Luận án về đột biến gen atp7b trong gia đình bệnh nhân Wilson

Luận án nghiên cứu phát hiện người mang đột biến gen atp7b trong gia đình bệnh nhân Wilson, góp phần hiểu rõ di truyền bệnh lý này.

• Tác giả: Nguyễn Thị Mai Hương
• Người hướng dẫn: GS. Tạ Thành Văn
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Phát hiện đột biến gen atp7b ở gia đình bệnh nhân Wilson
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON
• 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
• 1.2. DỊCH TỄ HỌC VÀ PHÂN LOẠI BỆNH WILSON
• 1.2.1. Dịch tễ học
• 1.2.2. Phân loại bệnh
• 1.3. CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ BỆNH WILSON
• 1.3.1. Vị trí, cấu trúc phân tử gen ATP7B
• 1.3.2. Cấu trúc và chức năng protein ATP7B
• 1.3.3. Đặc điểm đột biến gen ATP7B
• 1.3.4. Cơ chế bệnh sinh bệnh Wilson
• 1.4. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ CẬN LÂM SÀNG, TIÊU CHUẨN CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ BỆNH WILSON
• 1.4.1. Đặc điểm lâm sàng
• 1.4.2. Đặc điểm cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán và điều trị bệnh Wilson
• 1.5. PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN ATP7B BỊ ĐỘT BIẾN VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH WILSON
• 1.5.1. Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến
• 1.5.2. Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson
• 1.6. CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH BỆNH WILSON
• 1.6.1. Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger
• 1.6.2. Một số phương pháp khác được dùng trong phát hiện đột biến gen ATP7B
• 1.6.3. Phương pháp phân tích đột biến mới
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Nhóm bệnh nhân và các thành viên trong gia đình
• 2.1.2. Nhóm chẩn đoán trước sinh
• 2.1.3. Tiêu chuẩn lựa chọn
• 2.1.4. Tiêu chuẩn loại trừ
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.2.1. Thiết bị và các loại tiêu hao
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.3.2. Xây dựng phả hệ và thu thập mẫu
• 2.3.3. Phương pháp sử dụng trong phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhân Wilson và các thành viên trong gia đình
• 2.3.4. Phương pháp sử dụng trong chẩn đoán trước sinh cho thai nhi
• 2.4. Đạo đức nghiên cứu
• 2.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân Wilson
• 3.1.1. Phát hiện đột biến gen ATP7B cho 78 bệnh nhân Wilson
• 3.1.2. Xác định đột biến gen ATP7B cho các thành viên gia đình 74 bệnh nhân Wilson
• 3.2. Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson
• 3.2.1. Kết quả tách DNA tổng số từ dòng tế bào ối và PCR
• 3.2.2. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson
• 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Phát hiện đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân Wilson
• 4.2. Đặc điểm đột biến gen ATP7B của 78 bệnh nhân Wilson
• 4.3. Ý nghĩa của sàng lọc đột biến cho các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson
• 4.4. Ý nghĩa của chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về bệnh Wilson và gen ATP7B

Bệnh Wilson là một bệnh lý di truyền lặn hiếm gặp, có tỷ lệ mắc từ 1/5000 đến 1/30000 trẻ đẻ sống. Nguyên nhân chính của bệnh là do đột biến gen ATP7B, gen này mã hóa cho protein ATPase có chức năng vận chuyển đồng từ gan ra ngoài cơ thể. Rối loạn chức năng của protein này dẫn đến sự tích lũy đồng trong gan và các cơ quan khác, gây ra các triệu chứng liên quan đến gan, thần kinh và tâm thần. Việc phát hiện sớm đột biến gen ATP7B là rất quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh Wilson, giúp giảm thiểu các biến chứng nghiêm trọng có thể xảy ra. Theo nghiên cứu, bệnh nhân thường được chẩn đoán ở giai đoạn muộn do sự đa dạng trong biểu hiện lâm sàng. Do đó, việc áp dụng các phương pháp xét nghiệm di truyền để phát hiện gen di truyền là cần thiết nhằm nâng cao khả năng chẩn đoán và điều trị sớm cho bệnh nhân.

II. Đặc điểm đột biến gen ATP7B

Đột biến gen ATP7B có thể xảy ra ở nhiều vị trí khác nhau trong gen, dẫn đến các dạng bệnh lý khác nhau. Nghiên cứu cho thấy có nhiều loại đột biến di truyền như đột biến thay thế nucleotid, đột biến mất đoạn, và đột biến vô nghĩa. Đặc biệt, đột biến H1069Q là một trong những đột biến phổ biến nhất được phát hiện ở người châu Âu và Địa Trung Hải. Việc phân tích các đột biến gen này không chỉ giúp xác định người mang gen bệnh mà còn hỗ trợ trong việc chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ có tiền sử gia đình mắc bệnh Wilson. Các phương pháp như PCR và giải trình tự gen đã được áp dụng để phát hiện các đột biến gen này, từ đó giúp xây dựng quy trình chẩn đoán hiệu quả hơn cho bệnh nhân và gia đình họ.

III. Ý nghĩa của việc phát hiện đột biến gen ATP7B

Việc phát hiện đột biến gen ATP7B có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh Wilson. Đầu tiên, nó giúp xác định người mang gen bệnh, từ đó có thể thực hiện tư vấn di truyền cho các thành viên trong gia đình. Thứ hai, việc phát hiện sớm các đột biến gen này có thể giúp bệnh nhân nhận được điều trị kịp thời, giảm thiểu nguy cơ phát triển các biến chứng nghiêm trọng như suy gan. Cuối cùng, xét nghiệm di truyền còn có vai trò quan trọng trong chẩn đoán trước sinh, giúp giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh và nâng cao chất lượng cuộc sống cho gia đình. Nghiên cứu này không chỉ có giá trị trong lĩnh vực y học mà còn góp phần nâng cao nhận thức về bệnh lý di truyền trong cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Bệnh Wilson là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (NST) thường do đồng lắng đọng ở các mô trong cơ thể, nhiều nhất ở gan và não. Biểu hiện lâm sàng của bệnh chủ yếu liên quan đến bệnh gan, thần kinh, tâm thần (Ferenci và cs, 2012).

Năm 1850, Wilson lần đầu tiên được báo cáo là một hội chứng mang đặc điểm lâm sàng có tính chất di truyền hay bệnh thoái gan (Aoki, 2004).Năm 1912, bệnh Wilson được nhà thần kinh học người Anh, Samuel Alexander Kinnier Wilson (1878-1937) mô tả là bệnh “thoái hóa tiến triển hình hạt đậu”, mang tính chất gia đình, có thể tử vong do bệnh thần kinh kèm theo các bệnh về gan mạn tính dẫn tới xơ gan. Nghiên cứu mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng được thực hiện trên bệnh nhân Wilson đã cho thấy mối liên quan giữa các bất thường trên xét nghiệm sinh hóa và di truyền (Das và cs, 2006). Năm 1993, gen ATP7B gây bệnh Wilson đã được tách dòng thành công. Gen ATP7B là một thành viên của nhóm ATPase vận chuyển cation (Yamaguchi và cs, 1993; Tanzi và cs, 1993).

Năm 1994, gen ATP7B đã được mô tả cấu trúc và chức năng một cách đầy đủ (Wu và cs, 1994). Từ đó, gen ATP7B được nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới bằng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm: PCR (Polymerase Chain Reaction), PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restricted Fragment Length Polymorphism) và giải trình tự gen. Người châu Âu và Địa Trung Hải có lượng đột biến rất phong phú, đột biến thường gặp nhất là H1069Q (Ferenci, 2006; Loudianos và cs, 1999), đột biến thay thế Histidin thứ 1069 trên chuỗi polypeptid thành Glutamin (Phụ lục 5-Bảng mã di truyền và kí hiệu viết tắt của các acid amin). Nghiên cứu phát hiện đột biến từ exon 5 đến exon 21, tác giả Shah đã phát hiện 27 đột biến khác nhau, bao gồm 5 đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn (dẫn 4 đến làm dịch khung đọc mở), 16 đột biến thay thế nucleotid (do bị thay đổi bộ ba), 2 đột biến vô nghĩa (đột biến tạo mã kết thúc sớm) và 2 đột biến vùng cắt, nối (Shah và cs, 1997; Nussbaum và cs, 2007), trong đó đột biến H1069Q là phổ biến nhất.

Đây cũng là đột biến có tỷ lệ phát hiện cao nhất (37%) trong số 50 đột biến tìm thấy trong nghiên cứu gồm 136 bệnh nhân mắc Wilson đến từ Italia, Thổ Nhĩ Kì, Tây Ban Nha và đột biến tìm thấy thường ở thể đột biến dị hợp tử kép (Loudianos và cs, 1999) và Hungary (Firneisz và cs, 2002). Nghiên cứu đột biến gen ATP7B được thực hiện ở một số nước khu vực Đông Á chẳng hạn như Trung Quốc (Liu và cs, 2004; Wu và cs, 2000; Wu và cs, 2001; Li và cs, 2011), Hàn Quốc (Yoo và cs, 2002; Gu và cs, 2003; Park và cs, 2007; Lee và cs, 2011), Đài Loan (Wan và cs, 2006; Lin và cs, 2010) và Nhật Bản (Okada và cs, 2000; Kusuda và cs, 2000). Ngoài ra, nghiên cứu đột biến gen ATP7B đã được hự chiện trên người Iran (Maleki và cs, 2013). Một số quốc gia khác chẳng hạn như: Pakistan, Bangladesh, Indonesia, Philippine hiện vẫn chưa có công bố về đột biến gen ATP7B (Ferenci và cs, 2007).

Ở khu vực Đông Nam Á, nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B rất hiếm gặp hoặc được thực hiện với cỡ mẫu nhỏ. Một nghiên cứu trên người Thái Lan đã phát hiện 2 đột biến, c.1870_1871delGA trên exon 6 và M1359V trên exon 20 (Treepongkaruna và cs, 2010), tuy nhiên đây không phải là đột biến phổ biến ở Châu Á (Ferenci, 2006). Đột biến mới trên gen ATP7B được công bố trong nhiều y văn quốc tế (Kusuda và cs, 2000; Leggio và cs, 2006; Kuppala và cs, 2009; Geng và cs, 2013) và cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đến chức năng của gen ATP7B. Các đột biến này được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn như: nghiên cứu in silico (sử dụng các chương trình tin sinh để đánh giá ảnh hưởng của đột biến đến cấu trúc và chức năng của gen), in vivo, in vitro (Squitti và cs, 2014; Dong và cs, 2016) và nghiên cứu mô hình cấu trúc không gian của gen (Huster và cs, 2012) để đánh giá ảnh hưởng của đột biến mới đến cấu trúc, chức năng của protein.

Nghiên cứu thực nghiệm in vivo hoặc in vitro trên tế bào nấm men hoặc tế bào động vật có ý vai trò tiên quyết để khẳng định chắc chắn đột biến mới 5 trên gen ATP7B là đột biến gây bệnh hay không gây bệnh (Forbes và Cox, 1998; Squitti và cs, 2014). Một số đột biến là đột biến gây bệnh khi phân tích bằng các chương trình tin sinh, trong khi nghiên cứu thực nghiệm lại có kết quả ngược lại, chẳng hạn kết quả phân tích hàm cPdel cho thấy đột biến M645R, V995A, R1041W, R1041P, A1183T. là những đột biến gây bệnh nhưng nghiên cứu thực nghiệm cho thấy những đột biến trên không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển đồng. Ngoài ra, đột biến M769V, L776V chưa được phân loại một cách chắn chắn là đột biến gây bệnh hay là một biến dị (variant).

Nghiên cứu ở mức độ chức năng của protein nhờ biểu hiện gen trong nấm men đã cho thấy M769V là đột biến gây bệnh và L776V chỉ là một biến dị hiếm gặp hoặc là một đột biến ảnh hưởng đến quá trình định vị nội bào của protein ATP7B, qua đó làm giảm lượng đồng nội bào (Forbes và Cox, 1998). Việc phân tích, đánh giá đột biến mới luôn cần có sự kết hợp của nhiều chương trình tin sinh và quan trọng nhất vẫn là thực hiện các nghiên cứu đột biến mới ở mức độ protein (Forbes và Cox, 1998; Park và cs, 2007). Từ năm 1995, nghiên cứu về chức năng của gen ATP7B đã được thực hiện trên các chủng nấm men (Forbes và Cox, 1998), tế bào CHO-K1 (Cater và cs, 2007; Wan và cs, 2010) để nghiên cứu ảnh hưởng của các đột biến gen ATP7B đến quá trình vận chuyển đồng. Nghiên cứu in vivo và in vitro có thể phân biệt được ảnh hưởng của đột biến gen đến quá trình cuộn gập của protein (protein folding) hoặc chức năng của protein.

Theo tác giả Huster, đột biến D1027A ảnh hưởng đến năng suất vận chuyển đồng do phá vỡ quá trình thủy phân mặc dù nó không ảnh hưởng đến việc liên kết đồng (Huster và cs, 2012). Đột biến vùng mã hóa và không dịch mã được nghiên cứu bằng phương pháp cách tách dòng gen và tạo đột biến điểm trực tiếp. Dòng tế bào có đột biến điểm được chuyển vào các tế bào CHO-K1 để đánh giá ảnh hưởng của các đột biến này đến chức năng của gen. Kết quả cho thấy, đột biến sai nghĩa vùng điều khiển gen đã làm giảm hoạt tính của vùng điều khiển gen, từ 13 đến 51%.

Nghiên cứu biểu hiện tế bào bị đột biến vùng cắt nối của exon 12 trên tế bào CHO- K1 cho thấy thể bị đột biến bị giảm khả năng vận chuyển đồng đến 80% so với thể không bị đột biến (Wan và cs, 2010). 6 Wilson là bệnh lý đặc biệt bởi sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình. Kiểu hình của bệnh Wilson không chỉ phụ thuộc vào thể đột biến, mà còn phụ thuộc vào từng loại đột biến cụ thể xảy ra trên các vị trí khác nhau của gen ATP7B (Fan và cs, 2000; Lei và cs, 2004; Bie và cs, 2007; Chang và cs, 2017). Tuy nhiên, phần lớn y văn báo cáo kết quả nghiên cứu một số đột biến thường gặp đến biểu hiện lâm sàng của bệnh.

Theo đó, bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử R778L có biểu hiện bệnh từ sớm và lâm sàng nặng của thể bệnh gan (Forbes và Cox, 1998; Kusuda và cs, 2000). Trong khi, đột biến R778Q được tìm thấy trên người Đài Loan gây ra hậu quả ít nghiêm trọng hơn so với đột biến R778L, mặc dù Glutamin có tính chất gần với Arginin hơn là Leucin (Forbes và Cox, 1998). Đột biến dị hợp tử R778L trên gen ATP7B (ví dụ kiểu gen c.2871delC/R778L) không ảnh hưởng nhiều đến kiểu hình của bệnh nhân Wilson (Okada và cs, 2000) nhưng một số nghiên cứu khác đã không thể khẳng định mối liên quan giữa đột biến đồng tử R778L và các triệu chứng lâm sàng của bệnh gan ở bệnh nhân Wilson (Bie và cs, 2007). Bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử R779L thường có vấn đề về ngôn ngữ, cử động lưỡi và bệnh biểu hiện muộn, thường từ 18 tuổi, trong khi bệnh nhân dị hợp tử với đột biến này có thể được chia thành hai nhóm: nhóm có vấn đề về cử động lưỡi và nhóm có vấn đề về nội tạng (Fan và cs, 2000); đồng hợp tử đột biến H1069Q không liên quan đến mức độ biểu hiện của bệnh (Anjali và cs, 1997) nhưng có thể ảnh hưởng đến độ tuổi phát bệnh và thể bệnh thần kinh (Firneisz và cs, 2002; Bie và cs, 2007); bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử G943S, V1106I biểu hiện bệnh muộn và ảnh hưởng đến thần kinh (Forbes và Cox, 1998; Lei và cs, 2004).

Bệnh nhân Wilson có kiểu gen đồng hợp tử đột biến A874V thường biểu hiện bệnh liên quan đến thần kinh và phát bệnh muộn (Kusuda và cs, 2000). Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Năm 1965, bệnh Wilson trên người Việt Nam được Scheinberg mô tả lần đầu tiên trong y văn báo cáo khái quát về bệnh Wilson, bao gồm các đặc điểm di truyền, đặc điểm lâm sàng và sự phân bố địa lý của bệnh Wilson trên thế giới (Scheinberg 7 và cs, 1965). Năm 2005, tác giả Thái Duy Thành đã phân tích các triệu chứng lâm sàng của bệnh Wilson, một số thay đổi trên hình ảnh học và chỉ số sinh hóa (Thái Duy Thành, 2005). Năm 2006, tác giả Lê Đức Hinh đã mô tả đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân Wilson.

Tuy nhiên, nghiên cứu đã không tiến hành phát hiện đột biến gen ATP7B (Lê Đức Hinh và cs, 2006). Năm 2008, tác giả Hoàng Lê Phúc là người đầu tiên tiến hành nghiên cứu đột biến gen ATP7B trên 16 bệnh nhân nhi mắc bệnh Wilson tại Bệnh viện Nhi Đồng 1, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. Nghiên cứu đã báo cáo 8 đột biến, bao gồm: P767Pfs, T850I, G943D, I1148T, E1173K, E1372X, IVS15-2 A>G, và 1 đột biến mới L1015R. Tuy nhiên, đột biến gen ATP7B được sàng lọc từ exon 4 đến exon 21 vì quá trình phân tích gen được thực hiện ở Áo (Hoàng Lê Phúc và cs, 2008).

Năm 2010, tác giả Nguyễn Thị Mai Hương đã báo cáo kết quả phát hiện đột biến gen ATP7B trên 10 bệnh nhân nhi mắc Wilson ở Bệnh viện Nhi Trung Ương.