẫu phức tạp như thực phẩm (đặc biệt là các sản phẩm dinh dưỡng công thức) còn hạn chế. Cho đến nay, tại Việt Nam vẫn chưa có phương pháp phân tích tiêu chuẩn về xác định GE trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức. Vì vậy, khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng GC-MS/MS” được thực hiện với 2 mục tiêu sau: 1.

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng GC-MS/MS. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng glycidyl ester trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức trên thị trường. Giới thiệu về glycidyl ester 1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa ❖ Công thức cấu tạo Glycidyl ester (GE) là ester của glycidol và các acid béo.

R: gốc acid béo Hình 1. Công thức cấu tạo của glycidyl ester + Glycidol có công thức cấu tạo là C3H6O2 và khối lượng phân tử là 74,08. Tên IUPAC của glycidol là oxiranylmethanol. Glycidol có các đồng phân quang học là (R) - (+) - glycidol và (S) - (-) – glycidol.

Glycidol (R) - (+) – glycidol (S) - (-) – glycidol Hình 1. Công thức cấu tạo của glycidol + Các acid béo tham gia ester hóa phụ thuộc vào loại dầu nhưng chủ yếu là các acid béo phổ biến như acid lauric, acid myristic, acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic và acid linolenic. ❖ Tính chất vật lý Các GE có độ phân cực và độ tan tương tự với các acylglycerol tương ứng. GE tan trong dung môi không phân cực như diethyl ether, hexan/ aceton, ethyl acetat và tan kém trong nước.

Điểm nóng chảy của GE hơi thấp hơn so với các acylglycerol tương ứng. Chiều dài của chuỗi acyl càng tăng thì độ phân cực càng giảm và nhiệt độ nóng chảy của GE càng tăng [12, 18]. Glycidol là chất lỏng không màu, tan trong nước và hầu hết các dung môi phân cực [12].