Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng gc msms

Nghiên cứu phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng kỹ thuật GC-MS/MS, đảm bảo độ chính xác và tin cậy.

• Tác giả: Lê Thu Phương
• Người hướng dẫn: ThS. Ngô Minh Thúy
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Phương Pháp Định Lượng Glycidyl Ester Trong Sản Phẩm Dinh Dưỡng Bằng GC-MS/MS
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Giới thiệu về glycidyl ester
• 1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa
• 1.1.2. Nguồn gốc
• 1.2. Sự xuất hiện của glycidyl ester trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức
• 1.3. Độc tính
• 1.3.1. Độc động học
• 1.3.2. Độc tính bán trường diễn
• 1.3.3. Độc tính trường diễn - Nguy cơ gây ung thư của glycidol
• 1.3.4. Độc tính sinh sản
• 1.3.5. Phân loại về độc tính của glycidol
• 1.4. Quy định hiện hành
• 1.5. Phương pháp xác định glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức
• 1.5.1. Chiết xuất chất béo từ sản phẩm dinh dưỡng công thức
• 1.5.2. Phương pháp xác định glycidyl ester trong dầu
• 1.5.2.1. Định lượng gián tiếp
• 1.5.2.1.1. Thủy phân GE thành dạng glycidol tự do
• 1.5.2.1.1.1. Thủy phân GE bằng xúc tác acid
• 1.5.2.1.1.2. Thủy phân GE bằng xúc tác kiềm
• 1.5.2.2. Định lượng trực tiếp
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
• 2.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
• 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc
• 2.3.3. Chuẩn bị mẫu blank
• 2.4. Dung môi, hóa chất. Thiết bị, dụng cụ
• 2.5. Nội dung nghiên cứu
• 2.5.1. Xây dựng phương pháp phân tích
• 2.5.2. Thẩm định phương pháp phân tích
• 2.5.3. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế
• 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
• 3.2. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện GC-MS/MS
• 3.2.1. Điều kiện sắc kí khí
• 3.2.2. Điều kiện khối phổ
• 3.3. Thẩm định phương pháp
• 3.3.1. Độ phù hợp hệ thống
• 3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
• 3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế
• 3.4.1. Phương pháp xử lý mẫu
• 3.4.2. Phương pháp phân tích
• 3.4.3. Thẩm định phương pháp
• 3.4.4. Phân tích mẫu thực tế
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp Định Lượng Glycidyl Ester Bằng GC MS MS

Glycidyl ester (GE) là một nhóm hợp chất hữu cơ được hình thành trong quá trình tinh chế dầu thực vật. Việc định lượng GE trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức là rất quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm. Phương pháp GC-MS/MS đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác định hàm lượng GE. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện GE mà còn cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc và tính chất của chúng.

1.1. Glycidyl Ester Là Gì Và Tại Sao Quan Trọng

Glycidyl ester là các ester của glycidol và các acid béo. Chúng có mặt trong nhiều loại dầu thực vật và thực phẩm chế biến. Việc xác định hàm lượng GE là cần thiết để đánh giá nguy cơ sức khỏe, đặc biệt là trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức.

1.2. Lợi Ích Của Phương Pháp GC MS MS Trong Định Lượng GE

Phương pháp GC-MS/MS cho phép phân tích chính xác và nhạy cảm các hợp chất hữu cơ. Nó giúp phát hiện GE với độ chính xác cao, từ đó cung cấp dữ liệu cần thiết cho việc đánh giá an toàn thực phẩm.

II. Thách Thức Trong Việc Định Lượng Glycidyl Ester Trong Sản Phẩm Dinh Dưỡng

Việc định lượng GE trong sản phẩm dinh dưỡng công thức gặp nhiều thách thức do tính phức tạp của mẫu. Các thành phần khác nhau trong sản phẩm có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Hơn nữa, các phương pháp chiết xuất truyền thống có thể làm biến đổi GE, dẫn đến kết quả không chính xác.

2.1. Tính Phức Tạp Của Mẫu Sản Phẩm Dinh Dưỡng

Sản phẩm dinh dưỡng công thức thường chứa nhiều thành phần khác nhau, từ protein đến carbohydrate, điều này làm cho việc chiết xuất và phân tích GE trở nên khó khăn hơn.

2.2. Ảnh Hưởng Của Các Phương Pháp Chiết Xuất

Các phương pháp chiết xuất truyền thống có thể gây biến đổi GE, làm giảm độ chính xác của kết quả. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác trong phân tích.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Chất Béo Từ Sản Phẩm Dinh Dưỡng

Chiết xuất chất béo là bước đầu tiên trong quy trình định lượng GE. Có nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau, mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp sẽ ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng.

3.1. Phương Pháp Chiết Xuất Folch

Phương pháp Folch sử dụng hỗn hợp cloroform và methanol để chiết xuất chất béo. Mặc dù hiệu quả, phương pháp này có thể gây biến đổi GE do sự hiện diện của ion Cl-.

3.2. Phương Pháp Chiết Xuất Dubois

Phương pháp Dubois sử dụng ethyl acetat và nước khử khoáng, cho kết quả chiết xuất tốt nhất. Phương pháp này đơn giản và hiệu quả trong việc thu hồi chất béo từ sản phẩm dinh dưỡng.

IV. Phương Pháp Định Lượng Glycidyl Ester Trong Dầu

Có hai phương pháp chính để định lượng GE trong dầu: định lượng gián tiếp và định lượng trực tiếp. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng.

4.1. Định Lượng Gián Tiếp

Phương pháp định lượng gián tiếp bao gồm việc thủy phân GE thành glycidol tự do trước khi phân tích. Phương pháp này thường sử dụng GC-MS/MS để xác định hàm lượng glycidol.

4.2. Định Lượng Trực Tiếp

Định lượng trực tiếp cho phép xác định từng loại GE mà không cần qua bước thủy phân. Phương pháp này thường sử dụng LC-MS/MS, mang lại độ chính xác cao hơn trong việc phân tích.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp Định Lượng GE

Việc áp dụng phương pháp định lượng GE trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức giúp cung cấp dữ liệu quan trọng cho các cơ quan quản lý. Điều này không chỉ giúp đảm bảo an toàn thực phẩm mà còn hỗ trợ trong việc xây dựng các quy định về hàm lượng GE trong thực phẩm.

5.1. Đánh Giá Hàm Lượng GE Trong Sản Phẩm Thực Tế

Phương pháp định lượng GE đã được áp dụng để đánh giá hàm lượng GE trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức trên thị trường, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho người tiêu dùng.

5.2. Hỗ Trợ Xây Dựng Quy Định An Toàn Thực Phẩm

Dữ liệu từ việc định lượng GE sẽ giúp các cơ quan quản lý xây dựng các quy định an toàn thực phẩm, đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng.

VI. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Glycidyl Ester

Nghiên cứu về glycidyl ester và phương pháp định lượng của chúng đang ngày càng trở nên quan trọng. Việc phát triển các phương pháp phân tích chính xác sẽ giúp đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Tương lai của nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc cải thiện các phương pháp hiện có và phát triển các quy định an toàn thực phẩm mới.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Về GE

Nghiên cứu về GE không chỉ giúp hiểu rõ hơn về độc tính của chúng mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp phân tích hiệu quả hơn.

6.2. Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu

Tương lai của nghiên cứu về GE sẽ tập trung vào việc phát triển các phương pháp phân tích mới, cải thiện độ chính xác và độ nhạy của các phương pháp hiện có.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Sự hiện diện của các chất nhiễm bẩn chế biến sinh ra trong quá trình tinh chế dầu thực vật ở nhiệt độ cao (>200°C) như Glycidyl Ester (GE) và 3-MCPD (3-monochloropropane-1,2-diol) đang là tâm điểm chú ý của các tổ chức an toàn thực phẩm toàn cầu. Trong quá trình tiêu hóa, các GE nhanh chóng bị enzym lipase thủy phân giải phóng glycidol tự do. Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) đã phân loại glycidol vào Nhóm 2A (chất có khả năng gây ung thư cho người) do độc tính gây biến đổi gen, tổn hại DNA và độc tính sinh sản đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm bởi Chương trình Độc chất Quốc gia Hoa Kỳ (NTP).

Sản phẩm dinh dưỡng công thức (sữa bột công thức) dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ thường được bổ sung các loại dầu thực vật tinh chế (đặc biệt là dầu cọ, dầu dừa, dầu đậu nành) để cung cấp acid béo thiết yếu và hòa tan các vitamin tan trong dầu (A, D, E, K). Do đó, trẻ em trở thành đối tượng phơi nhiễm GE nhạy cảm và dễ tổn thương nhất. Tháng 2 năm 2018, Ủy ban An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) thông qua Quy định Commission Regulation (EU) 2018/290, áp đặt ngưỡng tối đa (Maximum Level - ML) đối với GE (tính theo glycidol) trong sữa bột công thức là 50 µg/kg và dạng lỏng là 6,0 µg/kg. Tuy nhiên, tại Việt Nam, Bộ Y tế chưa ban hành quy chuẩn kỹ thuật chính thức và thiếu một quy trình kiểm nghiệm chuẩn hóa cho nền mẫu sữa bột phức tạp.

       Quá trình tiêu hóa
(Trong sữa bột công thức)      (IARC Nhóm 2A)       (Độc gen & Nguy cơ ung thư)

Đề tài khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ: "Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Glycidyl Ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng GC-MS/MS" được thực hiện tại Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất (Đại học Dược Hà Nội) phối hợp cùng Khoa Hóa thực phẩm (Viện Dinh dưỡng Quốc gia) nhằm giải quyết bài toán trên.

Mục tiêu dự án

1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu và tối ưu hóa thông số phân tích trên hệ thống sắc ký khí khối phổ 2 lần (GC-MS/MS) đối với GE trong nền mẫu sữa bột công thức.
2. Thẩm định đầy đủ phương pháp phân tích theo các tiêu chuẩn quốc tế nghiêm ngặt: AOAC SMPR® 2017.017, AOAC Appendix F (2016) và Hướng dẫn EC 808/2021 của Liên minh Châu Âu.
3. Ứng dụng phương pháp để sàng lọc thực tế hàm lượng GE trong 8 mẫu sữa bột dinh dưỡng công thức (4 mẫu nội địa, 4 mẫu nhập khẩu) đang lưu thông trên thị trường Hà Nội.

Phạm vi và Giới hạn

• Phạm vi đối tượng: Định lượng gián tiếp tổng hàm lượng GE (quy đổi về glycidol) trong sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột.
• Giới hạn kỹ thuật: Không phân tách riêng rẽ từng loại este của từng acid béo đơn lẻ (cần kỹ thuật LC-MS/MS trực tiếp có đầy đủ chất chuẩn đồng vị).

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Nền mẫu sữa bột công thức chứa ma trận phức tạp với hàm lượng cao protein, carbohydrate (lactose), khoáng chất và chất béo. Các phương pháp phân tích GE hiện nay đối mặt với nhiều thách thức kỹ thuật:

Phương pháp	Nguyên lý chính	Ưu điểm	Nhược điểm & Thách thức
AOCS Cd 29a-13 (Unilever)	Thủy phân xúc tác acid $H_2SO_4/MeOH$ sau khi brom hóa chuyển GE $\rightarrow$ 3-MBPD ester	Độ bền cao, không sinh phản ứng phụ tạo 3-MCPD	Thời gian thủy phân kéo dài (16–20 giờ)
AOCS Cd 29b-13 (SGS 3-in-1)	Thủy phân xúc tác kiềm $NaOH/MeOH$ ở nhiệt độ lạnh $-22^\circ\text{C}$	Phân tích đồng thời 2-MCPD, 3-MCPD và GE	Đòi hỏi duy trì nhiệt độ âm sâu, thao tác phức tạp, dễ sai số
AOCS Cd 29c-13 (DGF Fast)	Thủy phân kiềm Methoxide/MeOH ở nhiệt độ phòng (3.5–5.5 phút)	Tốc độ chuẩn bị mẫu nhanh (<10 phút)	Ion $Cl^-$ chuyển một phần GE thành este 3-MCPD gây sai số dương
LC-MS/MS trực tiếp	Đo trực tiếp từng phân tử GE nguyên vẹn không qua thủy phân	Không phá vỡ cấu trúc hóa học	Đắt đỏ, thiếu chất chuẩn thương mại (mới có 7 chuẩn), nền dầu gây ion suppression

Phân loại yêu cầu phân tích theo mô hình MoSCoW:

• Must-have: Giới hạn định lượng $\text{LOQ} \le 15\ \mu\text{g/kg}$ (đáp ứng AOAC SMPR 2017.017); Độ thu hồi $70 - 125%$; Độ lặp lại $\text{RSD} \le 22%$; Điểm nhận dạng $\text{IP} \ge 4$ (EC 808/2021).
• Should-have: Sử dụng chuẩn nội đồng vị biến tính ($d_5$) để bù trừ hao hụt trong quá trình chuẩn bị mẫu đa bước.
• Could-have: Tối ưu hóa dung tích hoàn nguyên pha tĩnh để tăng độ lặp lại khi cô quay lượng cắn dầu.
• Won't-have (giai đoạn này): Định lượng trực tiếp từng đồng phân quang học $(R)$- và $(S)$-glycidol.

Thiết kế hệ thống phân tích

Hệ thống phân tích tích hợp quy trình chuẩn bị mẫu hóa học chuyên biệt và hệ thiết bị phân tích GC-MS/MS cấu hình cao:

[Mẫu sữa bột 0.5g] + [Chuẩn nội Gly-P-d5]
[Dịch chiết dầu béo]
[3-MBPD Ester]
[3-MBPD tự do]
[Dẫn chất PBA-3-MBPD & PBA-3-MBPD-d5]

Cấu hình phần cứng và phần mềm (Technology Stack)

• Thiết bị sắc ký khí: Thermo Fisher Scientific Trace 1310 GC System.
• Detector khối phổ: Thermo TSQ 8000 Evo Triple Quadrupole Mass Spectrometer.
• Cột sắc ký: Agilent HP-5MS ($30\text{ m} \times 0.25\text{ mm} \times 0.25\ \mu\text{m}$, pha tĩnh 5% Phenyl Methylpolysiloxane phân cực yếu).
• Phần mềm điều khiển & xử lý: Thermo Xcalibur™ v4.0, Thermo TraceFinder™ v4.1, bảng tính Microsoft Excel.
• Chất chuẩn & Hóa chất:
  • Chuẩn ngoại: Glycidyl palmitate (Gly-P, độ tinh khiết 93.23%, HPC Standards GmbH, Đức).
  • Chuẩn nội: Glycidyl palmitate-$d_5$ (Gly-P-$d_5$, độ tinh khiết 96%, độ tinh khiết đồng phân >95%, TRC Canada).
  • Tác nhân dẫn xuất: Acid phenylboronic (PBA, AK Scientific).
  • Dung môi: Tetrahydrofuran (THF), Methanol, n-Heptane, Toluene, Ethyl Acetate, Diethyl Ether (Merck, độ tinh khiết phân tích).

Methodology

Nghiên cứu áp dụng quy trình kiểm nghiệm theo phương pháp luận thực nghiệm chuẩn tắc của ngành Dược và An toàn thực phẩm:

Quản lý rủi ro & Đảm bảo chất lượng (QA/QC):

• Rủi ro biến đổi epoxid: GE có vòng oxirane phản ứng mạnh với các nucleophile gây mở vòng tự phát. Khắc phục: Tiền xử lý ngay bằng phản ứng brom hóa với $\text{NaBr/H}^+$ để khóa vòng epoxid chuyển thành dạng 3-MBPDE bền vững trước khi thủy phân.
• Rủi ro mẫu blank bị nhiễm nền: Sữa bột trên thị trường đều chứa dầu thực vật tinh chế. Khắc phục: Khảo sát và lựa chọn mẫu sữa bột nguyên kem Cô gái Hà Lan (không bổ sung dầu tinh chế) làm nền blank chuẩn đạt chuẩn không có tín hiệu tạp.

---

Implementation và kết quả

Development process

Quy trình hóa học phân tích được thực hiện qua chuỗi phản ứng chuyển hóa dẫn xuất 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1 (Brom hóa khóa vòng):

Giai đoạn 2 (Thủy phân este giải phóng diol):

Giai đoạn 3 (Dẫn xuất hóa tạo vòng dioxaborolane bay hơi):

Thiết lập thông số vận hành thiết bị GC-MS/MS

; GC Method Settings
Column = "Agilent HP-5MS (30m x 0.25mm x 0.25µm)"
Carrier_Gas = "Helium (99.999% purity)"
Flow_Rate = 1.2 ; mL/min
Injection_Mode = "Splitless"
Injection_Volume = 0.5 ; µL
Oven_Program = "60°C (hold 1 min) -> 10°C/min to 200°C -> 25°C/min to 250°C -> 260°C post-run"

; MS/MS TSQ 8000 Evo Settings
Ionization = "Electron Impact (EI, 70 eV)"
Transfer_Line_Temp = 280 ; °C
Ion_Source_Temp = 280 ; °C
Solvent_Delay = 3.0 ; minutes
Scan_Type = "Selected Reaction Monitoring (SRM)"

Tối ưu hóa mảnh phổ khối lượng (Transitions & Collision Energy)

Khảo sát quét toàn dải từ 50–350 Da và tối ưu hóa thế bắn phá (Collision Energy - CE) trên chuẩn nồng độ 300 ppb:

Bảng thông số SRM/MRM tối ưu hóa:
Hợp chất           Thời gian lưu   Ion mẹ (m/z)   Ion con (m/z)   CE (eV)   Loại ion
PBA-3-MBPD         13.13 min       240.0          147.1            5        Định lượng
PBA-3-MBPD         13.13 min       240.0           91.1           25        Định tính
PBA-3-MBPD-d5 (IS) 13.08 min       245.0          150.1            5        Định lượng
PBA-3-MBPD-d5 (IS) 13.08 min       245.0           93.1           25        Định tính

Testing và validation

Phương pháp được thẩm định toàn diện dựa trên 5 chỉ tiêu cốt lõi theo hướng dẫn AOAC SMPR® 2017.017 và EC 808/2021:

1. Độ phù hợp hệ thống (System Suitability)

Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn $0.1\ \mu\text{g/mL}$:

• Thời gian lưu trung bình: $13.07\text{ phút}$, $\text{RSD} = 0.14%$ (Yêu cầu $\le 2.0%$).
• Diện tích pic trung bình: $903,765\text{ counts}$, $\text{RSD} = 1.95%$ (Yêu cầu $\le 2.0%$).

2. Độ đặc hiệu và Điểm nhận dạng (Specificity & Identification Points)

• Không có pic tạp trên mẫu Blank tại thời gian lưu $13.08\text{ phút}$. Mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn xuất hiện pic sắc nét.
• Điểm nhận dạng (IP): $$\text{IP} = 1\ (\text{GC}) + 1\ (\text{Ion mẹ}) + 2 \times 1.5\ (\text{Ion con}) = 5.0\text{ điểm}$$ (Vượt tiêu chuẩn Châu Âu EC 808/2021 quy định $\text{IP} \ge 4$).
• Tỷ lệ ion (Ion Ratio): Độ sai lệch giữa mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn đối với PBA-3-MBPD là $-10.3%$, với PBA-3-MBPD-$d_5$ là $+6.7%$ (nằm hoàn toàn trong ngưỡng cho phép $\pm 40%$).

3. Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)

• Tại mức nạp chuẩn $15\ \mu\text{g/kg}$ ($n=7$): Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu $S/N$ mảnh định lượng đạt $60.19$, mảnh định tính đạt $10.58 \ge 10$.
• Kết luận: $\text{LOQ} = 15\ \mu\text{g/kg}$ (thỏa mãn tiêu chuẩn AOAC SMPR: $\text{LOQ} \le 15\ \mu\text{g/kg}$).
• $\text{LOD} = \text{LOQ} / 3 = 5\ \mu\text{g/kg}$.

4. Khoảng tuyến tính và Đường chuẩn

Xây dựng dải nồng độ 6 điểm ($0.005 - 1.000\ \mu\text{g/mL}$ quy đổi theo glycidol tự do):

Chuẩn	$C_{\text{lý thuyết}}$ ($\mu\text{g/mL}$)	Tỷ lệ $S_{\text{ngoại}} / S_{\text{nội}}$	$C_{\text{thực tế}}$ ($\mu\text{g/mL}$)	Độ chệch ($%$)	Giới hạn AOAC
C1	0.005	0.1314	0.0057	+14.0%	$\pm 20%$
C2	0.010	0.2117	0.0098	-2.0%	$\pm 15%$
C3	0.030	0.6556	0.0325	+8.3%	$\pm 15%$
C4	0.100	1.8192	0.0919	-8.1%	$\pm 15%$
C5	0.300	6.0139	0.3063	+2.1%	$\pm 15%$
C6	1.000	19.5668	0.9989	-0.1%	$\pm 15%$

• Phương trình hồi quy tuyến tính: $$y = 19.569x + 0.0202 \quad (R^2 = 0.9999 \implies R = 1.00)$$

5. Độ đúng (Độ thu hồi) và Độ chụm (Độ lặp lại)

Thực nghiệm nạp chuẩn trên 7 mẫu độc lập ở 3 mức nồng độ ($0.5 \times\text{ML}$, $1.0 \times\text{ML}$, $1.5 \times\text{ML}$ tương ứng $25, 50, 75\ \mu\text{g/kg}$):

Mức nạp chuẩn	Độ thu hồi trung bình ($R%$)	Dải thu hồi thực tế	Độ lặp lại (RSD%)	Tiêu chuẩn AOAC 2017	Đánh giá
$25\ \mu\text{g/kg}$	$91.4%$	$80.0% - 95.8%$	$5.8%$	$R: 70-125%, \text{RSD} \le 22%$	Đạt
$50\ \mu\text{g/kg}$	$98.1%$	$92.2% - 102.7%$	$3.3%$	$R: 70-125%, \text{RSD} \le 22%$	Đạt
$75\ \mu\text{g/kg}$	$86.6%$	$83.8% - 90.6%$	$2.4%$	$R: 70-125%, \text{RSD} \le 22%$	Đạt

Kết quả đạt được

Phương pháp đã được ứng dụng để phân tích thực tế 8 mẫu sữa bột công thức (4 mẫu nội địa ký hiệu NĐ, 4 mẫu nhập khẩu ký hiệu NK) trên thị trường Hà Nội:

Hàm lượng Glycidyl Ester (µg/kg) trong 8 mẫu sữa thương mại:

• Tỷ lệ phát hiện: $100%$ ($8/8$ mẫu) phát hiện dương tính với GE, hàm lượng dao động từ $17.84$ đến $35.81\ \mu\text{g/kg}$.
• Đánh giá mức độ an toàn: Tất cả 8 mẫu đều nằm dưới ngưỡng tối đa cho phép theo tiêu chuẩn Châu Âu ($50\ \mu\text{g/kg}$).
• Xu hướng xuất xứ: Mẫu sữa bột nhập khẩu ($17.84 - 21.30\ \mu\text{g/kg}$) có xu hướng chứa hàm lượng GE thấp hơn và đồng đều hơn so với mẫu sữa sản xuất nội địa ($19.74 - 35.81\ \mu\text{g/kg}$).

---

Đổi mới và đóng góp

1. Cải tiến kỹ thuật hòa tan cắn mẫu: Trong quy trình gốc của Dubois (2019), cắn dầu sau khi cô quay chân không trong bình quả nhót 100 mL được hòa tan bằng 2 mL THF dẫn đến hiện tượng hòa tan không hoàn toàn. Nghiên cứu đã tối ưu hóa bằng việc tăng thể tích THF lên 4 mL, sau đó trích chính xác 2 mL để thực hiện phản ứng tiếp theo. Kết hợp chuẩn hóa bằng chất chuẩn nội đồng vị Gly-P-$d_5$, quy trình vừa đảm bảo thu hồi triệt để chất béo vừa duy trì độ lặp lại xuất sắc ($\text{RSD} < 6%$).
2. Loại trừ sai số biến đổi chéo (Cross-conversion): Ứng dụng phản ứng brom hóa chọn lọc bằng $\text{NaBr/H}^+$ trước bước thủy phân giúp triệt tiêu nguy cơ vòng epoxid bị mở tự phát hoặc chuyển hóa nghịch thành 3-MCPD trong môi trường kiềm như các phương pháp DGF truyền thống.
3. Hiệu suất ion hóa vượt trội: Dẫn xuất hóa với PBA trong pha dung môi hữu cơ Diethyl Ether làm giảm đáng kể lượng thuốc thử dư thừa đưa vào buồng MS so với hệ dung môi nước/axeton, giúp bảo vệ nguồn ion hóa EI và kéo dài tuổi thọ cụm tứ cực Quadrupole.
4. Đóng góp tiêu chuẩn hóa quốc gia: Cung cấp quy trình kiểm nghiệm có độ tin cậy cao, là bằng chứng khoa học thực nghiệm giúp Bộ Y tế và Viện Dinh dưỡng Quốc gia thiết lập cơ sở dữ liệu giám sát và xây dựng Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN) đối với nhóm độc tố chế biến trong thực phẩm trẻ em.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng thực tế

• Phòng kiểm nghiệm quốc gia & Độc lập: Triển khai quy trình kiểm nghiệm thường quy phục vụ cấp chứng nhận an toàn thực phẩm, công bố tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm nhập khẩu và lưu thông nội địa.
• Nhà máy sản xuất sữa bột & Dầu dinh dưỡng: Tích hợp vào hệ thống kiểm soát chất lượng QA/QC đầu vào đối với nguyên liệu dầu thực vật tinh chế và thành phẩm sữa bột.

Phân tích chi phí - lợi ích (Cost-Benefit Analysis)

• Tối ưu chi phí chất chuẩn: Phương pháp gián tiếp sử dụng duy nhất 1 chất chuẩn đại diện (Glycidyl palmitate và Gly-P-$d_5$) để định lượng tổng GE, tiết kiệm hơn $80%$ chi phí mua sắm chất chuẩn so với phương pháp LC-MS/MS trực tiếp (phải mua riêng 7–10 loại chuẩn este của từng acid béo).
• Chi phí vận hành: Ước tính chi phí hóa chất, dung môi và tiêu hao cho 1 mẫu kiểm nghiệm là khoảng 250,000 – 350,000 VNĐ, hoàn toàn khả thi cho các labo phân tích tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế thể tích hoàn nguyên: Việc nâng lượng THF lên 4 mL làm giảm một nửa nồng độ chất phân tích đưa vào cột, khiến giá trị $\text{LOQ}$ dừng lại ở mức $15\ \mu\text{g/kg}$. Mặc dù đạt chuẩn AOAC cho sữa bột dạng bột, mức LOQ này chưa đủ nhạy để phân tích sữa dinh dưỡng dạng lỏng (ngưỡng EU là $6.0\ \mu\text{g/kg}$).
• Thời gian thủy phân: Bước thủy phân acid cần 16–20 giờ (qua đêm). Cần nghiên cứu ứng dụng vi sóng hoặc năng lượng siêu âm tần số cao để rút ngắn thời gian thủy phân xuống dưới 2 giờ.
• Mở rộng ma trận thực phẩm: Định hướng ứng dụng quy trình phân tích trên các nền mẫu giàu béo khác như bánh quy, thực phẩm ăn dặm, khoai tây chiên và dầu chiên rán công nghiệp.

---

Đối tượng hưởng lợi

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao phải chuyển Glycidyl Ester thành 3-MBPD trước khi phân tích trên GC-MS/MS?

Glycidyl Ester chứa vòng epoxid kém bền nhiệt, dễ bị phân hủy không kiểm soát trong buồng tiêm GC ở nhiệt độ cao ($>250^\circ\text{C}$). Hơn nữa, GE là hợp chất phân cực và có khối lượng phân tử lớn khó bay hơi. Việc brom hóa bằng $\text{NaBr/H}^+$ giúp mở vòng tạo este 3-MBPD bền vững, sau đó thủy phân giải phóng 3-MBPD tự do và dẫn xuất hóa với acid phenylboronic (PBA) tạo hợp chất bay hơi tốt, dễ dàng phân tách và ion hóa trên GC-MS.

2. Sự khác nhau giữa việc sử dụng dẫn xuất PBA và HFBI là gì?

Heptafluorobutyrylimidazole (HFBI) cực kỳ nhạy cảm với độ ẩm không khí và đòi hỏi điều kiện phản ứng khan tuyệt đối. Ngược lại, Acid phenylboronic (PBA) bền vững hơn nhiều, phản ứng nhanh ở nhiệt độ phòng với nhóm diol liền kề của 3-MBPD, tạo vòng dioxaborolane 5 cạnh có tính chất bay hơi và độ bền phân mảnh ion rất cao trong nguồn ion hóa EI.

3. Nguồn gốc của Glycidyl Ester trong sữa bột công thức đến từ đâu?

GE không có sẵn trong sữa bò tươi tự nhiên. Nguồn sinh ra GE duy nhất là do các nhà sản xuất bổ sung dầu thực vật tinh chế (như dầu cọ, dầu đậu nành) vào công thức sữa. Trong quá trình khử mùi dầu ở nhiệt độ trên $200^\circ\text{C}$, các diacylglycerol (DAG) và monoacylglycerol (MAG) bị khử nước tạo thành GE.

4. Tại sao sữa bột nguyên kem Cô gái Hà Lan được chọn làm mẫu Blank?

Sữa bột nguyên kem được chế biến bằng cách cô đặc và sấy phun trực tiếp từ sữa bò tươi thanh trùng, không bổ sung dầu thực vật tinh chế trong công thức. Do đó, về mặt lý thuyết và thực nghiệm kiểm chứng trên GC-MS/MS, mẫu này hoàn toàn không phát hiện tín hiệu GE, tạo nền mẫu tương đồng lý tưởng để đánh giá độ đặc hiệu và nạp chuẩn thẩm định.

5. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để triển khai phương pháp này tại labo là gì?

Labo cần trang bị hệ thống GC-MS/MS (khối phổ 3 tứ cực) với nguồn ion hóa EI, cột sắc ký mao quản 5% phenyl methylpolysiloxane (như HP-5MS), máy cô quay chân không, máy ly tâm tốc độ cao ($>4500\text{ rpm}$) và các hóa chất phân tích độ tinh khiết cao kèm chất chuẩn đồng vị biến tính Gly-P-$d_5$.

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc việc xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Glycidyl Ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng kỹ thuật GC-MS/MS:

• Tính chuẩn xác cao: Phương pháp đạt đầy đủ các tiêu chí khắt khe theo quy định quốc tế AOAC SMPR® 2017.017 và EC 808/2021 với $\text{LOD} = 5\ \mu\text{g/kg}$, $\text{LOQ} = 15\ \mu\text{g/kg}$, độ thu hồi $80.0% - 102.7%$, $\text{RSD} < 6%$, hệ số tuyến tính $R = 1.00$.
• Giá trị thực tiễn: Khảo sát thực tế trên 8 sản phẩm sữa bột trên thị trường Hà Nội ghi nhận hàm lượng GE dao động từ $17.84$ đến $35.81\ \mu\text{g/kg}$, đều nằm trong ngưỡng an toàn theo tiêu chuẩn Châu Âu ($<50\ \mu\text{g/kg}$).
• Định hướng: Phương pháp sẵn sàng để chuyển giao công nghệ cho các cơ quan kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, đồng thời mở ra hướng nghiên cứu tối ưu hóa để phân tích trên các dạng nền mẫu thực phẩm phức tạp khác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Glycidyl ester (GE) là các chất sinh ra trong quá trình tinh chế dầu ăn, được xác định lần đầu tiên trong dầu cọ [35]. Sau đó, GE cũng được phát hiện với lượng đáng kể trong nhiều loại dầu thực vật tinh chế khác [23, 26, 35] và các thực phẩm có chứa dầu [21, 33, 34]. Độc tính của GE chưa được nghiên cứu đầy đủ, nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy phần lớn các GE sẽ chuyển hóa thành glycidol trong quá trình tiêu hóa [4, 7]. Chất chuyển hóa glycidol này được cho là một chất gây ung thư do tác động trên gen [12, 32] và đã được Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A (nhóm chất có khả năng gây ung thư cho người) [20].

Điều này đã dấy lên những lo ngại về nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe con người [41]. Vì vậy, tháng 2 năm 2018, Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã ban hành quy định ngưỡng tối đa đối với GE (tính theo glycidol) [14]. Hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam chưa có quy định chính thức nào về hàm lượng GE trong thực phẩm. Chính vì vậy, việc phát triển phương pháp định lượng để khảo sát hàm lượng GE trong các sản phẩm trên thị trường là rất cần thiết để cung cấp dữ liệu đánh giá nguy cơ, là cơ sở để cơ quan quản lý đề xuất ngưỡng an toàn của GE trong thực phẩm, đặc biệt là trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức.

Trong nhiều năm qua, có rất nhiều phương pháp định lượng GE đã được nghiên cứu và phát triển trên thế giới. Tuy nhiên, phần lớn các phương pháp hiện có chỉ xác định được GE trong dầu tinh chế, trong khi việc định lượng trên các nền mẫu phức tạp như thực phẩm (đặc biệt là các sản phẩm dinh dưỡng công thức) còn hạn chế. Cho đến nay, tại Việt Nam vẫn chưa có phương pháp phân tích tiêu chuẩn về xác định GE trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức. Vì vậy, khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng GC-MS/MS” được thực hiện với 2 mục tiêu sau: 1.

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng GC-MS/MS. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng glycidyl ester trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức trên thị trường. Giới thiệu về glycidyl ester 1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa ❖ Công thức cấu tạo Glycidyl ester (GE) là ester của glycidol và các acid béo.

R: gốc acid béo Hình 1. Công thức cấu tạo của glycidyl ester + Glycidol có công thức cấu tạo là C3H6O2 và khối lượng phân tử là 74,08. Tên IUPAC của glycidol là oxiranylmethanol. Glycidol có các đồng phân quang học là (R) - (+) - glycidol và (S) - (-) – glycidol.

Glycidol (R) - (+) – glycidol (S) - (-) – glycidol Hình 1. Công thức cấu tạo của glycidol + Các acid béo tham gia ester hóa phụ thuộc vào loại dầu nhưng chủ yếu là các acid béo phổ biến như acid lauric, acid myristic, acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic và acid linolenic. ❖ Tính chất vật lý Các GE có độ phân cực và độ tan tương tự với các acylglycerol tương ứng. GE tan trong dung môi không phân cực như diethyl ether, hexan/ aceton, ethyl acetat và tan kém trong nước.

Điểm nóng chảy của GE hơi thấp hơn so với các acylglycerol tương ứng. Chiều dài của chuỗi acyl càng tăng thì độ phân cực càng giảm và nhiệt độ nóng chảy của GE càng tăng [12, 18]. Glycidol là chất lỏng không màu, tan trong nước và hầu hết các dung môi phân cực [12]. ❖ Tính chất hóa học Nhóm epoxid của GE phản ứng rất mạnh với nhiều loại nucleophile (như H2O, alcol, thiol, amin, acid…) gây mở vòng [40].

Ngoài ra, trong môi trường kiềm, khi có mặt Cl-, một lượng GE sẽ chuyển thành 3-MCPD [22, 35]. Nguồn gốc Hình 1. Sự hình thành GE từ DAG và MAG Nguồn GE duy nhất được xác định trong thực phẩm là từ dầu tinh chế, chúng được hình thành trong quá trình đun nóng diacylglycerol (DAG) hoặc monoacylglycerol (MAG) để loại bỏ một acid béo hoặc nước ở nhiệt độ cao (> 200°C) [8, 9, 27]. Tốc độ và mức độ hình thành GE phụ thuộc vào sự có mặt của tiền chất acylglycerol, thời gian và nhiệt độ [8, 19, 35].

GE không được phát hiện trong dầu thô, nguyên chất (chưa tinh chế) [35, 41]. Sự xuất hiện của glycidyl ester trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức Để đảm bảo cung cấp đủ chất dinh dưỡng cần thiết như vitamin A, D, E, K… cho người dùng, các sản phẩm dinh dưỡng công thức thường được bổ sung dầu thực vật tinh chế trong thành phần, dẫn đến sự xuất hiện một lượng đáng kể GE trong các sản phẩm này [5, 25, 30, 36, 39]. Độc tính ❖ Độc động học GE sau khi thủy phân thành glycidol sẽ được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa [4, 7]. Sự chuyển hóa của glycidol diễn ra nhanh bằng một số con đường enzyme (như liên hợp glutathione, hình thành mercapturate).

Phần lớn glycidol được bài tiết qua nước tiểu, lượng nhỏ bài tiết qua phân và qua hơi thở dưới dạng CO2. Ngoài ra, nhờ cấu trúc vòng epoxid, glycidol có thể liên kết cộng hóa trị với các đại phân tử của tế bào (như DNA và hemoglobin), do đó có thể gây đột biến gen và gây ra độc tính. ❖ Độc tính bán trường diễn 3 Ở cả chuột đực và chuột cái được sử dụng glycidol với liều khoảng 150 - 300 mg/ kg thể trọng/ ngày trong 16 ngày, các tổn thương thần kinh trung ương và thoái hóa tế bào ống thận đã được quan sát thấy. Thậm chí, liều trên 400 mg/ kg thể trọng/ ngày có thể gây chết tế bào thần kinh.

Sự thoái hóa ống thận cũng được thấy ở liều 400 mg/ kg thể trọng mỗi ngày sau 13 tuần điều trị. Độc tính thần kinh được quan sát thấy sau 28 ngày điều trị trên chuột cống với liều 200 mg/ kg thể trọng mỗi ngày với những bất thường trong dáng đi cùng các tổn thương của hệ thần kinh trung ương và ngoại vi [7, 12]. ❖ Độc tính trường diễn - Nguy cơ gây ung thư của glycidol Sử dụng glycidol trong thời gian dài làm tăng tỷ lệ mắc ung thư trên một số mô của chuột cống và chuột nhắt, thông qua cơ chế gây độc gen. Các nghiên cứu về khả năng gây ung thư ở chuột nhắt (liều 25 và 50 mg/ kg thể trọng mỗi ngày) và chuột cống (liều 37,5 và 75 mg/ kg thể trọng mỗi ngày) trong 2 năm cho thấy sự xuất hiện các khối u trên nhiều cơ quan ở chuột cả hai giới như u trung mô tinh hoàn, u xơ tuyến vú, u thần kinh đệm… Một nghiên cứu ngắn hạn khác trên dòng chuột chuyển gen cũng đã tìm thấy “bằng chứng rõ ràng” ở giống đực và “một số bằng chứng” ở giống cái về khả năng gây ung thư của glycidol [7, 12].

Đánh giá về nguy cơ gây ung thư của GE trên người cũng đã được thực hiện bởi Ủy ban chuyên gia về Phụ gia thực phẩm của FAO và WHO (JECFA) và Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA). Cả hai cơ quan khoa học đều áp dụng phương pháp tiếp cận biên độ phơi nhiễm (MoE) bằng cách sử dụng kết quả từ Chương trình Độc chất Quốc gia (NTP) về khả năng gây ung thư và đều kết luận rằng glycidol có nguy cơ gây độc gen và ảnh hưởng với sức khỏe con người [12, 29, 38]. - Độc tính sinh sản Giảm khả năng sinh sản ở giống đực đã được ghi nhận trên chuột cống và chuột nhắt (mức thấp nhất gây độc quan sát được (LOAEL) là 25 mg/ kg thể trọng mỗi ngày ở chuột có thể dẫn đến giảm 36% số lượng tinh trùng ở mào tinh) [12]. ❖ Phân loại về độc tính của glycidol Glycidol được Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A, ''có thể gây ung thư cho người” [20].

Ủy ban MAK của Đức đã xếp glycidol vào loại 2 (các chất được coi là chất gây ung thư cho người). Trong khung luật hóa chất của Châu Âu, glycidol đã được đưa vào Phụ lục I Hướng dẫn 67/548/EEC - các chất có đặc tính gây ung thư, đột biến và ảnh hưởng trên sinh sản (CMR), và được phân loại là Carc. Trong đánh giá an toàn thực phẩm có chứa DAG (2015), Ủy ban An toàn thực phẩm Nhật Bản (FSCJ) đã kết luận glycidol là chất gây 4 ung thư gây độc gen. Do đó, mức độ phơi nhiễm GE nên được giữ ở mức thấp nhất có thể theo nguyên tắc ALARA (thấp nhất có thể đạt được).

Quy định hiện hành Do nguy cơ đối với sức khỏe của GE, tháng 2 năm 2018, Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã quy định ngưỡng tối đa đối với GE (tính theo glycidol) [14] như sau: Bảng 1. Quy định ngưỡng tối đa đối với GE (tính theo glycidol) của EFSA Giới hạn tối đa của GE STT Loại thực phẩm (tính theo glycidol) (µg/kg) Dầu thực vật ở dạng sản phẩm cuối, hoặc dùng 1 làm nguyên liệu thực phẩm (trừ các đối tượng ở 1 000 mục 2) Dầu và chất béo thực vật dùng để sản xuất thức 2 ăn trẻ em và sản phẩm dinh dưỡng công thức 500 cho trẻ sơ sinh, trẻ em Sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ nhỏ, sản phẩm công thức Dạng bột 50 3 và thực phẩm cho mục đích y tế đặc biệt dùng cho trẻ sơ sinh và Dạng lỏng 6,0 trẻ em Hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam chưa có quy định chính thức nào về hàm lượng GE trong thực phẩm. Chính vì vậy, việc phát triển phương pháp định lượng để khảo sát hàm lượng GE trong các loại sản phẩm trên thị trường là việc rất cần thiết để cung cấp dữ liệu đánh giá nguy cơ, là cơ sở để cơ quan quản lý đề xuất ngưỡng an toàn của GE trong sản phẩm dinh dưỡng công thức. Phương pháp xác định glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức GE trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức thường được xác định bằng cách chiết chất béo từ nền mẫu, sau đó tiến hành định lượng GE trong dầu.

Chiết xuất chất béo từ sản phẩm dinh dưỡng công thức Sữa công thức là một nền mẫu phức tạp vì có thành phần đa dạng và hàm lượng chất béo rất khác nhau. Bên cạnh đó, các phương pháp chiết xuất chất béo truyền thống cũng có thể gây biến đổi GE trong mẫu. Điều này khiến cho việc xác định GE trong sữa công thức rất khó khăn.