Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ trình bày phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, ứng dụng hiệu quả trong kiểm soát môi trường.

• Tác giả: Nguyễn Thị Lan Anh
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN
• 1.1.1. Lịch sử ra đời, nguồn gốc
• 1.1.2. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng
• 1.1.3. Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM
• 1.2.1. Công thức cấu tạo
• 1.2.2. Tính chất lí hóa
• 1.2.3. Dược lí
• 1.2.4. Chỉ định
• 1.2.5. Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim
• 1.2.5.1. Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang
• 1.2.5.2. Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC
• 1.3. SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• 1.3.1. Khái niệm
• 1.3.2. Nguyên tắc
• 1.3.3. Phân loại
• 1.3.4. Các thông số đặc trưng
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn
• 2.2.2. Thiết bị - dụng cụ
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Khảo sát phương pháp xử lí mẫu
• 2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc kí
• 2.3.3. Đánh giá phương pháp
• 2.3.4. Phương pháp xử lí số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
• 3.1.1. Khảo sát phương pháp xử lí mẫu
• 3.1.1.1. Lựa chọn loại dung môi xử lí mẫu
• 3.1.1.2. Lựa chọn tỉ lệ dung môi xử lí mẫu
• 3.1.2. Khảo sát quy trình phân tích
• 3.1.2.1. Khảo sát lựa chọn cột sắc kí
• 3.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng
• 3.1.2.3. Khảo sát thể tích tiêm mẫu
• 3.1.3. Quy trình phân tích
• 3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP
• 3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống
• 3.2.2. Khảo sát độ chính xác
• 3.2.2.1. Độ chính xác trung gian
• 3.2.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.2.2.2.1. Giới hạn phát hiện
• 3.2.2.2.2. Giới hạn định lượng
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Cefixim và nước thải

Cefixim là một kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ 3, được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, sự tồn dư của Cefixim trong nước thải từ các nhà máy sản xuất dược phẩm đang trở thành mối quan tâm lớn về môi trường. Việc định lượng Cefixim trong nước thải là cần thiết để đánh giá tác động của nó đến hệ sinh thái và sức khỏe con người. Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được đề xuất như một giải pháp hiệu quả và chính xác.

1.1. Tác động môi trường của Cefixim

Cefixim trong nước thải có thể gây ra hiện tượng kháng kháng sinh ở vi khuẩn, ảnh hưởng đến chất lượng nước và hệ sinh thái. Việc phân tích nước thải để xác định nồng độ Cefixim là bước quan trọng trong việc kiểm soát ô nhiễm môi trường. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, Cefixim có thể tồn tại trong nước thải ở nồng độ thấp nhưng vẫn đủ để gây ra các tác động tiêu cực.

1.2. Nhu cầu về phương pháp định lượng chính xác

Việc định lượng Cefixim trong nước thải đòi hỏi một phương pháp phân tích có độ chính xác cao và độ nhạy tốt. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phổ biến trong phân tích hóa học, đặc biệt là trong phân tích dược phẩm và kiểm tra nước thải. Phương pháp này cho phép xác định nồng độ Cefixim với độ chính xác cao, đáp ứng yêu cầu của các nghiên cứu môi trường.

II. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự phân tách các chất trong mẫu bằng cách sử dụng pha tĩnh và pha động. Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong phân tích hóa học và phân tích dược phẩm do độ chính xác và độ nhạy cao. Trong nghiên cứu này, HPLC được sử dụng để định lượng Cefixim trong nước thải, với mục tiêu xây dựng một quy trình phân tích hiệu quả và đáng tin cậy.

2.1. Nguyên lý hoạt động của HPLC

HPLC hoạt động dựa trên nguyên tắc phân tách các chất trong mẫu bằng cách sử dụng pha tĩnh và pha động. Các chất trong mẫu sẽ di chuyển qua cột sắc ký với tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào tương tác giữa chúng với pha tĩnh và pha động. Nhờ đó, các chất được tách riêng biệt và được phát hiện bởi detector. HPLC cho phép phân tích định lượng với độ chính xác cao, đặc biệt phù hợp với phân tích nước thải.

2.2. Ứng dụng của HPLC trong phân tích nước thải

HPLC được sử dụng rộng rãi trong phân tích nước thải do khả năng xác định các chất ở nồng độ thấp. Trong nghiên cứu này, HPLC được áp dụng để định lượng Cefixim trong nước thải từ các nhà máy sản xuất dược phẩm. Phương pháp này cho phép xác định nồng độ Cefixim với độ chính xác cao, đáp ứng yêu cầu của các nghiên cứu môi trường và dược phẩm.

III. Quy trình định lượng Cefixim trong nước thải

Quy trình định lượng Cefixim trong nước thải bằng HPLC bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, xử lý mẫu, và phân tích sắc ký. Mẫu nước thải được xử lý bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng để loại bỏ các tạp chất và cô đặc Cefixim. Sau đó, mẫu được đưa vào hệ thống HPLC để phân tích. Quy trình này được thẩm định để đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại.

3.1. Chuẩn bị và xử lý mẫu

Mẫu nước thải được thu thập và xử lý bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng để loại bỏ các tạp chất và cô đặc Cefixim. Dung môi chiết được lựa chọn dựa trên khả năng hòa tan Cefixim và loại bỏ các chất gây nhiễu. Quá trình xử lý mẫu đảm bảo rằng Cefixim được tách riêng và sẵn sàng cho phân tích bằng HPLC.

3.2. Phân tích sắc ký và đánh giá kết quả

Mẫu sau khi xử lý được đưa vào hệ thống HPLC để phân tích. Các thông số sắc ký như loại cột, thành phần pha động, và tốc độ dòng được tối ưu hóa để đảm bảo sự phân tách tốt nhất của Cefixim. Kết quả phân tích được đánh giá dựa trên độ chính xác, độ lặp lại, và giới hạn phát hiện của phương pháp.

IV. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu đã xây dựng thành công phương pháp định lượng Cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này cho phép xác định nồng độ Cefixim với độ chính xác cao và độ nhạy tốt, đáp ứng yêu cầu của các nghiên cứu môi trường. Việc áp dụng phương pháp này trong thực tế sẽ góp phần kiểm soát ô nhiễm môi trường do Cefixim gây ra.

4.1. Ý nghĩa thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm soát ô nhiễm môi trường do Cefixim gây ra. Phương pháp định lượng bằng HPLC có thể được áp dụng rộng rãi trong các nhà máy sản xuất dược phẩm để đánh giá và kiểm soát lượng Cefixim thải ra môi trường. Điều này góp phần bảo vệ chất lượng nước và hệ sinh thái.

4.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, nghiên cứu có thể mở rộng để định lượng các loại kháng sinh khác trong nước thải. Ngoài ra, việc kết hợp HPLC với các kỹ thuật phân tích khác như sắc ký khối phổ (LC-MS) có thể nâng cao độ chính xác và độ nhạy của phương pháp. Điều này sẽ mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân tích môi trường và dược phẩm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Kể từ khi Alexander Fleming phát hiện ra penicillin vào năm 1929, các thế hệ kháng sinh phổ rộng đã liên tục được phát triển và đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, tình trạng vi khuẩn kháng thuốc đang gia tăng nhanh chóng theo các cảnh báo từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Một trong những nguyên nhân chính thúc đẩy sự phát sinh và lan truyền của các chủng vi khuẩn đề kháng là sự tồn dư của kháng sinh trong môi trường nước thải, đặc biệt là nguồn thải từ các nhà máy sản xuất dược phẩm. Nước thải chứa dư lượng kháng sinh khi thải ra môi trường tự nhiên tạo áp lực chọn lọc, kích thích sự thích ứng và đề kháng của vi sinh vật ngay cả ở nồng độ dấu vết.

Tại Việt Nam, sự phát triển của công nghiệp dược phẩm kéo theo gia tăng lưu lượng kháng sinh xả thải. Trong khi các nghiên cứu kiểm soát dư lượng kháng sinh chủ yếu tập trung vào môi trường nước thải bệnh viện, nguồn nước thải từ các nhà máy sản xuất thuốc vẫn chưa được đánh giá đầy đủ. Cefixim là kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 dùng đường uống, phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram âm và Gram dương, bền vững với enzym beta-lactamase và được sản xuất với quy mô lớn.

Khóa luận thực hiện đề tài "Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao" nhằm giải quyết hai mục tiêu cụ thể:

1. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu và thiết lập điều kiện phân tích định lượng cefixim trong nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm.
2. Thẩm định phương pháp định lượng cefixim trong nền mẫu nước thải theo các tiêu chuẩn phân tích hiện hành.

Nghiên cứu được thực hiện trên nền mẫu nước thải lấy tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Mediplantex vào ngày không sản xuất cefixim (mẫu nước thải trắng), sau đó bổ sung chất chuẩn cefixim để khảo sát và thẩm định. Địa điểm thực hiện bao gồm Bộ môn Hóa phân tích (Trường Đại học Dược Hà Nội) và Phòng Dược lý (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) trong năm 2013.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thuộc loại hình nghiên cứu thực nghiệm trong lĩnh vực Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc, sử dụng các cơ sở lý thuyết và phương pháp sau:

Khung lý thuyết và tài liệu đối chiếu

• Đặc điểm hoạt chất: Cefixim trihydrat có công thức phân tử $C_{16}H_{15}N_5O_7S_2.3H_2O$ ($M = 507,5$), mang cấu trúc khung 3-cephem đặc trưng của nhóm cephalosporin, hệ số phân bố $log\ P_{octanol/nước} = -0,64$, tan trong methanol và propylen glycol, ít tan trong nước, dung dịch có pH acid yếu ($2,6 - 4,1$).
• Nguyên lý sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Sử dụng sắc ký phân bố pha đảo với detector chuỗi diod (DAD) để phân tách các thành phần dựa trên sự phân bố giữa pha động lỏng và pha tĩnh liên kết. Khảo sát các thông số đặc trưng gồm hệ số dung lượng ($k'$), hệ số đối xứng ($AF$), số đĩa lý thuyết ($N$), độ phân giải ($R_s$) và định tính quang phổ qua hệ số tương đồng phổ (Similarity Index - $SI$).
• Văn bản pháp lý và dược điển tham chiếu: Dược điển Mỹ 32 (USP 32), Dược điển Anh 2010 (BP 2010), Thông tư số 47/2011/TT-BTNMT của Bộ Tài nguyên và Môi trường quy định quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải công nghiệp.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp xử lý mẫu: Áp dụng kỹ thuật tủa protein bằng acetonitril (ACN) kết hợp chiết lỏng - lỏng để loại bỏ tạp chất tan trong dung môi hữu cơ, giữ cefixim lại trong pha nước dựa trên đặc tính phân cực của hoạt chất.
• Phương pháp phân tích công cụ: Sử dụng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với đầu dò DAD, khảo sát lựa chọn loại cột sắc ký, thành phần pha động, chương trình rửa giải (đẳng dòng và gradient), tốc độ dòng và thể tích tiêm mẫu.
• Phương pháp thẩm định quy trình: Thẩm định theo hướng dẫn phân tích với các chỉ tiêu: độ thích hợp của hệ thống ($n=6$), độ đặc hiệu (so phổ DAD và khả năng tách khỏi 6 kháng sinh cephalosporin khác), độ tuyến tính (xây dựng đường chuẩn 5 mức nồng độ, $n=3$), độ đúng (phương pháp thêm chuẩn tại 3 mức nồng độ 60, 500 và 800 ng/ml), độ chính xác (độ lặp lại $n=6$, độ chính xác trung gian khác ngày $n=6$, kiểm định chuẩn Fisher F-test), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
• Nguồn dữ liệu và xử lý thống kê: Dữ liệu sắc ký thu nhận từ phần mềm Multi-system manager, giao diện Interface D700; số liệu thống kê được tính toán bằng Microsoft Excel.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa lịch sử phát triển của nhóm cephalosporin từ chủng nấm Cephalosporium acremonium (Giuseppe Brotzu phân lập năm 1945), phân loại 4 thế hệ cephalosporin theo phổ tác dụng và đặc tính lý hóa của các chất sử dụng trong nghiên cứu:

Hoạt chất	Thế hệ	Công thức phân tử	Đặc tính hòa tan chính
Cephadroxil	I	$C_{16}H_{17}N_3O_5S.H_2O$	Khó tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%
Cefuroxim	II	$C_{20}H_{22}N_4O_{10}S$	Ít tan trong nước, tan trong aceton, ethyl acetat, methanol
Cefdinir	III	$C_{14}H_{13}N_5O_5S_2$	Tan trong đệm phosphat pH 7, ít tan trong nước, alcol
Ceftazidim	III	$C_{17}H_{19}N_6NaO_6S_2.5H_2O$	Tan trong kiềm và DMSO, ít tan trong nước, methanol
Cefotaxim natri	III	$C_{16}H_{16}N_5NaO_7S_2$	Dễ tan trong nước, hơi tan trong methanol
Cefoperazon natri	III	$C_{25}H_{26}N_9NaO_8S_2$	Dễ tan trong nước, tan trong methanol
Cefixim	III	$C_{16}H_{15}N_5O_7S_2.3H_2O$	Ít tan trong nước, tan trong methanol, propylen glycol

Tác giả tổng kết các công trình định lượng cefixim trên các nền mẫu khác nhau: đo quang trong thử nghiệm hòa tan viên nén ($\lambda = 288$ nm); sắc ký HPLC-UV trong nguyên liệu và chế phẩm; sắc ký HPLC-DAD/UV trong huyết tương sau khi tủa protein hoặc chiết pha rắn (SPE); phương pháp LC-MS/MS phân tích nước mặt và nước ngầm. Từ đó, tác giả chỉ ra khoảng trống nghiên cứu về phương pháp định lượng cefixim trong nước thải nhà máy dược phẩm tại Việt Nam bằng hệ thống HPLC-DAD kết hợp chiết lỏng - lỏng nhằm đảm bảo tính kinh tế và khả thi.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết về nguyên vật liệu, hóa chất và phương tiện thực nghiệm:

• Chất chuẩn: Cefixim chuẩn quốc gia (SKS: 0105192, hàm lượng 98,88%, độ ẩm 10,57% từ Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) và 6 chuẩn làm việc của cephadroxil, cefuroxim natri, cefdinir, ceftazidim, cefotaxim natri, cefoperazon natri.
• Hóa chất và dung môi: Acetonitril và methanol tinh khiết dùng cho HPLC (Merck); dicloromethan, cloroform, diethyl ether, natri dihydrophosphat, acid phosphoric loại PA (Merck).
• Thiết bị: Hệ thống HPLC Merck - Hitachi đầu dò DAD; máy lắc siêu âm LK 106; cân phân tích Mettler Toledo ($d = 0,01$ mg); máy ly tâm Hettich Zentrifugen.
• Quy trình khảo sát: Thiết kế các bước thực nghiệm để tối ưu hóa việc xử lý mẫu nước thải, lựa chọn cột và pha động, đồng thời chi tiết hóa tiêu chí chấp nhận khi đánh giá các thông số thẩm định theo quy định phân tích.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương này phản ánh toàn bộ dữ liệu thực nghiệm và bàn luận khoa học của đề tài:

1. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu:
   • Khảo sát dung môi: So sánh 3 dung môi với tỷ lệ mẫu thử : ACN : dung môi = 5:1:3. Kết quả hiệu suất chiết thu được: dicloromethan đạt 80,76% (nền mẫu sạch), cloroform đạt 49,45% (còn nhiều tạp), diethyl ether đạt 42,25%. Dicloromethan được chọn làm dung môi xử lý.
   • Khảo sát tỷ lệ dung môi: Thử nghiệm 3 tỷ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan (5:1:2, 5:1:3 và 5:1:4). Tỷ lệ 5:1:3 cho nền mẫu sạch và hiệu suất đạt 80,76%, được chọn làm quy trình chuẩn.
2. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký:
   • Cột sắc ký: Khảo sát 3 cột gồm Hypersil C18 BDS ($250 \times 4,6$ mm; 5 µm), Zorbax SB18 ($300 \times 4,6$ mm; 5 µm) và Luna C18 ($250 \times 4,6$ mm; 5 µm). Cột Luna C18 cho pic cefixim tách hoàn toàn khỏi 6 cephalosporin khác với dạng pic cân đối. Thứ tự rửa giải: cephadroxil $\rightarrow$ ceftazidim $\rightarrow$ cefdinir $\rightarrow$ cefixim $\rightarrow$ cefuroxim $\rightarrow$ cefotaxim $\rightarrow$ cefoperazon.
   • Chương trình pha động: Chương trình đẳng dòng (ACN : MeOH (50:50) : dung dịch TFA (19:81)) không tách được các chất; chương trình gradient giữa MeOH và đệm phosphat $40$ mM pH 3,2 tách tốt các pic.
   • Thể tích tiêm và bước sóng: Thể tích tiêm 200 µl cho diện tích pic tăng tuyến tính ($191.002\ \text{mAu.s}$) mà vẫn giữ được hình dạng pic sắc nét. Bước sóng cực đại $\lambda_{max} = 285$ nm được chọn cho detector DAD.
3. Kết quả thẩm định phương pháp:
   • Độ thích hợp hệ thống: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn cefixim $600$ ng/ml; thời gian lưu trung bình $t_R = 9,73$ phút ($RSD = 0,424%$), diện tích pic trung bình đạt $190.906,8\ \text{mAu.s}$ ($RSD = 1,11%$).
   • Độ đặc hiệu: Mẫu trắng không có pic tại thời gian lưu của cefixim. Phổ DAD của mẫu thử và mẫu chuẩn có hệ số tương đồng $SI = 0,9902$. Tách hoàn toàn cefixim khi có mặt đồng thời 6 kháng sinh cephalosporin khác.
   • Độ tuyến tính: Khoảng nồng độ từ $30,46$ đến $1218,20$ ng/ml; phương trình hồi quy $y = 316,70x - 1838$ với hệ số tương quan $r = 0,99995$.
   • Độ đúng: Thu hồi đạt $74,47%$ ($RSD = 6,48%$) ở mức $60$ ng/ml; $80,70%$ ($RSD = 3,58%$) ở mức $500$ ng/ml; $82,70%$ ($RSD = 3,19%$) ở mức $800$ ng/ml.
   • Độ chính xác: Độ lặp lại có $RSD = 4,88%$ ($C_{TB} = 39,78\ \mu\text{g}/100\text{ml}$); độ chính xác trung gian có $RSD = 7,65%$ ($C_{TB} = 39,25\ \mu\text{g}/100\text{ml}$). Kiểm định F cho thấy $F_{TN} = 2,42 < F_{LT(0,05; 5; 5)} = 5,05$.
   • Giới hạn phát hiện và định lượng: $LOD = 9,46$ ng/ml; $LOQ = 28,37$ ng/ml.
4. Bàn luận: Tác giả phân tích tính phù hợp của quy trình xử lý chiết lỏng - lỏng và hệ thống HPLC-DAD so với chiết pha rắn (SPE) và LC-MS/MS trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam. So sánh khả năng phát hiện của phương pháp với ngưỡng nồng độ cefixim trong nước thải có nguy cơ gây độc sinh thái do Jerker Fick công bố ($6,2\ \mu\text{g}/\text{ml}$), chứng minh phương pháp đáp ứng tốt yêu cầu giám sát môi trường.

Chương 4: Kết luận và đề xuất

Tóm lược các thông số kỹ thuật đã thiết lập của quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký; xác nhận toàn bộ chỉ tiêu thẩm định phương pháp (độ thích hợp, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, LOD, LOQ) đều đạt yêu cầu kỹ thuật phân tích.

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp điều kiện phân tích và thông số thẩm định

Hạng mục thông số	Giá trị thiết lập / Kết quả thực nghiệm
Cột sắc ký	Luna C18 ($250 \times 4,6$ mm; $5\ \mu\text{m}$), nhiệt độ cột $32^\circ\text{C}$
Pha động (Gradient)	Kênh A: Methanol; Kênh B: Đệm phosphat $40$ mM pH 3,2 ($NaH_2PO_4$, chỉnh bằng $H_3PO_4$) • 0 phút: 18% A, 82% B (tốc độ $1,0$ ml/phút) • 10 phút: 45% A, 55% B (tốc độ $1,0$ ml/phút) • 16 phút: 55% A, 45% B (tốc độ $0,85$ ml/phút) • 18 phút: 18% A, 82% B (tốc độ $0,85$ ml/phút)
Thể tích tiêm & Bước sóng	Thể tích tiêm $200\ \mu\text{l}$; Detector DAD tại bước sóng $\lambda = 285$ nm
Xử lý mẫu	$5$ ml mẫu nước thải acid hóa về pH 3 bằng HCl 1N + $1$ ml ACN, lắc xoáy 30s, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút; lấy dịch nổi + $3$ ml dicloromethan lắc 5 phút, tách lấy pha nước bên trên, lọc qua màng $0,45\ \mu\text{m}$
Độ lặp lại hệ thống	$RSD(t_R) = 0,424%$; $RSD(\text{diện tích pic}) = 1,11%$ ($n=6$)
Độ tuyến tính	Khoảng $30,46 - 1218,20$ ng/ml; $y = 316,70x - 1838$; $r = 0,99995$
Độ đúng (Thu hồi)	Mức 60 ng/ml: $74,47%$; Mức 500 ng/ml: $80,70%$; Mức 800 ng/ml: $82,70%$
Độ chính xác	Độ lặp lại: $RSD = 4,88%$; Độ chính xác trung gian: $RSD = 7,65%$; $F_{TN} = 2,42 < 5,05$
LOD và LOQ	$\text{LOD} = 9,46$ ng/ml; $\text{LOQ} = 28,37$ ng/ml

Đóng góp thực tiễn của đề tài

• Xây dựng thành công quy trình phân tích cefixim trong nền mẫu nước thải nhà máy sản xuất thuốc bằng phương pháp HPLC-DAD kết hợp chiết lỏng - lỏng, không phụ thuộc vào kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) hay thiết bị khối phổ (LC-MS/MS) đắt tiền.
• Quy trình có khả năng tách chọn lọc và định lượng chính xác cefixim khi có mặt đồng thời 6 kháng sinh nhóm cephalosporin thường dùng trong các dây chuyền sản xuất dược phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế được ghi nhận trong nghiên cứu:

  • Quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp kết tủa protein và chiết lỏng - lỏng có hiệu suất thu hồi thấp hơn kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) và chưa thực hiện được việc làm giàu mẫu trước khi phân tích.
  • Giới hạn định lượng ($LOQ = 28,37$ ng/ml) cao hơn so với phương pháp phân tích trên hệ thống LC-MS/MS, do đó bị hạn chế nếu cần phân tích dư lượng ở nồng độ siêu vết dưới $10$ ng/ml.
  • Nghiên cứu mới khảo sát trên mẫu nước thải nhân tạo (nước thải trắng của Công ty Mediplantex thêm chuẩn) kết hợp khảo sát 6 loại cephalosporin, chưa kiểm nghiệm trên các nền nước thải thực tế đa thành phần phức tạp khác.

• Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Khảo sát ứng dụng kỹ thuật làm giàu mẫu để hạ thấp giới hạn định lượng.
  • Mở rộng kiểm tra, đánh giá quy trình trên các mẫu nước thải thực tế tại nhiều nhà máy sản xuất kháng sinh khác nhau trước khi thải ra môi trường.

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên chuyên ngành Dược học, Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và Kỹ thuật môi trường; cán bộ kiểm nghiệm tại các trung tâm phân tích, viện kiểm nghiệm và bộ phận kiểm tra chất lượng (QC/QA), xử lý môi trường tại các nhà máy sản xuất dược phẩm.
• Phần nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Điều kiện sắc ký gradient tối ưu giúp phân tách đồng thời hỗn hợp đa kháng sinh nhóm cephalosporin trên cột Luna C18.
  • Quy trình xử lý mẫu nước thải bằng kỹ thuật tủa protein kết hợp chiết phân bố lỏng - lỏng đơn giản, tiết kiệm hóa chất.
  • Dữ liệu thẩm định phương pháp theo các tiêu chuẩn phân tích thực nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đề tài sử dụng dicloromethan để xử lý mẫu mà cefixim không bị chiết vào pha hữu cơ? Cefixim có hệ số phân bố $log\ P_{octanol/nước} = -0,64$, là hợp chất phân cực và rất khó tan trong dung môi hữu cơ không phân cực. Khi xử lý mẫu bằng dicloromethan, dung môi hữu cơ đóng vai trò hòa tan và loại bỏ các tạp chất kém phân cực trong nước thải, trong khi cefixim được giữ lại trong lớp nước phía trên với hiệu suất thu hồi đạt 80,76%.

2. Thứ tự rửa giải của cefixim và 6 kháng sinh cephalosporin khác trên cột Luna C18 diễn ra như thế nào? Khi chạy sắc ký pha động gradient trên cột Luna C18 ($250 \times 4,6$ mm; 5 µm), 7 kháng sinh được tách rời hoàn toàn theo thứ tự: cephadroxil $\rightarrow$ ceftazidim $\rightarrow$ cefdinir $\rightarrow$ cefixim $\rightarrow$ cefuroxim $\rightarrow$ cefotaxim $\rightarrow$ cefoperazon.

3. Khóa luận sử dụng thể tích tiêm mẫu bao nhiêu và tại sao chọn thể tích đó? Nghiên cứu khảo sát 3 mức thể tích tiêm mẫu là 20 µl, 50 µl và 200 µl. Mức tiêm 200 µl được lựa chọn vì giúp tăng diện tích pic đáp ứng đáng kể ($191.002\ \text{mAu.s}$) để phát hiện nồng độ thấp trong nước thải mà vẫn đảm bảo pic sắc nét, cân đối và tách hoàn toàn khỏi các cephalosporin khác.

4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp là bao nhiêu? Dựa trên độ lệch chuẩn đáp ứng của 6 mẫu thử nồng độ 20 ng/ml ($S = 907,721$) và hệ số góc đường chuẩn ($a = 316,70$), giới hạn phát hiện tính được là $LOD = 9,46$ ng/ml và giới hạn định lượng là $LOQ = 28,37$ ng/ml.

5. Kết quả kiểm tra độ chính xác trung gian giữa hai ngày phân tích khác nhau được đánh giá bằng tiêu chí nào? Độ chính xác được đánh giá qua độ lặp lại ($RSD = 4,88%$) và độ chính xác trung gian ngày khác ($RSD = 7,65%$). Khi so sánh phương sai giữa hai ngày bằng chuẩn kiểm định Fisher, giá trị thực nghiệm tính được là $F_{TN} = 2,42$, nhỏ hơn giá trị lý thuyết $F_{LT(0,05; 5; 5)} = 5,05$, chứng minh kết quả phân tích giữa các ngày không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Kết luận

Khóa luận đã xây dựng thành công quy trình định lượng kháng sinh cefixim trong nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm bằng phương pháp HPLC-DAD kết hợp chiết lỏng - lỏng bằng dicloromethan. Phương pháp đã được thẩm định đầy đủ về độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu đối với 6 cephalosporin khác, độ tuyến tính trong khoảng $30,46 - 1218,20$ ng/ml, độ đúng, độ chính xác cũng như xác định được giới hạn phát hiện $9,46$ ng/ml và giới hạn định lượng $28,37$ ng/ml. Kết quả nghiên cứu cung cấp một phương pháp phân tích khả thi, chi phí hợp lý, phù hợp với trang thiết bị tại các phòng kiểm nghiệm trong nước nhằm phục vụ công tác kiểm soát dư lượng kháng sinh thải vào môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc Năm 1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển tại Cagliari (Italia) đã phân lập được chủng nấm Cephalosporium acremonium. Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm này có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng và bệnh thương hàn ở người. Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham và Neuton (Anh) từ môi trường nuôi cấy này (nay được gọi là Acremonium chrysogenum) đã chiết được một hỗn hợp kháng sinh cephalosporin P1, cephalosporin C và penicillin N. Năm 1971, từ chủng Norcardia, Nagarazan chiết xuất được cephamycin cũng có cấu trúc gần với cephalosporin C.

Có nhiều cephalosporin tự nhiên được sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc khác nhau nhưng chúng hầu như không có ý nghĩa trong trị liệu. Vì vậy người ta đã tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên cơ sở cấu trúc vòng β-lactam. Ưu thế của các cephalosporin là có tác dụng kháng khuẩn đối với cả các vi khuẩn có hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) và độc tính thấp. Vì vậy chúng nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong trị liệu [8].2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng * Công thức chung của cephalosporin: R2 H R1 S H NH H O N O R3 HO O Hình 1.1: Công thức chung của cephalosporin Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic (A7AC), mang cấu trúc 3 -cephem, 3 mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –lactam để hợp chất có tác dụng sinh học.

Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7) đều có cấu hình R, và hầu như là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu truyền khá mạnh [7]. Tài liệu môi trường học 4 * Phân loại và phổ tác dụng Hiện nay, cephalosporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác dụng. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn, nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại. Phổ chung của các thế hệ cephalosporin được giới thiệu tại bảng 1.1 Phổ tác dụng của các cephalosporin Tên Tên đại Phổ tác dụng nhóm diện Thế hệ I Cephalexin - Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn Cephalothin Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu Cephazolin kháng methicillin).

… - Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (-) như E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis và Shigella. Thế hệ II Cephaclor - Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1. Tuy nhiên tác Cephuroxim dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng Cefotetan… trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn. Thế hệ III Cefixim - Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với β- Cefoperazon lactamase, tác dụng trên cả P.

- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1. Thế hệ IV Cefdinir - Phổ tác dụng tương tự nhưng mạnh hơn thế hệ 3. Cefepim… Thuốc tác dụng tốt với các vi khuẩn Enterobacteriaceae, Haemophilus, Pseudomonas, Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu. - Bền vững với β-lactamase.

Tài liệu môi trường học 5 1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi xin giới thiệu đặc tính của một số cephalosporin được sử dụng nghiên cứu trong đề tài tại bảng 1.2 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài Thế Tên chất hệ Công thức phân tử Tính chất vật lí 1.H2O - Bột màu trắng hoặc gần như trắng. monohydrat - Khó tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%.Cefuroxim II C20H22N4O10S - Bột trắng hoặc hơi vàng. - Ít tan trong nước, tan trong aceton, ethyl acetat và methanol, ít tan trong ethanol.Cefdinir III C14H13N5O5S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng.