Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh tăng tiểu cầu tiên phát (Essential Thrombocythemia - ET) là một bệnh lý tăng sinh tủy ác tính mạn tính (myeloproliferative neoplasm) đặc trưng bởi tình trạng tế bào gốc bất thường trong tủy xương tăng sinh quá mức tiểu cầu. Tiểu cầu là các mảnh tế bào giữ vai trò thiết yếu trong quá trình đông máu, bịt kín tổn thương mạch máu và thúc đẩy tái tạo tế bào nội mô. Tuy nhiên, sự gia tăng số lượng tiểu cầu không kiểm soát dẫn đến nguy cơ cao mắc các biến cố tim mạch như hình thành huyết khối (thrombosis), xuất huyết (hemorrhage), và có thể tiến triển thành xơ tủy hoặc chuyển dạng bệnh bạch cầu cấp.

Về căn nguyên di truyền, các nghiên cứu đã xác định các đột biến chính (driver mutations) liên quan đến bệnh bao gồm JAK2 (đặc biệt là đột biến điểm JAK2V617F chiếm khoảng 50–55% trường hợp), CALR và MPL (chiếm khoảng 3–15%). Mặc dù vậy, cơ chế sinh bệnh học và các yếu tố nguy cơ di truyền ở nhiều bệnh nhân không mang đột biến kinh điển hoặc cơ chế phát sinh bệnh học đầy đủ vẫn chưa được làm sáng tỏ toàn diện, đặc biệt là trong quần thể người Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu:

  1. Khám phá các đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) mới trên vùng khởi động (promoter) của các gen IFNG, TYK2, PIK3CA, TP53 ở bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát người Việt Nam.
  2. Điều tra và xác định tần số xuất hiện của các biến thể SNP này trong nhóm bệnh nhân và nhóm người khỏe mạnh đối chứng.
  3. Đánh giá mối liên hệ giữa các biến thể di truyền rs2069718 (IFNG), rs280500 (TYK2), rs6443624 (PIK3CA) và rs1042522 (TP53) với nguy cơ mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, cung cấp cơ sở dữ liệu định hướng phát triển các phác đồ điều trị mới.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

  1. Thu thập mẫu máu lâm sàng và tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm.
  2. Tối ưu hóa phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase (PCR) và giải trình tự nucleotide các gen IFNG, TYK2, PIK3CA, TP53.
  3. Xác định các SNP trong chuỗi trình tự và tính toán tần số các kiểu gen, alen tương ứng.
  4. Xử lý và phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm để đánh giá mối tương quan dịch tễ - di truyền học.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Nghiên cứu được phê duyệt bởi Hội đồng Đạo đức Viện Nghiên cứu Hệ gen (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu máu toàn phần chống đông bằng EDTA được thu thập từ Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương và Học viện Quân y (Hà Nội). Nghiên cứu bao gồm hai nhóm:
    • Nhóm bệnh nhân mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát: tổng số 106 mẫu (trong đó 103 mẫu phân tích thành công cho gen IFNG, 102 mẫu cho TYK2, 85 mẫu cho PIK3CA, 97 mẫu cho TP53).
    • Nhóm đối chứng người khỏe mạnh: tổng số 150 mẫu (trong đó 113 mẫu cho IFNG, 117 mẫu cho TYK2, 107 mẫu cho PIK3CA, 128 mẫu cho TP53).
  • Phạm vi thời gian và địa điểm: Đề tài hoàn thành vào tháng 11/2022 tại Phòng Miễn dịch Di truyền, Viện Nghiên cứu Hệ gen (IGR - VAST).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và các gen mục tiêu

  • Gen IFNG (Interferon gamma): Mã hóa cytokine thiết yếu cho cả hệ miễn dịch bẩm sinh và thích ứng, đóng vai trò hoạt hóa đại thực bào, kích thích tế bào NK và bạch cầu trung tính, cảm ứng biểu hiện MHC lớp II. Sự biểu hiện bất thường của IFNG có liên quan đến các bệnh viêm và tự miễn.
  • Gen TYK2 (Tyrosine kinase 2): Thuộc họ Janus kinase (JAKs), gắn với miền tế bào chất của thụ thể cytokine loại I và loại II, tham gia dẫn truyền tín hiệu điều hòa cytokine và truyền tín hiệu interferon loại I và loại III.
  • Gen PIK3CA: Mã hóa tiểu đơn vị xúc tác p110 alpha (p110α) của enzyme phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). Enzyme này tham gia vào con đường tín hiệu AKT1 dưới sự kích thích của thụ thể tyrosine kinase (như EGF, insulin, IGF1, VEGFA, PDGF), điều hòa di cư tế bào nội mô, phát triển hệ mạch và tân tạo mạch.
  • Gen TP53: Mã hóa protein ức chế khối u p53, kiểm soát chu kỳ tế bào, kích hoạt quá trình chết theo chương trình (apoptosis), duy trì tính ổn định của hệ gen, tham gia sửa chữa DNA và ức chế sự tạo mạch khối u.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng bộ kít thương mại DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hoa Kỳ) từ 300 µL máu toàn phần với dung dịch đệm AL và Proteinase K, ủ ở 56°C trong 10 phút, ly tâm cột lọc với đệm AW1, AW2 và hòa tan thu hồi DNA bằng Elution Buffer. Chất lượng DNA được kiểm tra bằng điện di gel agarose 0.8%.
  • Kỹ thuật định dạng kiểu gen KASP (Kompetitive Allele Specific PCR): Thực hiện trên đĩa 384 giếng với thể tích phản ứng 5 µL (gồm 2.5 µL mẫu DNA nồng độ 10 ng/µL, 2.5 µL 2x KASP Master mix, 0.07 µL KASP Assay mix chứa mồi đặc hiệu alen gắn đuôi tín hiệu huỳnh quang FAM và HEX). Phản ứng nhiệt Touchdown PCR gồm 10 chu kỳ giảm nhiệt độ gắn mồi từ 61°C xuống 55°C (giảm 0.6°C/chu kỳ), tiếp nối bởi 26 chu kỳ PCR 2 bước ở 55°C. Tín hiệu huỳnh quang được đo trên máy đọc đĩa huỳnh quang ở nhiệt độ dưới 40°C.
  • Phản ứng PCR khuếch đại gen và giải trình tự Sanger:
    • Mồi đặc hiệu khuếch đại: IFNG-F/R (5'-ACACCAAATCCAAAACGAGTGAA-3' / 5'-CTGTAATCCCCCAGCCATCC-3'), TYK2-F/R (5'-ACAGGCAGATGTGGTCAAACA-3' / 5'-TCCTAGGCTTTGGGGAGTCA-3'), PI3KCA-F/R (5'-TGTCAGTTCTCCCTGTTCTCA-3' / 5'-AGACAAGAGGCCCTGAAAGC-3'), TP53-F/R (5'-AAGTCTCATGGAAGCCAGCC-3' / 5'-GTGGATCCATTGGAAGGGCA-3').
    • Phản ứng PCR thực hiện với Taq polymerase buffer 10X, dNTPs (2.5 mM), primer (10 pmol) và Taq polymerase, nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 63°C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0.8% nhuộm Ethidium Bromide (EtBr), so sánh với thang chuẩn 1 kb DNA ladder.
    • Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự nucleotide trực tiếp bằng phương pháp Sanger trên hệ thống ABI PRISM Genetic Analyzer.
  • Xử lý và phân tích số liệu: Dữ liệu trình tự được so sánh với chuỗi tham chiếu trên GenBank bằng phần mềm BioEdit 7.0. Phân tích thống kê xác định tỷ số chênh (Odds Ratio - OR), khoảng tin cậy 95% (95% Confidence Interval - CI) và kiểm định chi bình phương ($\chi^2$) với ngưỡng ý nghĩa thống kê xác định khi $p < 0.05$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề (Chapter 1: Introduction)

Chương mở đầu phân tích tầm quan trọng của hệ tuần hoàn, chức năng sinh lý của các dòng tế bào máu và vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu và bảo vệ thành mạch. Tác giả nêu rõ sự khác biệt giữa tăng tiểu cầu phản ứng (essential thrombocytosis - thứ phát do nhiễm trùng, viêm mạn, mất máu) và bệnh tăng tiểu cầu tiên phát (essential thrombocythemia - do rối loạn tủy xương). Từ đó, chương xác lập mục tiêu xác định tần số và mối liên hệ của 4 biến thể rs2069718, rs280500, rs6443624, rs1042522 với bệnh ET trên người Việt Nam.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Chapter 2: Literature Reviews)

Chương này tổng hợp các cơ sở lý thuyết và y văn quốc tế cũng như tại Việt Nam:

  • Tổng quan bệnh tăng tiểu cầu tiên phát: Lịch sử định danh từ năm 1934 và phân loại năm 1951, dịch tễ học với tỷ lệ mắc 1.5/100,000 người/năm, tỷ lệ lưu hành 38–57/100,000 dân, thường gặp ở phụ nữ và độ tuổi 50–60. Tiêu chuẩn chẩn đoán theo WHO dựa trên số lượng tiểu cầu trên 450,000/µL kèm theo sự hiện diện của đột biến JAK2, CALR hoặc MPL. Phác đồ điều trị tại Việt Nam sử dụng Aspirin 81 mg/ngày để giảm triệu chứng vi mạch và ngừa huyết khối.
  • Tổng quan các gen nghiên cứu: Trình bày cấu trúc, vị trí băng nhiễm sắc thể theo Ensembl/GeneLoc và cơ chế chức năng của các gen IFNG, TYK2, PIK3CA và TP53 trong điều hòa miễn dịch, dẫn truyền tín hiệu qua thụ thể cytokine và kiểm soát phân chia tế bào.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp thực nghiệm (Chapter 3: Materials and Experimental Methods)

Chương 3 mô tả chi tiết nguồn gốc 106 mẫu bệnh nhân và 150 mẫu đối chứng, quy trình bảo quản mẫu ở -20°C, thông số các cặp mồi thiết kế, danh mục hóa chất (Qiagen, Fermentas, Bioneer, ABI, Merck) và thiết bị phân tích (máy ly tâm Eppendorf, máy điện di Bio-Rad, máy luân nhiệt GeneAmp PCR System 9700, máy đọc trình tự ABI PRISM). Toàn bộ quy trình 9 bước tách chiết DNA từ máu toàn phần, bảng thành phần phản ứng PCR, chu trình nhiệt KASP 36 chu kỳ và các công thức toán học tính toán OR, 95% CI được chuẩn hóa chi tiết.

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Chapter 4: Results and Discussion)

Chương 4 trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình điện di, định dạng kiểu gen bằng KASP và giải trình tự Sanger:

1. Biến thể rs2069718 trên gen IFNG

Tần số kiểu gen GG ở nhóm bệnh nhân ET (35.92%) cao hơn rõ rệt so với nhóm đối chứng (18.58%). Phân tích thống kê chỉ ra kiểu gen GG liên quan có ý nghĩa đến sự gia tăng nguy cơ mắc bệnh ET ($OR = 2.46$, 95% CI: $1.33 - 4.54$, $p = 0.0038$). Ngược lại, kiểu gen AA có tần số tương đương giữa hai nhóm và được dùng làm nhóm tham chiếu ($OR = 1.0$). Kết quả giải trình tự Sanger kiểm chứng 100% độ tương đồng với kết quả KASP.

Kiểu gen (IFNG rs2069718) Nhóm bệnh (n=103) Nhóm chứng (n=113) OR (95% CI) Giá trị p
AA 66 (64.08%) 71 (62.83%) 1.0 (Tham chiếu) -
AG 0 (0.00%) 39 (34.51%) - -
GG 37 (35.92%) 21 (18.58%) 2.46 (1.33 – 4.54) 0.0038

2. Biến thể rs280500 trên gen TYK2

Phân tích cho thấy kiểu gen AA chiếm ưu thế tuyệt đối ở cả hai nhóm (91.18% ở nhóm bệnh và 94.02% ở nhóm chứng). Kiểu gen dị hợp AG xuất hiện với tỷ lệ 8.82% ở bệnh nhân và 5.13% ở nhóm chứng ($OR = 1.77$, 95% CI: $0.61 - 5.17$, $p = 0.289$). Kiểu gen đột biến đồng hợp GG chỉ xuất hiện ở 1 mẫu nhóm chứng (0.85%) và không có ở nhóm bệnh ($p = 0.3194$). Sự khác biệt không đạt mức ý nghĩa thống kê.

Kiểu gen (TYK2 rs280500) Nhóm bệnh (n=102) Nhóm chứng (n=117) OR (95% CI) Giá trị p
AA 93 (91.18%) 110 (94.02%) 1.0 (Tham chiếu) -
AG 9 (8.82%) 6 (5.13%) 1.77 (0.61 – 5.17) 0.289
GG 0 (0.00%) 1 (0.85%) - 0.3194

3. Biến thể rs6443624 trên gen PIK3CA

Tần số các kiểu gen CC, CA và AA lần lượt là 75.29%, 20.00% và 4.71% ở nhóm bệnh nhân so với 70.09%, 25.23% và 4.67% ở nhóm đối chứng. Phân tích thống kê cho thấy biến thể dị hợp CA có $OR = 0.74$ (95% CI: $0.37 - 1.46$, $p = 0.384$) và biến thể đồng hợp AA có $OR = 0.94$ (95% CI: $0.24 - 3.63$, $p = 0.925$). Biến thể C>A của rs6443624 không liên quan đến nguy cơ mắc bệnh ET.

Kiểu gen (PIK3CA rs6443624) Nhóm bệnh (n=85) Nhóm chứng (n=107) OR (95% CI) Giá trị p
CC 64 (75.29%) 75 (70.09%) 1.0 (Tham chiếu) -
CA 17 (20.00%) 27 (25.23%) 0.74 (0.37 – 1.46) 0.384
AA 4 (4.71%) 5 (4.67%) 0.94 (0.24 – 3.63) 0.925

4. Biến thể rs1042522 trên gen TP53

Kiểu gen GC chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả hai nhóm (42.27% ở bệnh nhân và 43.75% ở nhóm chứng), tiếp theo là GG (30.93% so với 28.13%) và CC (26.80% so với 28.12%). Chỉ số OR đối với kiểu gen GC là 0.88 (95% CI: $0.47 - 1.63$, $p = 0.686$) và đối với kiểu gen CC là 0.87 (95% CI: $0.44 - 1.70$, $p = 0.678$). Biến thể G>C của rs1042522 không liên quan đến nguy cơ mắc bệnh ET.

Kiểu gen (TP53 rs1042522) Nhóm bệnh (n=97) Nhóm chứng (n=128) OR (95% CI) Giá trị p
GG 30 (30.93%) 36 (28.13%) 1.0 (Tham chiếu) -
GC 41 (42.27%) 56 (43.75%) 0.88 (0.47 – 1.63) 0.686
CC 26 (26.80%) 36 (28.12%) 0.87 (0.44 – 1.70) 0.678

Chương 5: Kết luận và kiến nghị (Chapter 5: Conclusion and Suggestion)

Tổng kết các phát hiện thực nghiệm, xác nhận biến thể rs2069718 trên gen IFNG là yếu tố liên quan đến tính nhạy cảm với bệnh tăng tiểu cầu tiên phát tại Việt Nam, đồng thời đưa ra kiến nghị mở rộng cỡ mẫu và đối tượng bệnh lý.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  • Xác định được sự phân bố tần số kiểu gen của 4 locus SNP ở bệnh nhân ET và người khỏe mạnh tại Việt Nam.
  • Phát hiện biến thể rs2069718 trên gen IFNG có liên quan có ý nghĩa thống kê với nguy cơ mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát: người mang kiểu gen GG có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 2.46 lần so với nhóm mang kiểu gen chuẩn ($OR = 2.46$, 95% CI: $1.33 - 4.54$, $p = 0.0038$).
  • Xác định 3 biến thể còn lại gồm rs280500 (TYK2), rs6443624 (PIK3CA) và rs1042522 (TP53) không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê với nguy cơ phát sinh bệnh tăng tiểu cầu tiên phát trong nhóm mẫu khảo sát ($p > 0.05$).
  • Tỷ lệ xác định chính xác kiểu gen bằng kỹ thuật KASP đạt 100%, được đối chiếu và khẳng định độ tin cậy bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger trực tiếp.

Đóng góp của đề tài

  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về tần số đa hình di truyền của các gen IFNG, TYK2, PIK3CA, TP53 trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát ở quần thể người Việt Nam.
  • Bổ sung chỉ dấu sinh học phân tử tiềm năng (biến thể rs2069718 gen IFNG) phục vụ nghiên cứu căn nguyên sinh bệnh học và hỗ trợ chẩn đoán nguy cơ bệnh lý tăng sinh tủy.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Số lượng mẫu khảo sát trong nghiên cứu còn ở quy mô giới hạn (106 mẫu bệnh nhân và 150 mẫu đối chứng; số mẫu phân tích thực tế cho từng gen từ 85 đến 128 mẫu), chưa phản ánh toàn diện phổ đa hình di truyền trên quy mô dân số lớn.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Cần mở rộng quy mô cỡ mẫu ở cả hai nhóm bệnh nhân và nhóm đối chứng để tái thẩm định chính xác vai trò của biến thể rs2069718; đồng thời mở rộng phạm vi khảo sát biến thể này trên các dạng ung thư và các hội chứng tăng sinh tủy ác tính khác ở người Việt Nam.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng: Tài liệu hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học y sinh, Huyết học - Truyền máu và Sinh học phân tử.
  • Giá trị phương pháp luận: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật định dạng kiểu gen bằng KASP đa kênh trên đĩa 384 giếng kết hợp kiểm chứng bằng giải trình tự Sanger, tối ưu hóa điều kiện luân nhiệt Touchdown PCR và phương pháp xử lý số liệu thống kê dịch tễ di truyền học (tính toán OR, 95% CI và $\chi^2$).

Câu hỏi thường gặp

1. Biến thể di truyền nào trong 4 gen khảo sát có mối liên quan có ý nghĩa thống kê với bệnh tăng tiểu cầu tiên phát?

Biến thể rs2069718 (chuyển đổi nucleotide A>G) trên vùng promoter của gen IFNG là biến thể duy nhất có mối liên hệ có ý nghĩa thống kê với nguy cơ mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát ($p = 0.0038$). Ba biến thể rs280500 (TYK2), rs6443624 (PIK3CA) và rs1042522 (TP53) không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm bệnh và nhóm chứng ($p > 0.05$).

2. Tần số kiểu gen và nguy cơ liên quan của biến thể IFNG rs2069718 được ghi nhận như thế nào?

Kiểu gen GG xuất hiện ở 35.92% bệnh nhân ET (37/103 mẫu) so với 18.58% ở người khỏe mạnh (21/113 mẫu). Cá thể mang kiểu gen GG có nguy cơ mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát cao hơn với tỷ số chênh $OR = 2.46$ (95% CI: $1.33 - 4.54$, $p = 0.0038$).

3. Điều kiện chu trình nhiệt của kỹ thuật KASP genotyping trong khóa luận được thiết lập ra sao?

Kỹ thuật KASP áp dụng nguyên lý Touchdown PCR gồm 2 giai đoạn:

  1. Giai đoạn 1: 10 chu kỳ Touchdown với nhiệt độ gắn mồi giảm dần từ 61°C xuống 55°C (mỗi chu kỳ giảm 0.6°C).
  2. Giai đoạn 2: 26 chu kỳ PCR hai bước tiêu chuẩn ở nhiệt độ gắn mồi 55°C. Toàn bộ đĩa phản ứng 384 giếng được làm mát và đọc tín hiệu huỳnh quang ở nhiệt độ dưới 40°C.

4. Kết quả phân tích kiểu gen của biến thể TP53 rs1042522 cho thấy điều gì?

Biến thể rs1042522 của gen TP53 có phân bố kiểu gen ở nhóm bệnh nhân gồm 30.93% GG, 42.27% GC và 26.80% CC; ở nhóm đối chứng gồm 28.13% GG, 43.75% GC và 28.12% CC. Phân tích thống kê cho thấy kiểu gen GC ($OR = 0.88$, $p = 0.686$) và CC ($OR = 0.87$, $p = 0.678$) không làm thay đổi nguy cơ mắc bệnh ET so với kiểu gen chuẩn GG.

5. Độ tin cậy của phương pháp định dạng kiểu gen KASP được kiểm chứng bằng cách nào?

Các mẫu sau khi định dạng kiểu gen bằng KASP (phân tách dựa trên cụm tín hiệu huỳnh quang FAM/HEX) được kiểm chứng độc lập bằng phương pháp khuếch đại PCR với cặp mồi đặc hiệu và giải trình tự Sanger trực tiếp trên máy ABI PRISM Genetic Analyzer. Tỷ lệ tương đồng kết quả giữa hai phương pháp đạt 100%.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã hoàn thành việc khảo sát và xác định tần số phân bố kiểu gen của 4 biến thể rs2069718 (IFNG), rs280500 (TYK2), rs6443624 (PIK3CA) và rs1042522 (TP53) trên nhóm bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát và nhóm đối chứng người Việt Nam bằng kỹ thuật KASP và giải trình tự Sanger. Kết quả chứng minh biến thể rs2069718 trên gen IFNG (kiểu gen GG) làm tăng nguy cơ mắc bệnh với $OR = 2.46$ ($p = 0.0038$), trong khi 3 biến thể còn lại không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê. Đề tài đóng góp cơ sở dữ liệu di truyền học phân tử quan trọng và đề xuất định hướng mở rộng nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn cũng như các dạng bệnh lý tăng sinh ác tính khác.