Luận văn thạc sĩ: Phát hiện đột biến trên gen beta globin bằng ARMS-PCR và lai điểm ngược

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus phát hiện các đột biến trên gen beta globin bằng kỹ thuật arms pcr và lai điểm ngược reverse, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Lê Thị Thu Hà
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thƣơng Lan
• Trường học: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phát hiện các đột biến trên gen beta globin bằng kỹ thuật ARMS-PCR và lai điểm ngƣợc (reverse dot blot)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tình hình mắc bệnh trên thế giới và tại Việt Nam
• 1.2. Vị trí, cấu trúc gen β-globin mã hóa chuỗi β-globin
• 1.3. Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia
• 1.4. Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia
• 1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả sàng lọc đột biến trên gen β-globin bằng kỹ thuật PCR đa mồi
• 3.2. Sàng lọc đột biến trên gen β-globin bằng kỹ thuật ARMS-PCR
• 3.2.1. Sàng lọc đột biến Cd 17 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR
• 3.2.2. Sàng lọc đột biến Cd 26 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR
• 3.2.3. Sàng lọc đột biến Cd 41/42 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR
• 3.3. So sánh kết quả sàng lọc đột biến trên các mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật PCR đa mồi với kết quả chẩn đoán sinh hóa
• 3.3.1. Đặc điểm Hb các đột biến trong nghiên cứu
• 3.3.2. Giá trị HbE ở các mẫu có đột biến Cd 26
• 3.3.3. So sánh kết quả chẩn đoán sinh hóa với kết quả phân tích PCR đa mồi
• 3.4. Kết quả sàng lọc đột biến ở nhóm người bình thường
• 3.5. Biến nạp, tách dòng và giải trình tự đoạn gen β-globin
• 3.5.1. Biến nạp, tách dòng
• 3.5.2. Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 17
• 3.5.3. Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 26
• 3.5.4. Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 41/42
• 3.5.5. Giải trình tự đoạn gen β-globin không có đột biến
• 3.6. Lai điểm ngược (Reverse Dot Blot)
• 3.6.1. Đánh dấu trình tự đích cho quá trình lai điểm ngược
• 3.6.2. Tối ưu điều kiện lai điểm ngược
• 3.6.3. Kết quả lai một số mẫu bệnh phẩm
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát hiện đột biến gen beta globin

Bệnh beta thalassemia là một trong những bệnh di truyền phổ biến nhất tại Việt Nam, gây ra bởi các đột biến trên gen beta globin. Việc phát hiện sớm các đột biến này là rất quan trọng để có thể áp dụng các biện pháp điều trị kịp thời. Kỹ thuật ARMS-PCR và lai điểm ngược là hai phương pháp hiện đại giúp phát hiện các đột biến này một cách hiệu quả.

1.1. Tình hình mắc bệnh beta thalassemia tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh beta thalassemia rất cao, với khoảng 10 triệu người mang gen bệnh. Mỗi năm có khoảng 2000 trẻ em sinh ra mắc bệnh này. Việc hiểu rõ tình hình mắc bệnh sẽ giúp nâng cao nhận thức và triển khai các chương trình tầm soát hiệu quả.

1.2. Cấu trúc và chức năng của gen beta globin

Gen beta globin nằm trên nhiễm sắc thể 11, có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp chuỗi beta globin của hemoglobin. Các đột biến xảy ra tại gen này có thể dẫn đến các dạng bệnh khác nhau của beta thalassemia.

II. Thách thức trong việc phát hiện đột biến gen beta globin

Việc phát hiện các đột biến gen beta globin gặp nhiều thách thức, bao gồm sự đa dạng của các loại đột biến và sự phức tạp trong cấu trúc gen. Điều này đòi hỏi các phương pháp chẩn đoán phải chính xác và nhạy cảm.

2.1. Đa dạng các loại đột biến trên gen beta globin

Có khoảng 200 loại đột biến khác nhau trên gen beta globin, bao gồm đột biến điểm, mất đoạn và thay thế nucleotide. Sự đa dạng này làm cho việc phát hiện trở nên khó khăn hơn.

2.2. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như điện di gel thường không đủ nhạy để phát hiện tất cả các loại đột biến. Điều này dẫn đến việc cần thiết phải phát triển các kỹ thuật mới hơn.

III. Phương pháp ARMS PCR trong phát hiện đột biến gen beta globin

Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để phát hiện các đột biến gen beta globin. Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến khác nhau.

3.1. Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật ARMS PCR

ARMS-PCR dựa trên nguyên tắc sử dụng các mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn ADN chứa đột biến. Nếu có đột biến, phản ứng PCR sẽ diễn ra, ngược lại sẽ không có sản phẩm khuếch đại.

3.2. Ưu điểm của kỹ thuật ARMS PCR

Kỹ thuật ARMS-PCR có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, khả năng phát hiện nhiều loại đột biến cùng lúc và thời gian thực hiện ngắn. Điều này giúp nâng cao hiệu quả trong việc chẩn đoán bệnh.

IV. Kỹ thuật lai điểm ngược trong phát hiện đột biến

Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse Dot Blot) là một phương pháp hiện đại khác được sử dụng để phát hiện các đột biến gen beta globin. Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến trên một màng duy nhất.

4.1. Nguyên tắc của kỹ thuật lai điểm ngược

Kỹ thuật lai điểm ngược sử dụng các đầu dò oligonucleotide để phát hiện các đoạn ADN có chứa đột biến. Các đầu dò này được gắn trên một màng và sẽ tạo ra tín hiệu khi có sự kết hợp với ADN mục tiêu.

4.2. Ứng dụng của kỹ thuật lai điểm ngược trong chẩn đoán

Kỹ thuật lai điểm ngược đã được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu để phát hiện các đột biến beta thalassemia. Phương pháp này giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán và giảm thiểu thời gian thực hiện.

V. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc kết hợp giữa ARMS-PCR và lai điểm ngược mang lại hiệu quả cao trong việc phát hiện các đột biến gen beta globin. Kết quả này có thể được ứng dụng trong các chương trình tầm soát bệnh thalassemia tại cộng đồng.

5.1. Kết quả sàng lọc đột biến gen beta globin

Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phát hiện đột biến gen beta globin bằng ARMS-PCR và lai điểm ngược đạt hiệu quả cao, giúp phát hiện sớm các trường hợp mắc bệnh.

5.2. Ứng dụng trong chương trình tầm soát bệnh thalassemia

Việc áp dụng các kỹ thuật này trong chương trình tầm soát bệnh thalassemia sẽ giúp giảm thiểu số ca bệnh nặng và nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh.

VI. Kết luận và triển vọng tương lai

Phát hiện đột biến gen beta globin bằng kỹ thuật ARMS-PCR và lai điểm ngược là một bước tiến quan trọng trong chẩn đoán bệnh beta thalassemia. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp này để nâng cao hiệu quả chẩn đoán.

6.1. Tương lai của nghiên cứu về beta thalassemia

Nghiên cứu về beta thalassemia cần được mở rộng để phát hiện thêm nhiều loại đột biến mới, từ đó cải thiện các phương pháp chẩn đoán và điều trị.

6.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức cộng đồng

Nâng cao nhận thức về bệnh beta thalassemia và các phương pháp phát hiện đột biến là rất cần thiết để giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu: Có 9 đột biến liên quan tới codon ATG là tín hiệu bắt đầu dịch mã dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia [70].  Đột biến vô nghĩa: Một số đột biến thay thế dẫn tới kết thúc sớm chuỗi β-globin. Nguyên nhân là do đột biến trực tiếp tạo codon kết thúc hoặc thêm hay mất một vài nucleotide dẫn tới thay đổi khung đọc mở, tạo 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] codon kết thúc sớm. Ví dụ, đột biến tại Cd 17 (A→T) của exon 1, làm thay đổi axit amin lysine chuyển thành thymine, đƣợc phiên mã thành bộ ba kết thúc UAG ở mRNA là đột biến phổ biến ở Thái Lan và Việt Nam [12,57].

 Đột biến khung: Thêm hoặc mất một hoặc vài nucleotide làm thay đổi khung đọc mở tạo kiểu hình β+-thalassemia. Điển hình nhƣ đột biến mất nucleotide A tại Cd 6 phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải, đột biến gây lệch khung đọc do mất 4 nucleotide TCTT tại Cd 41 và 42 phổ biến ở Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam [15,57]. Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia [45]. Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Svasti cho thấy có 8 đột biến thƣờng gặp, chiếm khoảng 95% các trƣờng hợp β-thalassemia bao gồm: Cd 17 (A→T), Cd 41/42 (-TCTT), -28 (A→G), Cd 71/72 (+A), IVS1.4 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia Dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh β-thalassemia đƣợc chia thành ba thể chính: thể nặng, thể trung gian, thể nhẹ (Bảng 1.

Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia [30] Kiểu hình Kiểu gen đột biến Chỉ số hồng cầu Đặc điểm Hb 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] β- β+/β+ Hb <7 g/dL HbA2 tăng thalassemia βo/βo MCV: 50-60 fL HbF: 70-90% thể nặng β+/β+ MCH: 14-20 pg β- β+/β++ Hb: 6-10 g/dL HbA2 tăng thalassemia β+/βo MCV: 55-70 fL HbF tăng đến thể trung βo/βo + yếu tố ảnh MCH: 15-23 pg 100% gian hƣởng β++/β Hb nam: 9-15 HbA2 >3.2% β+/β g/dL HbF: 0,5-6% β- Hb nữ: 9-13 thalassemia βo/β g/dL thể nhẹ MCV: 55-75 fL MCH: 19-25 pg β-thalassemia thể nặng: Trẻ sơ sinh mắc bệnh β-thalassemia thể nặng có biểu hiện lâm sàng rất sớm, từ 6 tháng đến 24 tháng tuổi. Trẻ bị tình trạng thiếu máu nghiêm trọng. Do đó, cần đƣợc điều trị bằng truyền máu thƣờng xuyên. Trẻ kém phát triển, có thể gặp các vấn đề nhƣ tiêu chảy, sốt, bụng to, lách to, xanh xao, vàng da, dị tật xƣơng bao gồm xƣơng dài ở chân, điển hình là thay đổi hộp sọ và mặt [23].

Bệnh nhân thalassemia thể nặng có số lƣợng tế bào hồng cầu tăng lên, thể tích trung bình của hồng cầu (MCV) thấp, lƣợng hemoglobin trung bình trong mỗi hồng cầu (MCH) ở mức trung bình [13]. β-thalassemia thể trung gian: Bệnh nhân β-thalassemia thể trung gian có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn thể nặng, không yêu cầu hoặc chỉ thỉnh thoảng phải truyền máu. Trẻ em biểu hiện bệnh rõ ràng ở độ tuổi từ 2 đến 6. Trẻ bị chậm phát triển hoặc hoàn toàn không có biểu hiện gì cho tới khi trƣởng thành ngoại trừ thiếu máu nhẹ [23].

β-thalassemia thể nhẹ: Bệnh nhân thể nhẹ thƣờng không có biểu hiện lâm sàng, nhƣng thỉnh thoảng thiếu máu nhẹ. Khi cả hai bố mẹ bị thể nhẹ thì xác suất 25% con sinh ra có nguy cơ mắc bệnh β-thalassemia thể nặng [23]. 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Các đặc điểm huyết học đặc trƣng là tế bào hồng cầu nhỏ và nhợt nhạt hơn so với bình thƣờng, tăng HbA2 [13]. Ngoài ra, còn có các thể β-thalassemia khác nhƣ: thể phối hợp Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia; thể phối hợp β-thalassemia và α- thalassemia.

Thể phối hợp Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia: Đột biến ở Cd 26 (G→A) thuộc exon 1, làm thay đổi axit amin glutamate thành lysin, tạo thể HbE [70]. Kiểu gen dị hợp tử hoặc đồng hợp tử HbE mà không phối hợp với β-thalassemia chỉ gây kiểu hình β-thalassemia thể nhẹ. Tuy nhiên ở những trẻ này vẫn có biểu hiện chậm phát triển ở mức độ vừa phải, thiếu máu nhẹ, ảnh hƣởng đến phát triển thể lực và tinh thần [70]. Sự kết hợp của HbE với β-thalassemia làm cho biểu hiện lâm sàng trở nên đa dạng, có thể thay đổi giống nhƣ thalassemia từ thể nặng đến thể nhẹ [70]: - β-thalassaemia/HbE thể nhẹ: không cần điều trị và hiếm khi biểu hiện các triệu chứng lâm sàng, nồng độ hemoglobin từ 9-12 g/dl.

Thể HbE kết hợp với các đột biến -28 (A→G) hoặc Cd 19 (A→G) có thể dẫn tới kiểu hình thể nhẹ [70]. - β-thalassaemia/HbE thể trung gian: triệu chứng giống với β- thalassemia thể trung gian, nồng độ hemoglobin từ 6-7 g/dl. Thể HbE kết hợp với đột biến IVS1. - β-thalassaemia/HbE thể nặng: triệu chứng giống với β-thalassemia thể nặng, nồng độ hemoglobin thấp, chỉ từ 4-5 g/dl.

Thể HbE kết hợp với các đột biến Cd 17 (A→T) hoặc Cd 41/42 (-TCTT) có thể dẫn tới kiểu hình thể nặng [70]. 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia: Sự kết hợp đột biến α- thalassemia có thể làm giảm mức độ nghiêm trọng của β-thalassemia thể nặng thành thể trung gian. Trong hầu hết các trƣờng hợp bệnh đều có liên quan đến kết hợp 3 gen α-globin (ααα/). Thừa hai gen α-globin (ααα/ααα) hoặc (αααα/αα) kết hợp với β-thalassemia thể nhẹ tạo thalassaemia thể trung gian [8,24].

Tuy nhiên, khi thừa một gen α (ααα/αα) thì kiểu hình lâm sàng phụ thuộc vào mức độ nghiêm trọng của đột biến β-thalassemia [10,62].5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 1.1 Chẩn đoán lâm sàng Trẻ bị thalassemia thể nặng sau hai tuổi bị nghi ngờ mắc bệnh β- thalassemia với các biểu hiện thiếu máu nặng, vàng da, lách to. Trẻ bị thalassemia thể trung gian có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn. Với trẻ mang gen bệnh thƣờng không có triệu chứng, đôi khi chỉ là thiếu máu nhẹ [22].2 Chẩn đoán huyết học Chỉ số hồng cầu: Bệnh nhân thalassemia thể nặng có nồng độ hemoglobin (Hb) giảm (<7 g/dl), thể tích trung bình hồng cầu (MCV) trong khoảng 50-60 fl và lƣợng hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCH) từ 14-20 pg. Bệnh nhân thalassemia thể trung bình có nồng độ Hb từ 6-10 g/dl, MCV từ 55-70 fl và MCH từ 15-23 pg.

Bệnh nhân thalassemia thể nhẹ có nồng độ Hb từ 9-15 g/dL đối với nam và 9-13 g/dL (đối với nữ), MCV từ 55-75 fL, MCH từ 19-25 pg (Bảng 1) [30]. Phân tích tế bào máu ngoại vi: Quan sát dƣới kính hiển vi, ngƣời bị bệnh thalassemia có hồng cầu nhợt nhạt, nhỏ hơn so với bình thƣờng, phần lớn có hình dạng bất thƣờng [13]. Phân tích hemoglobin: Hầu hết các quy trình chẩn đoán bệnh nhân thalassemia hiện nay đều sử dụng phƣơng pháp phân tích các chỉ số hồng cầu 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] để sàng lọc ban đầu. Sau đó, sử dụng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) để phân tích hemoglobin trong mẫu dựa trên các chỉ số MCV nhỏ hơn 78 fl và/hoặc MCH nhỏ hơn 27 pg [19].

Tuy vậy, quy trình này không đƣợc sử dụng phổ biến ở vùng nông thôn các khu vực Đông Nam Á, Nam Á do điều kiện vật chất và thiết bị không đủ. Thay vào đó, tại các quốc gia nhƣ Thái Lan và Ấn Độ, việc sử dụng xét nghiệm tủa HbE để sàng lọc HbE (Dichlorophenol Indophenol Test - DCIP) là lựa chọn thay thế đơn giản và chi phí thấp để sàng lọc sơ bộ β-thalassemia [22]. Hemoglobin trong hồng cầu thay đổi tùy từng giai đoạn phát triển của cơ thể. Hemoglobin thời kì bào thai (từ tháng thứ 3 đến khi sinh) là HbF, đƣợc tạo thành từ 2 chuỗi alpha globin và gamma globin (α2γ2).

Sau khi sinh, chuỗi γ (HbF) không đƣợc tổng hợp, thay thế vào đó là chuỗi β, tạo hemoglobin ở ngƣời trƣởng thành gồm HbA1 với 2 chuỗi alpha globin và beta globin (α2β2) và HbA2 với 2 chuỗi alpha globin và delta globin (α2δ2) [11]. Trong điều kiện bình thƣờng, hồng cầu ngƣời trƣởng thành có khoảng 98% HbA1, 2% HbA2 và rất ít HbF [11]. Các trƣờng hợp bệnh β-thalassemia, chuỗi β-globin không đƣợc tổng hợp đầy đủ, làm tăng sản xuất các chuỗi γ, δ, α dẫn tới tình trạng giảm HbA1, tăng HbF và HbA2. Đối với các trƣờng hợp có đột biến Cd 26 gây thể HbE sẽ có hiện diện HbE≥25% trên điện di Hb [11].

Do đó, HbA1, HbF, HbA2, HbE đƣợc coi là các tiêu chuẩn điện di hemoglobin đóng vai trò quyết định để chẩn đoán bệnh β-thalassemia [11]. HbA2≥4,0% là chỉ số thƣờng đƣợc dùng để chẩn đoán β-thalassemia. Trƣờng hợp HbA2≥4,0% và chỉ số hồng cầu giảm, đƣợc chẩn đoán là mang gen bệnh β-thalassemia. Khi HbA2>4,0%, nhƣng chỉ số hồng cầu bình thƣờng, ngƣời bệnh có thể thiếu vitamin B12/folate, bệnh gan hoặc nhiễm HIV.

Các trƣờng hợp có HbA2 từ 3,3-3,9% cần khẳng định bằng phân tích ADN. Tuy nhiên, 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] mức độ HbA2 và/hoặc chỉ số hồng cầu có thể bình thƣờng ở ngƣời bệnh β- thalassemia có gen β-globin bị đột biến vùng promoter hoặc đuôi poly A. Khi đỉnh HbA2>10%, ngƣời bệnh có thể có các biến thể hemoglobin khác, ví dụ HbE, HbS,. Sơ đồ sàng lọc ngƣời lành mang gen bệnh β-thalassemia đƣợc trình bày ở Hình 1.

Biểu đồ sàng lọc ngƣời bệnh β-thalassemia [14].3 Phân tích di truyền phân tử Hầu hết các kỹ thuật phát hiện các đột biến trên gen β-globin hiện nay thƣờng dựa trên PCR, đƣợc chia thành hai nhóm chính: lai oligonucleotide đặc hiệu allen và mồi đặc hiệu allen [23]. 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lai oligonucleotide đặc hiệu allen (Allele - specific oligonucleotide hybridization): Trong nhóm phƣơng pháp này, yêu cầu thiết kế hai đầu dò oligonucleotide, một đầu dò bổ sung với trình tự ADN đột biến và một đầu dò bổ sung với trình tự bình thƣờng tại cùng vị trí. Các đầu dò này thƣờng chỉ sai khác nhau một nucleotide. Dựa trên nguyên tắc này, kỹ thuật lai điểm (dot blot) đã đƣợc phát triển và áp dụng thành công ở nhiều phòng thí nghiệm.

Tại Địa Trung Hải năm 1989, kỹ thuật này đã đƣợc Ristaldi và cs. sử dụng để sàng lọc 8 đột biến trên gen β-globin [48]. Trong kỹ thuật lai điểm, trình tự ADN đích đƣợc cố định trên màng nylon, sau đó lai với đầu dò đƣợc đánh dấu. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp sàng lọc nhiều đột biến, kỹ thuật lai điểm gây tốn thời gian do các bƣớc lai và rửa cần riêng biệt đối với từng đột biến.

Do đó, kỹ thuật lai điểm ngƣợc (reverse dot blot) đã đƣợc phát triển cho phép phát hiện đƣợc đồng thời nhiều đột biến. Đầu dò đƣợc cố định trên màng nylon, sau đó lai với ADN đƣợc đánh dấu. Các bƣớc lai và rửa đƣợc tiến hành đồng thời đối với tất cả các đột biến [53].