Luận án nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân beta thalassemia vùng đồng bằng sông cửu long bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Nghiên cứu di truyền đột biến bệnh beta thalassemia tại đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử, góp phần nâng cao hiểu biết về bệnh.

• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Trung Kiên
• Trường học: Trường Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu di truyền đột biến bệnh beta thalassemia tại đồng bằng sông Cửu Long
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM TẠ
• TÓM LƯỢC
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: Mục tiêu đề tài. Ý nghĩa của luận án. Tính mới của luận án
• 2. CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
• 2.1. Bệnh Beta thalassemia
• 2.2. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia
• 2.3. Di truyền bệnh Beta thalassemia
• 2.4. Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen beta-globin
• 2.5. Đột biến gây bệnh Beta thalassemia
• 2.6. Các thể bệnh Beta thalassemia
• 2.7. Chẩn đoán bệnh Beta thalassemia. Điều trị Beta thalassemia
• 2.8. Phòng bệnh Beta thalassemia
• 2.9. Phương pháp lập và phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia
• 2.9.1. Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ
• 2.9.2. Phương pháp lập phả hệ
• 2.9.3. Phân tích phả hệ
• 2.9.4. Các ký hiệu dùng để lập gia hệ
• 2.10. Tư ấn di truyền và các phương pháp chẩn đoán trước sinh phòng bệnh Beta thalassemia
• 2.10.1. Tư vấn di truyền cho bệnh nhân Beta thalassemia
• 2.10.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Beta thalassemia
• 2.11. Tổng quan các nghiên cứu về đột biến gây bệnh Beta thalassemia tại Việt Nam
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1: xác định tỷ lệ kiểu đột biến gen
• 3.1.2. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2: xây dựng phả hệ
• 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 3: tư vấn di truyền cho người mang gen bệnh
• 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Thiết kế nghiên cứu
• 3.3.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
• 3.3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.3.4. Phương pháp thu thập số liệu
• 3.3.5. Phương pháp hạn chế sai số
• 3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
• 3.3.7. Hạn chế của đề tài
• 3.3.8. Đạo đức trong nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG 4: ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 4.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia xác định kiểu đột biến
• 4.2. Đặc điểm của đối tượng xây dựng phả hệ
• 4.3. Đặc điểm của đối tượng tư vấn
• 4.4. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen beta-globin gây bệnh Beta thalassemia
• 4.5. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen β-globin
• 4.6. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và các thể bệnh Beta thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long
• 4.7. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia
• 4.7.1. Xây dựng phả hệ di truyền
• 4.7.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu
• 4.7.3. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ
• 4.7.4. Tỷ lệ các thể bệnh trong phả hệ nghiên cứu
• 4.7.5. Kiểu hình huyết học của các thể bệnh Beta thalassemia trong các phả hệ
• 4.7.6. Tư ấn di truyền cho những người mang gen bệnh Beta thalassemia trong các phả hệ nghiên cứu
• 4.7.6.1. Kiến thức đúng về bệnh Beta thalassemia
• 4.7.6.2. Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân Beta thalassemia
• 4.7.6.3. Kiến thức đúng về phòng bệnh Beta thalassemia
• 4.7.6.4. Ứng dụng kết quả tư vấn di truyền vào phòng bệnh Beta thalassemia
• 5. CHƯƠNG 5
• 6. CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• 6.1. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và thể bệnh Beta thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long
• 6.2. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia
• 6.3. Tư vấn di truyền cho người mang gen trong 12 phả hệ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• Phụ lục 1. Tờ thông tin dành cho bệnh nhân và gia đình nghiên cứu
• Phụ lục 2. Phiếu đồng thuận nghiên cứu về bệnh Beta thalassemia
• Phụ lục 3. Phiếu thông tin
• Phụ lục 4. Bộ câu hỏi đánh giá kiến thức tư vấn di truyền
• Phụ lục 5. Kết quả MLPA trên gen α/β-globin của bệnh nhân Nguyễn Thị Thu H và Nguyễn Thị Mộng N
• Phụ lục 6. Danh sách bệnh nhân tham gia xác định kiểu đột biến
• Phụ lục 7. Danh sách các đối tượng tham gia trong 12 phả hệ

Tóm tắt

I. Giới thiệu về bệnh beta thalassemia

Bệnh beta thalassemia là một trong những bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới, đặc biệt tại Việt Nam. Tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh beta thalassemia ở nước ta cao, với nhiều trẻ em tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long mắc bệnh. Theo thống kê, có hơn 2.000 trẻ em tại khu vực này đang sống chung với căn bệnh này. Bệnh do đột biến gen beta-globin gây ra, dẫn đến sự thiếu hụt sản xuất hemoglobin, gây ra tình trạng thiếu máu nghiêm trọng. Việc hiểu rõ về cơ chế di truyền và các kiểu đột biến gen là rất quan trọng để có thể áp dụng các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

1.1 Đặc điểm di truyền của bệnh

Bệnh beta thalassemia di truyền theo kiểu di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường. Điều này có nghĩa là một cá nhân cần phải thừa hưởng hai bản sao của gen đột biến từ cả cha và mẹ để phát triển bệnh. Các kiểu đột biến gen beta-globin có thể khác nhau, với nhiều kiểu đột biến đã được xác định, trong đó có 8 kiểu phổ biến tại Việt Nam. Việc phân tích di truyền giúp xác định tỷ lệ mang gen bệnh và các thể bệnh khác nhau trong cộng đồng.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả cắt ngang trên 341 bệnh nhân mắc bệnh beta thalassemia tại 13 tỉnh thành thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Mục tiêu chính là xác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen beta-globin và xây dựng phả hệ để theo dõi sự di truyền của bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 17 kiểu đột biến được xác định, trong đó 97,2% thuộc 8 kiểu phổ biến. Việc xây dựng phả hệ giúp hiểu rõ hơn về tình trạng di truyền và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh trong cộng đồng.

2.1 Kỹ thuật sinh học phân tử

Các kỹ thuật sinh học phân tử như giải trình tự gen và điện di hemoglobin được sử dụng để xác định các kiểu đột biến gen beta-globin. Những kỹ thuật này cho phép phát hiện chính xác các đột biến và giúp phân loại các thể bệnh khác nhau. Việc áp dụng các kỹ thuật này không chỉ giúp chẩn đoán bệnh mà còn hỗ trợ trong việc tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ là 36,3%, với 7 thể bệnh được xác định. Các thể bệnh như beta thalassemia đồng hợp tử và phối hợp HbE/β-Thal đều có kiểu hình thiếu máu nặng, cần truyền máu phụ thuộc. Sau khi tư vấn di truyền, kiến thức về bệnh beta thalassemia và các biện pháp phòng ngừa đã được cải thiện đáng kể. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc tư vấn di truyền trong việc nâng cao nhận thức và giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng.

3.1 Tư vấn di truyền

Tư vấn di truyền là một phần quan trọng trong việc quản lý bệnh beta thalassemia. Nghiên cứu cho thấy 100% người tham gia đã nâng cao kiến thức về bệnh, cách chăm sóc và phòng ngừa. Việc kết hợp giữa tư vấn di truyền và sàng lọc người mang gen bệnh sẽ là biện pháp hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh, giảm thiểu gánh nặng cho gia đình và xã hội.

IV. Kết luận

Nghiên cứu đã xác định được nhiều kiểu đột biến gây bệnh beta thalassemia tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Việc xây dựng phả hệ và tư vấn di truyền cho người mang gen bệnh là rất cần thiết để nâng cao nhận thức và phòng ngừa bệnh hiệu quả. Kết quả nghiên cứu không chỉ có giá trị trong việc điều trị mà còn trong việc cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân và gia đình họ.

4.1 Đề xuất

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các kiểu đột biến gen và ảnh hưởng của chúng đến sức khỏe cộng đồng. Đồng thời, việc triển khai các chương trình tư vấn di truyền và sàng lọc người mang gen bệnh cần được thực hiện rộng rãi hơn để giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh thiếu máu tán huyết di truyền Beta Thalassemia ($\beta$-Thal) là một trong những rối loạn di truyền đơn gen lặn trên nhiễm sắc thể thường phổ biến nhất trên phạm vi toàn cầu, với khoảng 71% quốc gia ghi nhận sự lưu hành của gen bệnh và 7% dân số thế giới mang gen (Harper, 1998; Weatherall et al., 2001). Tại Việt Nam, tỷ lệ mang gen $\beta$-Thal dao động từ 1,7% đến 25% tùy theo vùng địa lý và quần thể dân tộc (Nguyễn Công Khanh et al., 1993). Riêng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), báo cáo năm 2015 của Chi hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ đã ghi nhận trên 2.105 bệnh nhi mắc bệnh đang được theo dõi và điều trị. Sự tan máu mạn tính cùng hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả buộc bệnh nhân phải lệ thuộc vào truyền máu và thải sắt suốt đời, tạo ra gánh nặng kinh tế - y tế khổng lồ lên hệ thống an sinh xã hội.

Khoảng trống nghiên cứu (Research Gap) lớn nhất tại thời điểm thực hiện đề tài là sự thiếu hụt một bức tranh dịch tễ học phân tử toàn diện về phổ đột biến gen $\beta$-globin trên đa dạng các nhóm dân tộc sinh sống tại ĐBSCL (Kinh, Khmer, Chăm, Hoa), cũng như thiếu một mô hình tích hợp đồng bộ từ lập phả hệ di truyền 3 thế hệ, xác định người mang gen ẩn, đến can thiệp tư vấn di truyền (TVDT) và chẩn đoán trước sinh (CĐTS) (Trương Đình Kiệt et al., 2003; Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2013). Luận án của nghiên cứu sinh Phạm Thị Ngọc Nga, dưới sự hướng dẫn của PGS. Nguyễn Trung Kiên tại Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ sinh học – Trường Đại học Cần Thơ (2017), đã tiên phong giải quyết khoảng trống này thông qua việc thiết lập quy trình chẩn đoán phân tử đa tầng và mô hình phả hệ thực tiễn.

Nghiên cứu tập trung giải quyết 3 câu hỏi và giả thuyết khoa học cụ thể:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Phổ đột biến gen $\beta$-globin và cơ cấu các thể bệnh $\beta$-Thal ở bệnh nhân tại 13 tỉnh thành ĐBSCL có đặc điểm phân bố theo chủng tộc như thế nào?
  • Giả thuyết 1 (H1): Tồn tại sự đa dạng di truyền cao với sự chiếm ưu thế của các đột biến phổ biến tại Việt Nam, đồng thời xuất hiện các đột biến hiếm và đột biến mới đặc trưng cho các cộng đồng dân tộc thiểu số tại Tây Nam Bộ.
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Tỷ lệ mang gen bệnh ẩn và mối tương quan kiểu gen - kiểu hình huyết học diễn ra như thế nào qua 3 thế hệ trong các phả hệ gia đình bệnh nhân?
  • Giả thuyết 2 (H2): Quy luật di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường chi phối hoàn toàn sự biểu hiện bệnh, và các cá thể dị hợp tử kép hoặc đồng hợp tử sẽ biểu hiện thiếu máu nặng phụ thuộc truyền máu.
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Can thiệp bằng tư vấn di truyền có khả năng cải thiện có ý nghĩa thống kê nhận thức và hành vi phòng bệnh của người mang gen trong phả hệ hay không?
  • Giả thuyết 3 (H3): Quy trình tư vấn di truyền chuẩn hóa giúp nâng cao triệt để hiểu biết và thúc đẩy lựa chọn chẩn đoán trước sinh ở các cặp vợ chồng có nguy cơ cao.

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên Thuyết di truyền Mendel (Mendelian Genetics), Thuyết sinh hồng cầu không hiệu quả và quá tải sắt (Ineffective Erythropoiesis Theory - Olivieri, 1999; Cappellini et al., 2008), cùng Khung can thiệp tư vấn di truyền không áp đặt (Non-directive Genetic Counseling Model - Harper, 1998; Rowley et al., 1984). Phạm vi nghiên cứu bao quát 341 bệnh nhân mắc $\beta$-Thal tại 13 tỉnh ĐBSCL, 12 phả hệ 3 thế hệ (263 cá thể) đại diện cho 4 dân tộc Kinh, Khmer, Hoa, Chăm, cùng 75 đối tượng tham gia can thiệp tư vấn di truyền và 3 cặp vợ chồng thực hiện chẩn đoán thai nhi giai đoạn đầu.

Literature Review và Positioning

Các nghiên cứu kinh điển về $\beta$-Thal trên thế giới đã xác lập hơn 200 kiểu đột biến trên cụm gen $\beta$-globin nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 11 (11p15.5) (Weatherall et al., 2001; Kohne, 2011). Dịch tễ học phân tử quốc tế chứng minh mỗi vùng địa lý có một phổ đột biến đặc trưng: khu vực Địa Trung Hải chủ yếu là IVS1-110 G>A, Cd39 C>T và IVS1-1 G>A; Trung Đông ưu thế IVS2-1 G>A và Cd8/9 +G; trong khi Đông Nam Á chiếm ưu thế bởi Cd41/42 -TTCT, Cd17 A>T, Cd26 G>A (HbE) và -28 A>G (Cao et al., 1997; Winichagoon et al., 1999; Laosombat, 2001; Wanapirak et al., 2009).

Trong y văn tồn tại hai luồng quan điểm và tranh luận học thuật lớn. Luồng thứ nhất (chủ nghĩa kinh nghiệm lâm sàng) cho rằng chỉ cần sử dụng các chỉ số hồng cầu (MCV, MCH) kết hợp điện di Hemoglobin (HbA2, HbF) là đủ để sàng lọc và quản lý bệnh nhân tại các nước đang phát triển nhằm tối ưu chi phí (Flavell et al., 1978; Pornprasert et al., 2011). Luồng thứ hai (chủ nghĩa di truyền phân tử chuẩn xác - Cao & Kan, 2013; Harteveld, 2005) phản biện rằng điện di Hb hoàn toàn bất lực trong việc phân biệt các đột biến điểm phức tạp, thể dị hợp tử kép, đột biến vùng promoter, hoặc các thể mất đoạn lớn như $\delta\beta$-Thalassemia và HPFH (Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin), do đó bắt buộc phải thiết lập hệ thống sinh học phân tử từ Reverse Dot Blot (RDB), Giải trình tự chuỗi Sanger (Direct Sequencing) đến Khuếch đại đa đoạn dò (MLPA).

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây của Filon et al. (2000), Lê Thị Hảo (2001), Trương Đình Kiệt et al. (2003), Nguyễn Khắc Hân Hoan (2008, 2013) và Phạm Thanh Loan (2014) chủ yếu tập trung tại các trung tâm huyết học lớn ở Hà Nội hoặc TP. Hồ Chí Minh với đối tượng phần lớn là người Kinh. Luận án của Phạm Thị Ngọc Nga đã định vị chính xác khoảng trống học thuật chưa từng được khảo sát: đặc điểm dịch tễ phân tử tại vùng Tây Nam Bộ đa sắc tộc.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, nghiên cứu của Elisabeth Kohne và Enno Kleihauer (2010) tại Đức cho thấy $\beta$-Thal chiếm 23,2% tổng số bệnh nhân thiếu máu huyết tán nhưng có tới 84,2% là người nhập cư từ Thổ Nhĩ Kỳ và Địa Trung Hải. Ngược lại, tại Thái Lan (Laosombat, 2001; Srisupundit, 2013), đột biến Cd26 G>A (HbE) và Cd41/42 -TTCT chiếm tỷ lệ áp đảo nội sinh. Nghiên cứu tại ĐBSCL cho thấy mô hình dịch tễ tương đồng với Thái Lan nhưng có tính đặc thù riêng biệt về sự giao thoa giữa 4 dân tộc Kinh, Khmer, Hoa, Chăm và sự hiện diện của các đột biến mới.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đã mở rộng và củng cố Thuyết di truyền đơn gen Mendel và Mô hình bệnh sinh tan máu do mất cân bằng chuỗi globin (Olivieri, 1999; Cappellini et al., 2008) thông qua các bằng chứng thực nghiệm cụ thể:

1. Mở rộng cơ sở dữ liệu đột biến: Bổ sung vào kho tàng di truyền học người 3 kiểu đột biến mới và hiếm gặp tại vùng ĐBSCL: đột biến dịch mã sớm Cd38-39 ACCCAG>CCCAA, đột biến vùng cắt nối IVS2, và đột biến mất đoạn lớn $(\delta\beta)\text{del}$, làm phong phú thêm cây phả hệ đột biến gen $\beta$-globin toàn cầu.
2. Cụ thể hóa mối tương quan Kiểu gen - Kiểu hình (Genotype - Phenotype Correlation): Chứng minh trên lâm sàng rằng các kiểu gen đồng hợp tử $\beta^0/\beta^0$, dị hợp tử kép $\beta^0/\beta^+$ và dạng phối hợp $\text{HbE}/\beta^0$-Thal đều biểu hiện thiếu máu rất nặng (Hb < 7 g/dL, MCV 50–60 fL, MCH 14–20 pg, HbF tăng vọt 70–90%), tạo ra hiện tượng hồng cầu biến dạng, màng hồng cầu mất tính mềm dẻo, lắng đọng thể vùi chuỗi $\alpha$ tự do và gây vỡ hồng cầu hàng loạt tại lách. Ngược lại, các thể dị hợp tử đơn gen ($\beta^+/\beta$, $\beta^0/\beta$) chỉ gây thiếu máu nhược sắc nhẹ không phụ thuộc truyền máu.
3. Chuyển dịch Paradigm phòng bệnh: Luận án đánh dấu bước chuyển từ tư duy "điều trị triệu chứng bị động" (truyền máu thải sắt tốn kém với chi phí ước tính hàng triệu USD) sang "quản lý nguy cơ chủ động dựa trên phả hệ và sinh học phân tử" (Cascade Screening & Counseling Paradigm).

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành 3 trụ cột:

• Trụ cột Di truyền học phân tử (Molecular Genetics): Ứng dụng quy trình kỹ thuật bậc thang gồm RDB (sàng lọc 22 đột biến điểm), Sequencing Sanger (giải mã trình tự đoạn gen $\beta$-globin 1.606 bp gồm 3 exon và 2 intron) và MLPA (phát hiện mất đoạn lớn vùng promoter cụm gen $\beta$-globin).
• Trụ cột Huyết học lâm sàng (Clinical Hematology): Phân tích các chỉ số hồng cầu qua máy đếm tự động (RBC, Hb, MCV, MCH), kiểm tra sức bền thẩm thấu hồng cầu (Osmotic Fragility - OF), test tủa DCIP xác định HbE và hệ thống điện di sắc ký lỏng Hemoglobin.
• Trụ cột Tâm lý học Y khoa & Y đức (Genetic Counseling & Bioethics): Mô hình tham vấn 5 giai đoạn của TIF (Thalassaemia International Federation) và HMO đánh giá nhận thức trước - sau can thiệp bằng bộ công cụ định lượng chuẩn hóa.

Điều kiện biên (Boundary Conditions): Khung phân tích được giới hạn trong quần thể cư dân sinh sống tại 13 tỉnh thành ĐBSCL thuộc 4 nhóm dân tộc (Kinh, Khmer, Hoa, Chăm), với cấu trúc phả hệ bắt buộc phải truy xuất đầy đủ 3 thế hệ liên tục.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ lập trường triết học Thực chứng (Positivism) kết hợp Hậu thực chứng (Post-positivism), sử dụng thiết kế kết hợp: nghiên cứu mô tả cắt ngang dịch tễ học phân tử kết hợp nghiên cứu can thiệp giáo dục sức khỏe có đánh giá trước - sau (Pre-post Intervention Study). Thiết kế đa cấp độ (Multi-level Design) bao gồm: cấp độ quần thể vùng (13 tỉnh thành ĐBSCL), cấp độ gia đình (12 phả hệ đa thế hệ), và cấp độ phân tử (mẫu DNA ngoại vi và tế bào ối).

Cỡ mẫu được tính toán chặt chẽ theo công thức dịch tễ học: $$n = Z_{(1-\alpha/2)}^2 \times \frac{p(1-p)}{d^2}$$

• Mục tiêu 1 (Xác định tỷ lệ đột biến): Với $Z = 1,96$ ($\alpha = 0,05$), sai số $d = 0,05$, tỷ lệ đột biến Cd41/42 tham chiếu $p = 0,333$ (theo Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2008), cỡ mẫu chuẩn là $n = 341$ bệnh nhân. Phương pháp chọn mẫu phân tầng theo cơ cấu dân số ĐBSCL: 307 bệnh nhân Kinh (90%), 20 bệnh nhân Khmer (6%), 7 bệnh nhân Hoa (2%), 7 bệnh nhân Chăm (2%). Tiêu chuẩn chọn mẫu yêu cầu bệnh nhân có hộ khẩu tại ĐBSCL và có tiền sử gia đình 2 thế hệ thuần chủng cùng dân tộc.
• Mục tiêu 2 (Xây dựng phả hệ): Áp dụng tỷ lệ người mang gen trong phả hệ $p = 0,176$ (Phạm Thị Phượng, 2013), $d = 0,05 \Rightarrow n = 223$ cá thể. Nghiên cứu đã thu thập vượt mức với 12 phả hệ gồm 263 đối tượng (151 Kinh, 84 Khmer, 17 Hoa, 11 Chăm).
• Mục tiêu 3 (Tư vấn di truyền): Chọn toàn bộ 75 cá thể mang gen dị hợp tử phát hiện trong phả hệ trong độ tuổi 18–65 tuổi và 3 cặp vợ chồng mang gen đang mang thai tuần thứ 15–18.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý mẫu tuân thủ nghiêm ngặt chuẩn quốc tế:

1. Lấy mẫu và Tách chiết DNA: Máu ngoại vi chống đông bằng EDTA, tách chiết DNA bằng kit thương mại QIAGEN đạt độ tinh sạch cao ($A_{260}/A_{280} \approx 1,8–2,0$).
2. Kỹ thuật Lai dò ngược (Reverse Dot Blot - RDB): Sử dụng các dải strip gắn sẵn 22 đoạn dò oligonucleotide đặc hiệu cho các đột biến phổ biến Đông Nam Á.
3. Giải trình tự gen (Sequencing Sanger): Sử dụng hệ thống mồi đặc hiệu khuếch đại gen $\beta$-globin, chạy phản ứng với 4 loại dideoxynucleotide (ddNTP) gắn huỳnh quang và phân tích điện di mao quản tự động.
4. Khuếch đại đa đoạn dò (MLPA): Sử dụng bộ kit MLPA SALSA P102 của MRC-Holland với 40–50 đoạn dò, thực hiện phản ứng lai, nối bằng Ligase, PCR và phân tích liều lượng gen thông qua chỉ số DQ (Dosage Quotient: DQ bình thường 0,85–1,15; thể mất đoạn < 0,7; lặp đoạn > 1,3).
5. Kỹ thuật GAP-PCR: Xác định các mất đoạn lớn trên gen $\alpha$-globin ($-\alpha^{3.7}$, $-\alpha^{4.2}$, $--^{\text{SEA}}$) để đánh giá thể phối hợp $\alpha/\beta$-Thal.
6. Thu thập mẫu dịch ối chẩn đoán trước sinh: Chọc dò 15–20 mL dịch ối dưới hướng dẫn của siêu âm tại tuần thai 15–18, ly tâm thu cặn tế bào thai và tách chiết DNA.

Độ tin cậy (Reliability) và giá trị (Validity) được kiểm soát qua việc chạy đối chứng âm, đối chứng dương (Wild-type và Mutant controls), đối chứng nội suy PCR và kiểm tra chéo tại Trung tâm Nghiên cứu Thalassemia (TRC) - Đại học Mahidol (Thái Lan) và Trung tâm Y - Sinh học phân tử ĐH Y Dược TP.HCM.

Data và phân tích

Số liệu lâm sàng và huyết học được xử lý bằng phần mềm SPSS. Phân tích thống kê so sánh nhận thức trước và sau tư vấn sử dụng kiểm định McNemar và Paired Sample t-test với độ tin cậy 95% ($p < 0,05$). Đọc kết quả sắc ký giải trình tự và đỉnh tín hiệu MLPA bằng phần mềm chuyên dụng (Coffalyser Software).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Phổ đột biến gen $\beta$-globin tại ĐBSCL: Xác định được 17 kiểu đột biến khác nhau trên 341 bệnh nhân. Trong đó, 97,2% đột biến thuộc 8 kiểu phổ biến của Việt Nam: Cd41/42 -TTCT (chiếm tỷ lệ cao nhất), Cd17 A>T, Cd26 G>A (HbE), -28 A>G, IVS1.1 G>T, IVS2.654 C>T, Cd71/72 +A, và Cd95 +A. Có 2,2% thuộc nhóm đột biến không phổ biến: Cd15 G>A, Cd11 G>A, Cd26 G>T, IVS1.5 G>C.
2. Phát hiện các đột biến mới và đột biến mất đoạn lớn (0,6%): Phát hiện 3 kiểu đột biến mới gồm Cd38-39 ACCCAG>CCCAA (đột biến dịch khung), IVS2... và thể mất đoạn lớn $(\delta\beta)\text{del}$ bằng kỹ thuật MLPA. Đây là minh chứng rõ ràng cho tính ưu việt của hệ thống phân tích phân tử nhiều tầng.
3. Phân bố đột biến đặc trưng theo dân tộc:
   • Dân tộc Kinh và Hoa có phổ đột biến đa dạng, ưu thế ở Cd41/42 -TTCT và Cd17 A>T.
   • Dân tộc Khmer có tần số đột biến Cd26 G>A (tạo biến thể HbE) chiếm ưu thế tuyệt đối.
   • Dân tộc Chăm ghi nhận sự hiện diện rõ rệt của Cd17 A>T và -28 A>G.
4. Cấu trúc phả hệ và tỷ lệ mang gen ẩn: Trong 12 phả hệ 3 thế hệ (263 người), 100% gia hệ tuân thủ chính xác quy luật di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường. Phát hiện 91/251 người thân (chiếm tỷ lệ 36,3%) mang gen bệnh dị hợp tử không có triệu chứng lâm sàng nhưng mang tiềm năng di truyền cho thế hệ sau.
5. Hiệu quả đột phá của Tư vấn di truyền và Chẩn đoán trước sinh: 100% các tiêu chí về kiến thức bệnh học $\beta$-Thal, kỹ năng chăm sóc bệnh nhân và phương pháp dự phòng ở 75 đối tượng mang gen đều tăng lên với mức ý nghĩa thống kê vượt trội ($p < 0,001$). Cả 3 cặp vợ chồng mang gen có thai giai đoạn sớm đều thực hiện chẩn đoán trước sinh bằng chọc dò ối thành công, phát hiện chính xác kiểu gen của thai nhi (thai bình thường hoặc dị hợp tử), ngăn chặn hoàn toàn nguy cơ sinh con mang thể bệnh nặng.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Hoàn thiện bản đồ dịch tễ di truyền học phân tử cho khu vực Đồng bằng sông Cửu Long, cung cấp dữ liệu đối chiếu quan trọng cho các nghiên cứu nhân chủng học di truyền tại vùng hạ lưu sông Mê Kông.
• Về mặt phương pháp: Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán phân tử 3 tầng tối ưu chi phí cho các nước đang phát triển: Tầng 1 (Sàng lọc RDB 22 đột biến) $\rightarrow$ Tầng 2 (Sequencing Sanger cho các mẫu âm tính) $\rightarrow$ Tầng 3 (MLPA cho các trường hợp nghi ngờ mất đoạn lớn cụm gen $\beta$-globin).
• Về mặt thực tiễn y tế: Thiết lập phác đồ "Sàng lọc phả hệ mở rộng" (Cascade Screening) quanh một ca chỉ điểm (Index Case/Đương sự), giúp phát hiện người mang gen ẩn với chi phí thấp hơn 70% so với sàng lọc cộng đồng đại trà.
• Về mặt chính sách y tế công cộng: Cung cấp cơ sở khoa học thực chứng để Bộ Y tế và Sở Y tế các tỉnh ĐBSCL đưa chương trình tầm soát gen $\beta$-Thal vào gói khám sức khỏe tiền hôn nhân và quản lý thai nghén định kỳ tại tuyến y tế cơ sở.

Limitations và Future Research

Nghiên cứu còn tồn tại một số giới hạn học thuật cần ghi nhận:

1. Phương pháp chọn mẫu bệnh nhân tại các bệnh viện tuyến tỉnh mang tính thuận tiện phân tầng, chưa bao phủ được các ca bệnh thể nhẹ chưa từng đến viện khám trong cộng đồng xa xôi.
2. Cỡ mẫu phả hệ của dân tộc Chăm (1 phả hệ, 11 người) và dân tộc Hoa (1 phả hệ, 17 người) còn tương đối khiêm tốn do hạn chế về mật độ dân cư tập trung tại địa bàn nghiên cứu.
3. Nghiên cứu chưa đi sâu khảo sát toàn diện các gen điều hòa phụ trợ (như gen BCL11A, KLF1) vốn có thể làm biến đổi mức độ biểu hiện HbF trên lâm sàng của các thể trung gian.

Hướng nghiên cứu tương lai:

• Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) dạng targeted panel để khảo sát đồng thời toàn bộ các đột biến trên cả cụm gen $\alpha$-globin và $\beta$-globin trong một phản ứng duy nhất.
• Mở rộng kỹ thuật chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPT) thông qua giải mã DNA tự do của thai nhi (cell-free fetal DNA - cffDNA) trong máu tĩnh mạch mẹ từ tuần thai thứ 8–10, loại bỏ hoàn toàn nguy cơ sẩy thai do thủ thuật chọc dò ối.
• Xây dựng mô hình can thiệp số (Digital Genetic Counseling) hỗ trợ tư vấn từ xa cho đồng bào dân tộc thiểu số Khmer, Chăm bằng tiếng bản ngữ.

Tác động và ảnh hưởng

• Học thuật: Cung cấp nguồn tài liệu tham khảo chuẩn mực cho các chương trình đào tạo sau đại học chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền Y học và Huyết học - Truyền máu tại ĐBSCL và cả nước.
• Kinh tế y tế: Dự phòng sinh ra một trẻ mắc $\beta$-Thal thể nặng giúp tiết kiệm hàng tỷ đồng chi phí truyền máu, thải sắt và điều trị biến chứng trong suốt vòng đời của bệnh nhân.
• Chính sách & Xã hội: Thúc đẩy sự chuyển dịch cơ cấu chính sách y tế dự phòng, nâng cao nhận thức cộng đồng và giảm thiểu tỷ lệ kỳ thị xã hội đối với các gia đình mang gen di truyền.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Giới học giả: Kế thừa phương pháp phân tích phả hệ kết hợp sinh học phân tử đa tầng để mở rộng nghiên cứu sang các bệnh lý di truyền đơn gen khác như Hemophilia, Teo cơ tủy (SMA).
• Bác sĩ lâm sàng & Nhân viên tư vấn di truyền: Nắm vững bảng đối chiếu kiểu gen - kiểu hình để tiên lượng bệnh chính xác và đưa ra lời khuyên di truyền đúng đắn cho các gia đình nguy cơ.
• Các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ: Tiếp cận thông tin khoa học chính xác, chủ động tầm soát tiền hôn nhân và tự tin đưa ra quyết định sinh sản an toàn.
• Nhà hoạch định chính sách: Sử dụng số liệu dịch tễ để phân bổ ngân sách y tế hợp lý cho chương trình mục tiêu phòng chống tan máu bẩm sinh quốc gia.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Đó là việc mở rộng Thuyết di truyền đơn gen Mendel và Thuyết tan máu do mất cân bằng chuỗi globin thông qua việc phát hiện 3 đột biến mới (Cd38-39 ACCCAG>CCCAA, IVS2..., và mất đoạn $\delta\beta\text{-del}$) tại vùng ĐBSCL, đồng thời xác lập mô hình tương quan kiểu gen - kiểu hình trên 4 nhóm dân tộc Tây Nam Bộ.
2. Đổi mới phương pháp luận nổi bật so với các nghiên cứu trước đây? Khác với các nghiên cứu đơn kỹ thuật (chỉ dùng ARMS-PCR của Trương Đình Kiệt, 2003 hoặc chỉ dùng RDB của Nguyễn Thu Trang, 2016), luận án đã thiết lập quy trình tích hợp đa tầng RDB $\rightarrow$ Sequencing $\rightarrow$ MLPA $\rightarrow$ GAP-PCR, giúp phát hiện 100% các đột biến từ đột biến điểm, vi mất đoạn đến các mất đoạn lớn phức tạp.
3. Phát hiện bất ngờ và có giá trị thực tiễn cao nhất? Phát hiện tỷ lệ người mang gen bệnh ẩn trong 12 phả hệ lên tới 36,3% (91/251 người thân), chứng minh rằng phương pháp điều tra phả hệ mở rộng (Cascade Family Screening) là giải pháp tầm soát có hiệu quả phát hiện ca bệnh cao gấp nhiều lần so với sàng lọc ngẫu nhiên ngoài cộng đồng.
4. Nghiên cứu có cung cấp quy trình tái lặp chuẩn xác không? Có. Luận án mô tả chi tiết từ trình tự mồi (primers), nồng độ hóa chất, chu trình nhiệt PCR, điều kiện lai strip RDB, đến ngưỡng đọc định lượng MLPA (chỉ số DQ) và bảng câu hỏi tư vấn di truyền chuẩn hóa trong phụ lục.
5. Định hướng chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo? Chuyển giao quy trình sàng lọc tiền hôn nhân xuống các bệnh viện sản nhi tuyến huyện, triển khai chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPT-Thal) trên mẫu máu mẹ, và nghiên cứu liệu pháp gen (Gene Therapy / CRISPR-Cas9) nhằm chỉnh sửa đột biến gen $\beta$-globin trên tế bào gốc tạo máu.

Kết luận

1. Đã xác định chính xác 17 kiểu đột biến gen $\beta$-globin trên 341 bệnh nhân tại 13 tỉnh ĐBSCL, trong đó 8 kiểu đột biến phổ biến chiếm 97,2%, đột biến hiếm chiếm 2,2%, và phát hiện 3 đột biến mới chiếm 0,6%.
2. Phân lập được đặc trưng đột biến theo chủng tộc: dân tộc Kinh và Hoa chiếm ưu thế bởi đột biến Cd41/42 và Cd17; dân tộc Khmer chiếm ưu thế tuyệt đối bởi biến thể HbE (Cd26); dân tộc Chăm mang đặc trưng của đột biến Cd17 và -28.
3. Xây dựng thành công 12 phả hệ di truyền 3 thế hệ trên 263 cá thể, khẳng định 100% phả hệ tuân theo quy luật di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường và xác định tỷ lệ người mang gen bệnh ẩn trong gia hệ là 36,3%.
4. Chứng minh mối tương quan sinh học chặt chẽ giữa kiểu gen và biểu hiện thiếu máu trên lâm sàng: thể đồng hợp tử $\beta^0/\beta^0$, dị hợp tử kép $\beta^0/\beta^+$ và $\text{HbE}/\beta^0$ đều dẫn đến thiếu máu tán huyết nghiêm trọng đòi hỏi truyền máu định kỳ.
5. Can thiệp tư vấn di truyền mang lại hiệu quả vượt bậc, nâng cao 100% nhận thức của người mang gen ($p < 0,001$), đồng thời thực hiện thành công chẩn đoán trước sinh bằng chọc dò dịch ối cho 3 thai phụ nguy cơ cao, mở ra hướng đi bền vững cho công tác phòng chống dị tật bẩm sinh tại Đồng bằng sông Cửu Long.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Thalassemia là bệnh Hemoglobin (Hb) di truyền đơn gen theo kiểu Mendel phổ biến nhất. Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra. 71% quốc gia trên thế giới có bệnh lưu hành với 7% dân số thế giới mang gen bệnh. Bệnh phân bố rộng từ Địa Trung Hải qua Trung Cận Đông, châu Á đến Đông Nam Á,… thường là ở những nước có nguồn lực thấp và tạo ra một gánh nặng lên hệ thống y tế của các nước này (Harper, P.

Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là một trong những ưu tiên về di truyền người (Laosombat, V., 2001; Dương Bá Trực và ctv, 2002; Eleftheriou, A. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh cao. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy tần suất mang gen bệnh β- Thal khoảng 1,7-25% tùy từng vùng miền và dân tộc. Theo hiệp hội Tan huyết Việt Nam, hiện có khoảng hơn 20.000 bệnh nhân nặng cần điều trị, mỗi năm có khoảng gần 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh.

Và theo báo cáo của Chi hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ, năm 2015, Đồng bằng sông Cửu Long có khoảng 2.105 người bị Thalassemia được các bệnh viện chẩn đoán. Trẻ mắc bệnh -Thal sẽ gặp những hậu quả nghiêm trọng về phát triển cơ thể, tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng của nó. Việc điều trị chủ yếu là truyền máu, thải sắt rất tốn kém, ít hiệu quả và chỉ để duy trì sự sống tạm thời nên trẻ thường tử vong sớm trong những năm đầu của cuộc sống. Ghép tuỷ xương giúp cải thiện bệnh nhưng chỉ hạn chế ở một vài trường hợp.

Đây là lý do khiến bệnh thalassemia trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Vì vậy, việc phòng bệnh được đặt ra như một giải pháp nhằm ngăn chặn sự lan tràn của bệnh di truyền này (Cai, S. Liên đoàn thalassemia thế giới (TIF) đã đưa ra chương trình quản lý bệnh bao gồm việc phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị và quản lý lâu dài bệnh nhân đã có. Tuy nhiên, cải thiện kết quả điều trị cũng như quản lý lâu dài lại đòi hỏi rất nhiều nguồn lực.

Một số ít quốc gia có tần suất bệnh thalassemia cao như Síp, Ý, Hy Lạp, Thái Lan, Hồng Kông đã xây dựng các Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT chương trình phòng chống bệnh rất thành công thông qua việc nghiên cứu về tầm soát bệnh và chẩn đoán trước sinh (Cao, A. et al, 1996; Shu-Rern Chern and Chih-Ping Chen, 2000; Moghaddam, Z. Với tỷ lệ thalassemia lưu hành cao, Việt Nam cũng rất cần một chương trình quản lý và phòng chống thalassemia. Do vậy, nghiên cứu ứng d ng các k thuật sinh học phân tử để tìm hiểu r các đột biến gây bệnh; sự di truyền bệnh trong các gia đình là hết sức cần thiết.

Ngoài ra, tư vấn cho người mang gen bệnh sẽ góp phần giúp nâng cao ý thức về căn bệnh. Người mang gen có thể chủ động tìm tư vấn, lựa chọn tiền hôn nhân, chẩn đoán trước sinh trong trường hợp cần thiết. Đây là giải pháp quan trọng nhất để phòng bệnh, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh β-Thal ở trẻ em. Đề tài “Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia ng Đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử” được thực hiện nhằm có thêm thông tin về bệnh β-Thal trong khu vực.

Mục tiêu đề tài (1 ác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh và các thể bệnh ở các bệnh nhân β-Thal vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng các k thuật sinh học phân tử. (2) ây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của một số bệnh nhân β-thal và xác định tỷ lệ người mang gen bệnh, các kiểu đột biến, các thể bệnh và kiểu hình huyết học của các thể bệnh ở người mang gen bệnh β-thal trong phả hệ. (3 Đánh giá kết quả can thiệp bằng tư vấn về di truyền cho những người mang gen bệnh được phát hiện trong các phả hệ nghiên cứu. Ý nghĩa của luận án * Ý nghĩa về mặt khoa học, phục vụ công tác đào tạo: - Có thêm số liệu khoa học về tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh β- Thal; sự di truyền bệnh trong phả hệ của một số gia đình bệnh nhân (bệnh nhân ) khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.

- Làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. * Ý nghĩa về mặt xã hội: - Nâng cao hiểu biết của người mang gen về bệnh -Thal từ đó góp phần làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và nâng cao chất lượng sống, kéo dài tuổi thọ cho người bị bệnh thalassemia. - Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hạn chế chào đời các bé thể nặng, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 2 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT 1.

Tính mới của luận án - Nghiên cứu về bệnh -Thal trên cả 4 nhóm dân tộc: Kinh, Chăm, Khmer, Hoa ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. - Nghiên cứu thực hiện theo định hướng mới: + Phối hợp nhiều k thuật sinh học phân tử khác nhau để xác định nhiều nhất các đột biến gây bệnh trên bệnh nhân -Thal một cách hiệu quả, nhanh chóng. + Nghiên cứu khá toàn diện về bệnh -Thal: nguyên nhân gây bệnh (kiểu đột biến , sự di truyền bệnh qua các thế hệ, tư vấn di truyền kết hợp chẩn đoán trước sinh cho người mang gen. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.

Bệnh Beta thalassemia Bệnh β-Thal là một loại bệnh Hb xảy ra do các đột biến gen làm giảm hoặc không tổng hợp được chuỗi β-globin của phân tử Hb. Kết quả tạo nên các Hb bất thường dẫn đến giảm hoặc không thực hiện được chức năng vận chuyển khí cho cơ thể. Nếu ĐB gen làm chuỗi -globin giảm hay không được tạo thành gọi là bệnh -Thal. Cũng có trường hợp cả hai chuỗi β và α bị thiếu h t hơn bình thường, trường hợp này gọi là thể phối hợp α/β thalassemia.

Bệnh hemoglobin E (HbE do ĐB sai nghĩa tại vị trí nucleotide 129 của chuỗi -globin (bộ ba mã hoá thứ 26 trên exon 1 : GAG bị thay bằng AAG, làm cho acid amin vị trí thứ 26 là Glutamic acid bị thay bằng Lysine, dẫn đến giảm số lượng chuỗi -globin. Như vậy, HbE cũng là -Thal thể nhẹ. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia C m gen β-globin nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể (NST) số 11 (11p15.5 , với đoạn DNA dài 73.308 cặp base, mã số trên ngân hàng gen là U01317, bao gồm các gen có trật tự: 5’– epsilon – gamma – G – gamma – A – delta – beta – 3’. Gen β-globin dài 1606 cặp base, nằm ở vị trí nucleotide 5203272- 5204877 của NST số 11, tương ứng với nucleotide 62137-63742 của c m gen β-globin và đoạn khởi động sát đầu 5’ ở vị trí các nucleotide thứ 62061, 62106 và 62144.

Gen β-globin có 3 exon và 2 intron mã hoá cho chuỗi -globin dài 146 acid amin. Exon 1 ở nucleotide 1-142 và mã hoá các acid amin 1-30, acid amin thứ nhất bắt đầu từ vị trí nucleotide 50. Exon 2 ở nucleotide 273-495 và mã hoá các acid amin 31-104. Exon 3 bắt đầu từ nucleotide 1346-1606 và mã hoá các acid amin 105-146.

Các exon này tương ứng với 3 vùng cấu trúc và chức năng của chuỗi -globin. Exon 1 và exon 3 nằm phía ngoài chủ yếu là các acid amin ưa nước. Exon 2 nằm bên trong phân tử tạo bởi các acid amin kỵ nước. Khi có ĐB gen xảy ra thì trình tự các acid amin sẽ thay đổi.

Các acid amin ở bề mặt bị thay bằng các acid amin kỵ nước và tạo ra các thay đổi hoá học dẫn đến giảm đàn hồi, gây mất ổn định của phân tử protein, tạo ra các chuỗi β-globin bị lỗi (Wochenschr, S., 1983; Quách Thị Hoàng Oanh, 2009; Fettah, A. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Hình 2. Cấu trúc gen -Thal (Chanane Wanapirak et al, 2009) 2. Di truyền bệnh Beta thalassemia Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn trên NST thường, theo quy luật di truyền Mendel.

Khi chỉ có cha hoặc mẹ mang gen bệnh, 50% khả năng con sinh ra là thalassemia dị hợp tử và không có trẻ đồng hợp tử bị bệnh. Nếu cả cha và mẹ đều bị thalassemia dị hợp tử thì 25% khả năng sinh con bình thường, 50% khả năng con dị hợp tử và 25% khả năng con đồng hợp tử (Nguyễn Công Khanh, 1985; Wochenschr, S. Di truyền bệnh -Thal 2. Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen beta-globin Khi các ĐB xuất hiện trên gen β-globin tùy theo vị trí mà ĐB này sẽ làm thay đổi cấu trúc và số lượng của phân tử Hb và tạo ra các hồng cầu với nhiều biến đổi khác nhau.

Thông thường các ĐB đều làm giảm hoặc không tổng hợp loại Hb bình thường nên hồng cầu có biểu hiện nhược sắc và tăng sinh các hồng cầu non trong tủy. Đột biến gây thiếu h t chuỗi  dẫn đến dư thừa chuỗi . Các chuỗi  dư thừa tạo thành các hạt tủa xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu. Với hồng cầu ở máu ngoại vi, những hạt tủa này làm cho màng hồng cầu mất độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành tế bào cứng nên khó vượt qua các “màng lọc” ở lách (Maria-Domenica Cappellini et al, 2008; Srisupundit K, 2013).

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 5 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Bình thường α-Thal β-Thal Hình 2. Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal (Gelehrter, T. et al, 2000) Mặt khác, các hạt tủa cũng làm cho màng hồng cầu tăng diện tiếp xúc, dễ bị các tác nhân oxy hóa phá hủy. Đồng thời tính thấm của màng thay đổi nên kali ở bên trong tế bào thoát ra ngoài huyết tương.

Những tác hại trên của các hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu. Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi ở bệnh nhân β-Thal (Olivieri,N.