Nghiên cứu về đột biến và đa hình di truyền trên gen yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B

Luận án nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B, cung cấp cái nhìn sâu sắc về bệnh lý này.

• Trường học: Viện Huyết học - Truyền máu TW
• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến gen yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B
• Loại tài liệu: luận án
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về bệnh hemophilia B
• 1.1.1. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B
• 1.1.2. Khái quát về bệnh hemophilia B
• 1.1.2.1. Đặc điểm của bệnh
• 1.1.3. Phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh
• 1.1.3.1. Chẩn đoán xác định bệnh
• 1.1.3.2. Chẩn đoán mức độ bệnh
• 1.1.3.3. Điều trị bệnh
• 1.1.3.3.1. Liệu pháp thay thế protein
• 1.1.3.3.2. Liệu pháp gen
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Tóm tắt

I. Giới thiệu về bệnh hemophilia B

Bệnh hemophilia B là một rối loạn di truyền nghiêm trọng, gây ra bởi sự thiếu hụt yếu tố IX, một yếu tố quan trọng trong quá trình đông máu. Bệnh này thường biểu hiện qua hiện tượng chảy máu kéo dài sau chấn thương hoặc phẫu thuật. Theo thống kê, hemophilia B chiếm khoảng 15-20% tổng số ca bệnh hemophilia, với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30. Cơ chế gây bệnh chủ yếu là do các đột biến gen trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9), dẫn đến sự suy giảm hoặc ngừng sản xuất yếu tố này. Điều này gây ra các triệu chứng nghiêm trọng, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Việc chẩn đoán sớm và quản lý bệnh là rất quan trọng để giảm thiểu các biến chứng và cải thiện tình trạng sức khỏe cho người bệnh.

II. Đột biến gen yếu tố IX và cơ chế di truyền

Đột biến trên gen F9 là nguyên nhân chính gây ra bệnh hemophilia B. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể X và di truyền theo kiểu lặn liên kết với giới tính. Nam giới có nguy cơ mắc bệnh cao hơn, trong khi phụ nữ thường là người mang gen bệnh. Các đột biến di truyền có thể là di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác hoặc xuất hiện mới (de novo). Việc xác định các đột biến gen này là rất quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Nghiên cứu cho thấy có hơn 1000 loại đột biến khác nhau trên gen F9 đã được ghi nhận, điều này cho thấy sự đa dạng và phức tạp trong cơ chế gây bệnh. Việc lập bản đồ đột biến gen sẽ giúp các bác sĩ có cái nhìn rõ hơn về tình trạng bệnh lý của từng bệnh nhân.

III. Phương pháp chẩn đoán hemophilia B

Chẩn đoán hemophilia B thường dựa vào việc xác định nồng độ yếu tố IX trong huyết tương. Các xét nghiệm định lượng yếu tố IX sẽ giúp phân loại mức độ bệnh: nặng, trung bình và nhẹ. Bệnh nhân có nồng độ yếu tố IX dưới 40% được coi là mắc bệnh. Ngoài ra, việc phân tích đột biến gen cũng có thể được thực hiện để xác định tình trạng mang gen bệnh. Phương pháp phân tích trực tiếp và gián tiếp được sử dụng để chẩn đoán người mang gen bệnh. Phân tích trực tiếp tìm kiếm các đột biến gen cụ thể, trong khi phân tích gián tiếp sử dụng các đa hình nucleotide liên kết với gen F9 như những chỉ điểm để xác định người mang gen. Việc áp dụng các phương pháp này sẽ giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và quản lý bệnh hemophilia B.

IV. Điều trị bệnh hemophilia B

Điều trị hemophilia B chủ yếu dựa vào liệu pháp thay thế protein, trong đó yếu tố IX được bổ sung trực tiếp vào cơ thể bệnh nhân. Các chế phẩm điều trị có thể là huyết tương tươi đông lạnh hoặc yếu tố IX tái tổ hợp. Liệu pháp gen cũng đang được nghiên cứu như một phương pháp điều trị tiềm năng, với khả năng sửa chữa hoặc thay thế gen bị lỗi. Nghiên cứu cho thấy, nếu nồng độ yếu tố IX được cải thiện lên trên 30%, bệnh nhân có thể gần như khỏi bệnh hoàn toàn. Việc áp dụng các phương pháp điều trị hiện đại này không chỉ giúp cải thiện tình trạng sức khỏe của bệnh nhân mà còn nâng cao chất lượng cuộc sống cho họ.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu

Nghiên cứu về đột biến gen yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B tại Việt Nam là rất cần thiết. Hiện tại, việc chẩn đoán và quản lý bệnh vẫn còn nhiều khó khăn. Cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn để xác định các đa hình nucleotide và đột biến gen liên quan đến bệnh. Điều này sẽ giúp cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị, đồng thời nâng cao nhận thức về bệnh hemophilia B trong cộng đồng. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới sẽ góp phần quan trọng trong việc kiểm soát và quản lý bệnh hiệu quả hơn trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Hemophilia B (bệnh thiếu hụt yếu tố đông máu IX) là hội chứng rối loạn đông máu di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X (Xq27.1–Xq27.2), gây ra các đợt xuất huyết tự phát hoặc kéo dài sau chấn thương, dẫn đến tàn phế khớp và đe dọa trực tiếp tính mạng người bệnh. Trong bối cảnh dịch tễ học huyết học Việt Nam, gánh nặng lâm sàng vô cùng nặng nề khi dữ liệu từ Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương ghi nhận: "ước tính có ~ 30.000 người mang gen bệnh trên cả nước nhưng chỉ 20% trong số đó được chẩn đoán và quản lý", trong khi số lượng bệnh nhân thực tế được phát hiện chỉ chiếm khoảng 40%. Tính tiên phong của luận án thể hiện ở việc thiết lập công trình nghiên cứu toàn diện đầu tiên tại Việt Nam giải mã toàn bộ 34–35 kb của gen F9 bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS), đồng thời kiến tạo hệ thống chỉ thị đa hình phục vụ chẩn đoán gián tiếp qua phân tích liên kết.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ thực trạng các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chỉ dừng lại ở quy mô mẫu nhỏ (dưới 25 bệnh nhân) và chỉ giải trình tự Sanger cục bộ các exon, bỏ sót 5–10% đột biến tại các vùng intron sâu, vùng điều hòa và các tái cấu trúc lớn. Hơn nữa, hoàn toàn chưa có dữ liệu hệ thống về tần suất dị hợp tử của các đa hình nucleotide (SNP) trên gen F9 ở người Việt, dẫn đến việc áp dụng thiếu chuẩn xác các marker quốc tế vốn có tính đặc thù chủng tộc cao.

Luận án thiết lập 3 câu hỏi nghiên cứu và 3 giả thuyết tương ứng:

• RQ1: Bản đồ đột biến gen F9 toàn diện ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam có đặc điểm cấu trúc và phổ phân bố như thế nào khi khảo sát bằng NGS kết hợp MLPA?
• RQ2: Tương quan giữa kiểu gen đột biến và mức độ nặng lâm sàng (định lượng nồng độ yếu tố IX) cũng như nguy cơ phát sinh kháng thể ức chế diễn ra theo quy luật nào?
• RQ3: Các chỉ thị đa hình đơn nucleotide (SNP) nào trên gen F9 có tần suất dị hợp tử cao và đủ giá trị thông tin chẩn đoán để xây dựng quy trình phân tích liên kết đặc thù cho quần thể phụ nữ Việt Nam?

Các giả thuyết nghiên cứu bao gồm:

• H1: Phổ đột biến gen F9 ở bệnh nhân Việt Nam có sự đa dạng cao, trong đó đột biến điểm (missense, nonsense) chiếm ưu thế nhưng tồn tại các đột biến mới đặc thù quần thể và các mất đoạn lớn cần phối hợp kỹ thuật MLPA.
• H2: Có mối tương quan chặt chẽ giữa vị trí/loại đột biến với mức độ suy giảm nồng độ yếu tố IX (<1%, 1–5%, >5–40%) và các đột biến mất đoạn lớn/vô nghĩa làm tăng đột biến nguy cơ sinh chất ức chế kháng yếu tố IX.
• H3: Quần thể phụ nữ Việt Nam sở hữu tần suất alen và tỷ lệ dị hợp tử của các locus đa hình nội gen F9 mang tính đặc thù, khác biệt với quần thể người Da trắng và Da đen, cho phép thiết lập panel đa hình tối ưu hóa chẩn đoán gián tiếp.

Khung lý thuyết của nghiên cứu dựa trên Thuyết di truyền liên kết giới tính của Morgan (1910), Thuyết thác đông máu của Macfarlane (1964) / Davie & Ratnoff (1964), và Mô hình đông máu dựa trên tế bào của Hoffman & Monroe (2001). Đóng góp đột phá của luận án là cung cấp bản đồ đột biến chuẩn hóa đầu tiên trên 100 bệnh nhân không cùng huyết thống, định lượng cấu trúc dị hợp tử trên 100 phụ nữ khỏe mạnh và thẩm định thành công trên 23 người mang gen bắt buộc (obligate carriers), thu thập trong khung thời gian từ tháng 11/2016 đến tháng 12/2018 tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương.

       ┌─────────────────────────────────────────────────────────────┐
       │                KHUNG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN F9             │
       └──────────────────────────────┬──────────────────────────────┘
                                      │
              ┌───────────────────────┴───────────────────────┐
              ▼                                               ▼
┌───────────────────────────┐                   ┌───────────────────────────┐
│     PHÂN TÍCH TRỰC TIẾP   │                   │    PHÂN TÍCH GIÁN TIẾP    │
│  (Direct Mutation Screen) │                   │     (Linkage Analysis)    │
└─────────────┬─────────────┘                   └─────────────┬─────────────┘
              │                                               │
    ┌─────────┴─────────┐                           ┌─────────┴─────────┐
    ▼                   ▼                           ▼                   ▼
┌───────────────┐ ┌───────────┐               ┌───────────┐       ┌───────────┐
│ Long-range PCR│ │   MLPA    │               │  PCR-RFLP │       │  Sanger/  │
│    + NGS      │ │ (P207 F9) │               │(MseI,HhaI)│       │    NGS    │
└───────┬───────┘ └─────┬─────┘               └─────┬─────┘       └─────┬─────┘
        │               │                           │                   │
        ▼               ▼                           ▼                   ▼
┌─────────────────────────────┐               ┌───────────────────────────┐
│  Bản đồ 100 bệnh nhân HB    │               │   Panel đa hình SNP       │
│  Tương quan Genotype-       │               │   100 nữ chứng &          │
│  Phenotype & Chất ức chế    │               │   23 người mang gen       │
└─────────────────────────────┘               └───────────────────────────┘

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu di truyền học phân tử về hemophilia B khởi nguồn từ việc tách dòng gen F9 (1982–1984) và công bố trình tự toàn phần 34 kb bao gồm 8 exon và 7 intron bởi Yoshitake và cộng sự (1985). Cơ sở dữ liệu đột biến quốc tế do Giannelli và cộng sự khởi xướng năm 1990 ban đầu ghi nhận 216 đột biến, đến nay công trình tổng kết của Rallapalli và cộng sự (2013) trên 3.721 bệnh nhân đã ghi nhận hơn 1.113 đột biến khác nhau, chỉ ra rằng "có tới 73% (336/461 axit amin) trình tự của phân tử FIX xảy ra đột biến".

Dòng tài liệu thứ nhất tập trung vào giải mã phổ đột biến trực tiếp và tương quan kiểu gen - kiểu hình. Các nghiên cứu quốc tế quy mô lớn đã xác lập nền tảng dịch tễ học di truyền: Belvini và cộng sự (2005) nghiên cứu 238 bệnh nhân tại Ý phát hiện 137 đột biến với 36,5% đột biến mới; Tengguo Li và cộng sự (2014) khảo sát 226 bệnh nhân tại 17 trung tâm ở Mỹ ghi nhận 86% đột biến điểm; dự án My Life, Our Future (MLOF) tại Mỹ (Johnsen và cộng sự, 2017) khảo sát 599 bệnh nhân hemophilia B phát hiện 217 đột biến với 25,3% đột biến mới; và công trình quốc gia tại Canada của Lillicrap và cộng sự phân tích 267 bệnh nhân hemophilia B phát hiện 125 biến thể di truyền. Điểm chung của các nghiên cứu này là khẳng định đột biến sai nghĩa (missense) chiếm ưu thế (60–87%) và thường liên quan đến thể nhẹ/trung bình, trong khi các đột biến vô nghĩa (nonsense) và mất đoạn lớn liên quan chặt chẽ đến thể nặng.

Dòng tài liệu thứ hai xoay quanh các tranh luận về phân tích liên kết di truyền gián tiếp thông qua các đa hình nucleotide (SNP và VNTR). Các nghiên cứu đối chiếu quốc tế cho thấy sự phân bố tần suất alen đa hình mang tính dị biệt chủng tộc sâu sắc. Goodeve và cộng sự (1994) chỉ ra locus MseI ở vùng 5' có tần suất dị hợp tử đạt 43% ở phụ nữ Thái Lan nhưng lại có giá trị khác biệt ở người Da trắng. Shin và cộng sự (2010) chứng minh tại Hàn Quốc, các đa hình SalI, NruI và HhaI cho tỷ lệ chẩn đoán thành công 71%, trong khi các marker kinh điển của phương Tây như XmnI, DdeI và TaqI hoàn toàn không có thông tin (đồng hợp tử gần như 100%). Ngược lại, tại quần thể Da trắng, việc phối hợp 6 locus TaqI, XmnI, DdeI, MspI, BamHI, MnlI mang lại hiệu quả tới 80% (Graham và cộng sự, 1985; Winship và cộng sự, 1989).

Tranh luận học thuật lớn hiện nay nằm ở việc lựa chọn chiến lược chẩn đoán: Phân tích đột biến trực tiếp bằng NGS toàn diện hay phân tích gián tiếp bằng marker RFLP giá rẻ tại các nước có nguồn lực hạn chế. Luận án này định vị chính xác tại điểm giao thoa: sử dụng công nghệ NGS tiên tiến để giải mã cơ chế phân tử gốc, đồng thời sàng lọc chính xác hệ thống đa hình nội gen F9 để cung cấp giải pháp phân tích liên kết chi phí thấp, khả thi và tin cậy cho hệ thống y tế Việt Nam.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng Thuyết di truyền liên kết X của Thomas Hunt Morgan thông qua việc làm sáng tỏ cơ chế bất đối xứng trong nguồn gốc phát sinh đột biến de novo. Phù hợp với luận điểm của Montandon và cộng sự về tỷ lệ phát sinh đột biến giao tử nam/nữ (11:1), nghiên cứu củng cố cơ chế khử amin của 5-methylcytosine tại các đảo CpG siêu đột biến (hypermutable CpG islands) thuộc các bộ ba mã hóa Arginine (CGn $\rightarrow$ TGn).

Về mặt sinh hóa di truyền, nghiên cứu bổ sung bằng chứng thực nghiệm cho Thuyết đông máu dựa trên cấu trúc phân tử của phân tử Serine Protease. Sự liên kết giữa domain GLA với màng phospholipid tiểu cầu thông qua phản ứng $\gamma$-carboxyl hóa phụ thuộc Vitamin K, cũng như vai trò tương tác sống còn của domain EGF2 với cofactor FVIIIa (đặc biệt là cầu muối giữa Arg-c94 và Glu-c78) được sáng tỏ qua các đột biến làm gián đoạn cấu trúc không gian ba chiều, dẫn đến mất chức năng xúc tác chuyển hóa yếu tố X thành Xa ngay cả khi nồng độ kháng nguyên (FIX:Ag) vẫn tồn tại bình thường (đột biến nhóm II).

         ┌─────────────────────────────────────────────────────────┐
         │     CẤU TRÚC 5 DOMAIN CỦA YẾU SỐ IX & ĐỘT BIẾN         │
         └────────────────────────────┬────────────────────────────┘
                                      │
      ┌──────────────┬────────────────┼──────────────┬─────────────┐
      ▼              ▼                ▼              ▼             ▼
┌───────────┐  ┌───────────┐    ┌───────────┐  ┌───────────┐ ┌───────────┐
│    GLA    │  │   EGF1    │    │   EGF2    │  │Peptide (AP│ │ Catalytic │
│(1-46 aa)  │  │(47-84 aa) │    │(85-127 aa)│  │(145-180aa)│ │(181-415aa)│
└─────┬─────┘  └─────┬─────┘    └─────┬─────┘  └─────┬─────┘ └─────┬─────┘
      │              │                │              │             │
      ▼              ▼                ▼              ▼             ▼
  Gắn Ca2+,      Tương tác        Liên kết        Bị cắt bởi    Trung tâm
 Phospholipid    phức hợp       với FVIIIa,      TF/FVIIa và    xúc tác
 (Đột biến       TF/FVIIa       Arg94-Glu78        FXIa         Serine
  Arg43Gln)                     (Cầu muối)                      Protease

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba trụ cột lý thuyết: Di truyền học Mendel, Di truyền học quần thể (Định luật Hardy-Weinberg) và Động học phân tử enzym đông máu.

Cách tiếp cận phân tích kết hợp hai cánh (dual-arm analytical framework):

1. Trục trực tiếp: Sử dụng Long-range PCR bao phủ toàn bộ 35 kb gen F9 kết hợp giải trình tự NGS Illumina MiSeq và thẩm định bằng Sanger, xử lý các tái cấu trúc lớn bằng MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification).
2. Trục gián tiếp: Ứng dụng mô hình toán học quần thể để tính toán tần số dị hợp tử lý thuyết ($H = 1 - \sum p_i^2$) và thực tế, phân tích mức độ cân bằng liên kết (linkage equilibrium) nhằm chọn lọc các SNP có giá trị chỉ thị phân tử độc lập cao nhất.

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích: Áp dụng cho các gia đình có người bệnh được chẩn đoán xác định, có người nữ mang gen dị hợp tử với ít nhất một marker nội gen và loại trừ hiện tượng trao đổi chéo hiếm gặp trong nội bộ gen F9.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng triết lý thực chứng (positivism) với thiết kế mô tả cắt ngang có phân tích di truyền phân tử. Cỡ mẫu nghiên cứu được tính toán nghiêm ngặt theo công thức dịch tễ học Leslie Kish:

$$n = \frac{Z_{1-\alpha/2}^2 \cdot p(1-p)}{D^2}$$

Trong đó: độ tin cậy $95%$ ($Z_{1-\alpha/2} = 1{,}96$, $\alpha = 0{,}05$), tần số dị hợp tử kỳ vọng từ y văn $p = 0{,}44$, sai số tuyệt đối $D = 0{,}10$. Cỡ mẫu tối thiểu tính toán là $95$ mẫu. Luận án đã thu thập $100$ mẫu phụ nữ khỏe mạnh hiến máu tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương (ký hiệu NK01–NK100) nhằm đảm bảo tối đa lực thống kê (statistical power).

Đối tượng nghiên cứu toàn diện bao gồm 3 nhóm:

• Nhóm 1: 100 bệnh nhân nam mắc hemophilia B (HB01–HB100), định lượng FIX hoạt tính $<40%$, không có quan hệ huyết thống.
• Nhóm 2: 100 người phụ nữ khỏe mạnh (NK01–NK100), không có tiền sử gia đình chảy máu bất thường.
• Nhóm 3: 23 người phụ nữ mang gen bắt buộc hoặc có nguy cơ cao (MG01–MG23) thuộc các gia đình bệnh nhân để đánh giá độ chuẩn xác của bộ chỉ thị.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình kỹ thuật được chuẩn hóa cao độ với hệ thống hóa chất và thiết bị hiện đại:

• Tách chiết DNA: Tách chiết từ 2 ml máu ngoại vi chống đông EDTA bằng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng máy quang phổ NanoDrop và Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies).
• Khuếch đại toàn bộ gen F9: Thiết kế 8 cặp mồi gối đầu nhau (overlapping primers) bao phủ toàn bộ 35 kb, tối ưu hóa phản ứng Long-range PCR sử dụng enzyme độ chính xác cao 2x Q5 HiFi MasterMix (NEB) và LongRange PCR Kit (Qiagen).
• Giải trình tự NGS: Chuẩn bị thư viện giải trình tự bằng Nextera XT DNA Library Preparation Kit và Nextera XT Index Kit; giải trình tự trên hệ thống Illumina MiSeq với MiSeq Reagent Kit v2 (300 chu kỳ, bắt cặp hai đầu - Paired-End 150 bp).
• Thẩm định chéo (Cross-validation): 100% các đột biến mới và 10 mẫu bệnh nhân ngẫu nhiên được kiểm chứng đối chiếu độc lập bằng phương pháp giải trình tự kinh điển Sanger sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit trên máy giải trình tự mao quản ABI 3500 (Applied Biosystems).
• Phát hiện mất đoạn lớn: Sử dụng kỹ thuật MLPA với bộ kít chuyên biệt SALSA MLPA P207 F9 (MRC-Holland) chứa 9 đầu dò đặc hiệu cho 8 exon của gen F9.
• Phân tích liên kết: Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP cắt bằng các enzyme giới hạn tương ứng (MseI, HhaI) và điện di trên gel agarose/polyacrylamide.

Data và phân tích

Dữ liệu thô (raw reads) từ máy MiSeq định dạng FASTQ được xử lý qua pipeline tin sinh học: cắt lọc adapter và đoạn đọc kém chất lượng (Q-score $<30$) bằng Trimmomatic, căn gióng với hệ gen tham chiếu người chuẩn GRCh37/hg19 (F9 gene accession: NC_000023.10) bằng BWA-MEM, loại bỏ PCR duplicates bằng Picard, và gọi biến thể (variant calling) bằng GATK HaplotypeCaller. Đột biến được chú thích (annotation) và phân loại theo hướng dẫn của ACMG/AMP 2015. Tần số alen, tỷ lệ dị hợp tử quan sát ($H_o$), tỷ lệ dị hợp tử kỳ vọng ($H_e$) và trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg được tính toán bằng phần mềm thống kê chuyên ngành sinh học phân tử với mức ý nghĩa $p < 0{,}05$.

   ┌──────────────────────────────────────────────────────────────┐
   │            PIPELINE TIN SINH HỌC & GIẢI TRÌNH TỰ NGS         │
   └──────────────────────────────┬───────────────────────────────┘
                                  │
                                  ▼
      ┌────────────────────────────────────────────────────────┐
      │  Illumina MiSeq Paired-End Reads (2 x 150 bp, FASTQ)   │
      └───────────────────────────┬────────────────────────────┘
                                  │
                                  ▼
      ┌────────────────────────────────────────────────────────┐
      │  Tiền xử lý & Cắt lọc chất lượng (Trimmomatic, Q ≥ 30) │
      └───────────────────────────┬────────────────────────────┘
                                  │
                                  ▼
      ┌────────────────────────────────────────────────────────┐
      │  Căn gióng hệ gen tham chiếu hg19 (BWA-MEM)            │
      └───────────────────────────┬────────────────────────────┘
                                  │
                                  ▼
      ┌────────────────────────────────────────────────────────┐
      │  Xử lý sắp xếp & Loại bỏ duplicates (SAMtools/Picard)  │
      └───────────────────────────┬────────────────────────────┘
                                  │
                                  ▼
      ┌────────────────────────────────────────────────────────┐
      │  Gọi biến thể SNVs & Indels (GATK HaplotypeCaller)     │
      └───────────────────────────┬────────────────────────────┘
                                  │
                                  ▼
      ┌────────────────────────────────────────────────────────┐
      │  Chú giải biến thể & Phân loại ACMG (Annovar / VEP)    │
      └───────────────────────────┬────────────────────────────┘
                                  │
                 ┌────────────────┴────────────────┐
                 ▼                                 ▼
      ┌─────────────────────┐           ┌─────────────────────┐
      │ Đối chứng Sanger    │           │ Xác nhận MLPA       │
      │ (ABI 3500)          │           │ (SALSA P207 F9)     │
      └─────────────────────┘           └─────────────────────┘

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Thiết lập bản đồ đột biến gen F9 toàn diện: Phát hiện chính xác các đột biến gây bệnh ở 100 bệnh nhân nghiên cứu. Tỷ lệ đột biến thay thế đơn nucleotide (đột biến điểm) chiếm ưu thế áp đảo (~85%), bao gồm đột biến sai nghĩa (missense), đột biến vô nghĩa (nonsense), và đột biến vị trí cắt nối (splice site). Phát hiện các đột biến mất đoạn nhỏ (indels) và mất đoạn lớn trên toàn bộ gen.
2. Khám phá các biến thể đột biến mới: Ghi nhận các đột biến mới chưa từng được công bố trong cơ sở dữ liệu quốc tế Factor IX Mutation Database và CDC Hemophilia B Mutation Project, đóng góp trực tiếp vào kho tàng biến dị di truyền nhân loại của phân tử yếu tố IX.
3. Mối liên hệ giữa kiểu đột biến và nguy cơ tạo chất ức chế: Xác nhận kết quả lâm sàng tương đồng với y văn quốc tế (Radic và cộng sự, 2013; Li và cộng sự, 2014): các bệnh nhân mang đột biến mất đoạn lớn toàn bộ gen và đột biến vô nghĩa (như codon kết thúc sớm) có nguy cơ phát sinh kháng thể ức chế FIX cao vượt trội so với nhóm đột biến sai nghĩa thông thường, do hệ miễn dịch không dung nạp protein lạ khi truyền chế phẩm yếu tố IX cô đặc.
4. Phát hiện dị biệt quần thể sâu sắc về tính đa hình nucleotide: Khảo sát trên 100 phụ nữ khỏe mạnh và 200 nhiễm sắc thể X chứng minh rằng các marker XmnI, TaqI, DdeI (vốn phổ biến ở người Da trắng với tỷ lệ dị hợp tử >30%) lại gần như đồng hợp tử 100% ở người Việt Nam, không có giá trị chẩn đoán. Ngược lại, đa hình MseI (5' UTR) và HhaI (3' UTR) biểu hiện tần suất dị hợp tử cao (lần lượt đạt xấp xỉ 41% và 31,5%), tạo thành bộ chỉ điểm vàng cho chẩn đoán phân tích liên kết.
5. Hiệu lực chẩn đoán người mang gen đạt mức tối ưu: Khi kết hợp cặp chỉ thị MseI và HhaI, tỷ lệ cung cấp thông tin di truyền chẩn đoán thành công cho các phụ nữ mang gen bắt buộc (obligate carriers) đạt trên 70%, giải quyết triệt để rào cản kỹ thuật của các xét nghiệm đông máu thông thường.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm vững chắc cho mô hình tiến hóa phân tử trung tính của Kimura và cơ chế chọn lọc di truyền trên nhiễm sắc thể giới tính X ở người châu Á.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa thành công quy trình Long-range PCR 8 amplicon kết hợp giải trình tự NGS Illumina MiSeq, tạo tiền đề phương pháp luận có thể chuyển giao cho chẩn đoán các bệnh lý di truyền đơn gen kích thước lớn khác (như F8 trong Hemophilia A, DMD trong loạn dưỡng cơ Duchenne).
• Về mặt thực tiễn y học: Cung cấp công cụ chẩn đoán phân tử có độ chính xác 100% cho tư vấn tiền hôn nhân, sàng lọc trước sinh từ tế bào gai nhau hoặc dịch ối, và chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (PGD).
• Về mặt chính sách y tế công cộng: Cung cấp cơ sở dữ liệu dịch tễ học phân tử để Bộ Y tế và Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương xây dựng chương trình mục tiêu quốc gia về quản lý và loại trừ bệnh máu khó đông di truyền, giảm thiểu gánh nặng chi phí điều trị yếu tố cô đặc hàng tỷ đồng mỗi năm cho ngân sách bảo hiểm y tế.

Limitations và Future Research

1. Giới hạn về phạm vi địa lý mẫu: Mặc dù cỡ mẫu 100 bệnh nhân là rất lớn đối với một bệnh hiếm, các đối tượng nghiên cứu chủ yếu tập trung tại khu vực miền Bắc và miền Trung đến khám tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, chưa bao phủ toàn diện các tiểu quần thể dân tộc thiểu số tại Việt Nam.
2. Giới hạn trong phân tích biến thể cấu trúc phức tạp: Kỹ thuật NGS short-read (150 bp) kết hợp Long-range PCR có thể gặp khó khăn trong việc phát hiện các tái sắp xếp cấu trúc vi mô hoặc các đột biến chuyển đoạn nằm sâu trong các vùng lặp lại cao của intron nếu không kết hợp giải trình tự đọc dài (Long-read sequencing như PacBio/Oxford Nanopore).
3. Chưa thực hiện khảo sát chức năng protein in vitro: Các đột biến mới phát hiện chủ yếu được đánh giá tính gây bệnh (pathogenicity) thông qua các thuật toán tin sinh học (SIFT, PolyPhen-2, MutationTaster) và đối chiếu lâm sàng, chưa tiến hành biểu hiện gen tái tổ hợp để đo hoạt tính enzyme trực tiếp trong môi trường nuôi cấy tế bào.

Chương trình nghiên cứu tương lai định hướng:

• Mở rộng quy mô điều tra di truyền đa trung tâm tại miền Nam (Bệnh viện Truyền máu – Huyết học TP.HCM, Bệnh viện Nhi Đồng 1, 2) nhằm hoàn thiện Cơ sở dữ liệu Quốc gia Biến dị Di truyền Hemophilia B.
• Ứng dụng giải trình tự phân tử đơn đọc dài (Long-read Nanopore sequencing) để giải mã trực tiếp toàn bộ phân tử RNA và biến thể cấu trúc phức tạp của gen F9.
• Xây dựng mô hình tế bào knock-in bằng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để đánh giá cơ chế phân tử chính xác của các đột biến mới.
• Thử nghiệm tiền lâm sàng liệu pháp gen (Gene Therapy) sử dụng vector AAV mang gen F9-Padua biến đổi nhằm hướng tới chữa khỏi hoàn toàn bệnh cho bệnh nhân Việt Nam.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Công trình tạo lập mốc son trong nghiên cứu di truyền huyết học tại Việt Nam, là tài liệu tham khảo chuẩn mực cho các nghiên cứu sinh học phân tử, dự kiến mang lại chỉ số trích dẫn cao trong các tạp chí chuyên ngành huyết học và di truyền y học trong nước và quốc tế.
• Chuyển đổi ngành công nghệ sinh học và chẩn đoán: Cung cấp quy trình công nghệ được tối ưu hóa sẵn sàng thương mại hóa dưới dạng các bộ kit xét nghiệm PCR-RFLP và panel NGS chẩn đoán nhanh, tiết kiệm chi phí xét nghiệm từ hàng chục triệu đồng xuống mức phù hợp với điều kiện kinh tế của người dân.
• Ảnh hưởng chính sách y tế: Thúc đẩy đưa xét nghiệm sàng lọc gen bệnh hemophilia vào danh mục chi trả của Bảo hiểm Y tế và chương trình sàng lọc tiền hôn nhân quốc gia, giúp quản lý hiệu quả nguồn gen bệnh trong cộng đồng.
• Lợi ích xã hội định lượng: Ngăn chặn sự ra đời của hàng trăm trẻ mắc bệnh thể nặng mỗi năm thông qua chẩn đoán trước sinh, giúp tiết kiệm hàng trăm tỷ đồng chi phí điều trị các đợt xuất huyết và biến chứng khớp cho gia đình và xã hội, nâng cao chất lượng dân số Việt Nam.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học viên sau đại học: Tiếp cận hệ thống phương pháp luận chuẩn mực về thiết kế mồi Long-range PCR, vận hành pipeline tin sinh học NGS và phương pháp tính toán di truyền quần thể ứng dụng.
• Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia tư vấn di truyền: Sở hữu bản đồ đột biến và bộ chỉ thị SNP tin cậy để đưa ra tiên lượng chính xác về nguy cơ sinh chất ức chế và tư vấn sinh sản chuẩn xác cho các gia đình mang gen bệnh.
• Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp R&D công nghệ sinh học: Tiếp cận quy trình công nghệ chuẩn hóa để phát triển các kit chẩn đoán phân tử in vitro (IVD) đặc thù cho người Việt.
• Nhà hoạch định chính sách y tế: Có số liệu khoa học xác thực để xây dựng chiến lược quốc gia kiểm soát và tiến tới thanh toán các gánh nặng bệnh máu di truyền.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Luận án đã mở rộng Thuyết di truyền học quần thể và Cơ chế bệnh sinh phân tử của rối loạn đông máu bằng cách chứng minh sự phân kỳ sâu sắc trong cấu trúc đa hình di truyền của gen F9 giữa người Việt Nam và các chủng tộc khác. Công trình bác bỏ tính phổ quát của các marker di truyền phương Tây (XmnI, TaqI, DdeI) trên người Việt, xác lập MseI và HhaI là hai trụ cột chỉ thị phân tử cốt lõi cho quần thể bản địa.
2. Đột phá phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây thể hiện như thế nào? So với nghiên cứu của Nguyễn Thị Băng Sương (chỉ khảo sát 1 gia đình) và Bệnh viện Nhi Đồng 1 (23 bệnh nhân bằng Sanger từng exon), luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam thiết lập quy trình Long-range PCR 8 cặp mồi bao phủ liên tục toàn bộ 35 kb gen F9, giải trình tự song song hàng loạt trên hệ thống NGS Illumina MiSeq với độ bao phủ (coverage) sâu, kết hợp thuật toán tin sinh học và kiểm chứng chéo 100% bằng Sanger và MLPA P207.
3. Phát hiện nào gây bất ngờ nhất về mặt số liệu thực nghiệm? Phát hiện bất ngờ nhất là tính đa hình cực thấp (gần như monomorphic, $H_o \approx 0%$) của 3 locus SNP kinh điển (XmnI, TaqI, DdeI) trên 100 phụ nữ khỏe mạnh Việt Nam, trái ngược hoàn toàn với dữ liệu của người Da trắng (tỷ lệ dị hợp tử 30–35%). Điều này lý giải nguyên nhân thất bại của các phác đồ chẩn đoán gián tiếp nhập khẩu trước đây khi áp dụng tại Việt Nam.
4. Luận án có cung cấp quy trình tái lặp hoàn chỉnh (Replication Protocol) không? Có. Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ trình tự 8 cặp mồi Long-range PCR, chu trình nhiệt tối ưu hóa, nồng độ hóa chất của kit Q5 MasterMix, quy trình chuẩn bị thư viện Nextera XT, nồng độ nạp mẫu MiSeq, và các bước phân tích enzyme RFLP (MseI, HhaI) cho phép bất kỳ phòng xét nghiệm sinh học phân tử chuẩn mực nào cũng có thể tái lập chính xác.
5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình ra sao? Chương trình 10 năm hướng tới: (1) Mở rộng ngân hàng dữ liệu đột biến F9 toàn quốc đạt quy mô $>500$ bệnh nhân; (2) Thiết lập panel giải trình tự đọc dài Nanopore/PacBio; (3) Ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 sửa chữa đột biến F9 trên tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC); và (4) Triển khai thử nghiệm lâm sàng liệu pháp gen AAV-FIX tại Việt Nam.

Kết luận

1. Luận án là công trình khoa học đầu tiên tại Việt Nam giải mã toàn diện cấu trúc di truyền gen F9 trên quy mô lớn (100 bệnh nhân hemophilia B và 100 phụ nữ khỏe mạnh) bằng công nghệ NGS hiện đại kết hợp MLPA và Sanger.
2. Thiết lập thành công bản đồ đột biến gen F9 chuẩn mực, xác định phổ đột biến đa dạng với ưu thế đột biến điểm, đồng thời phát hiện nhiều biến thể đột biến mới có giá trị học thuật quốc tế.
3. Chứng minh rõ nét mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình lâm sàng, đặc biệt là nguy cơ hình thành chất ức chế kháng FIX cao vượt trội ở nhóm đột biến mất đoạn lớn và đột biến vô nghĩa.
4. Xác lập cấu trúc đa hình di truyền đặc thù của quần thể người Việt trên gen F9, chứng minh tính vô hiệu của các marker XmnI, TaqI, DdeI và xác định bộ đôi chỉ thị vàng MseI và HhaI với tỷ lệ dị hợp tử cao.
5. Xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình chẩn đoán kép (trực tiếp bằng NGS/Sanger/MLPA và gián tiếp bằng phân tích liên kết RFLP), đạt hiệu quả chẩn đoán người mang gen trên 70% và độ tin cậy tuyệt đối phục vụ chẩn đoán trước sinh.
6. Mở ra các hướng nghiên cứu chuyển giao công nghệ chẩn đoán chi phí thấp trong nước, đóng góp dữ liệu cốt lõi cho dịch tễ học di truyền toàn cầu và đặt nền móng vững chắc cho việc ứng dụng liệu pháp gen điều trị hemophilia B tại Việt Nam trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

1 MỞ ĐẦU Hemophilia B là hội chứng rối loạn chảy máu nghiêm trọng. Biểu hiện chính của bệnh là hiện tượng chảy máu lâu cầm sau nhổ răng, vết rách, sau chấn thương, sau phẫu thuật hoặc chảy máu sinh lý khác. Ở bệnh mức độ nặng hiện tượng chảy máu trong có thể gây tổn thương các cơ quan và mô, dẫn đến tàn phế và đe dọa tính mạng của người bệnh [1] [2]. Đây là bệnh lý dai dẳng, khó điều trị và ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh.

Hemophilia B chiếm tỷ lệ từ 15-20% trong nhóm bệnh hemophilia với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30. Cơ chế sinh bệnh xuất phát từ các đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9). Các đột biến tác động làm suy giảm hoặc làm ngừng quá trình tổng hợp yếu tố IX của gen, gây thiếu hụt yếu tố IX và dẫn đến hiện tượng chảy máu kéo dài. Gen F9 là gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể X (Xq27.2) do đó hemophilia B là bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính.

Nam giới bị bệnh sinh ra tất cả con gái là người mang gen bệnh. Phụ nữ mang gen bệnh có 50% nguy cơ truyền nhiễm sắc thể X đột biến cho con trong mỗi lần sinh [5]. Chính vì vậy, phòng bệnh thông qua chẩn đoán người mang gen bệnh là cách tiếp cận hữu hiệu và duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh. Đây là nhiệm vụ, là mục tiêu chính của các chiến lược quản lý bệnh hemophilia B.

Hiện nay, trên thế giới có hai cách tiếp cận khác nhau để chẩn đoán người mang gen bệnh đó là phương pháp phân tích trực tiếp đột biến gây bệnh và phương pháp chẩn đoán gián tiếp thông qua các đa hình nucleotide liên kết với gen F9. Phân tích trực tiếp là phương pháp đi tìm đột biến gen ở người bị bệnh, sau đó sử dụng chính đột biến ở người bệnh làm chỉ thị phân tử để chẩn đoán tình trạng mang gen và chẩn đoán trước sinh cho các thành viên nữ trong gia đình. Như vậy, trong phương pháp phân tích trực tiếp, đột biến gen ở người bệnh là cơ sở để xác định tình trạng mang gen bệnh. Phân tích gián tiếp còn được gọi là phân tích liên kết (linkage analysis).

Phương pháp này không cần xác định cụ thể đột biến gây bệnh mà sử dụng các đa hình liên kết với gen F9 bệnh như những “chỉ điểm” để lần theo dấu vết gen 2 bệnh, từ đó xác định người mang gen bệnh. Để áp dụng phân tích liên kết, ngoài việc đáp ứng các yêu cầu về mẫu bệnh phẩm, trong gia đình người bệnh cần xác định được người chắc chắn mang gen bệnh và dị hợp tử với ít nhất một đa hình trên gen F9. Việc tìm ra được một đa hình dị hợp tử ở người mang gen sẽ gặp nhiều khó khăn nếu như không có thông tin về tần suất dị hợp tử của các đa hình. Do đó, khảo sát để tìm ra các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao, đặc trưng cho quần thể đóng là bước quan trọng đầu tiên để có thể ứng dụng hiệu quả phương pháp phân tích liên kết [5] [6].

Trên thế giới, các nghiên cứu về biến đổi di truyền trên gen F9 đã được thực hiện từ rất lâu [7]. Đến nay, cơ sở dữ liệu đột biến trên thế giới đã ghi nhận trên 1000 đột biến gen liên quan đến bệnh hemophilia B và nhiều đa hình nucleotide trên gen F9 [4]. Nhiều quốc gia đã xây dựng được cơ sở dữ liệu đột biến gen của bệnh nhân đồng thời xác định được các đa hình có giá trị trong chẩn đoán, do đó áp dụng linh hoạt được cả hai phương pháp phân tích trực tiếp và gián tiếp trong chẩn đoán người mang gen, hỗ trợ hiệu quả công tác kiểm soát và quản lý bệnh [8] [9] [10] [11] [12] [13]. Tại Việt Nam, chẩn đoán và quản lý bệnh hemophilia B vẫn còn là một vấn đề nan giải.

Theo ghi nhận của Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học - Truyền máu TW, mỗi năm có hàng trăm ca bệnh mới được phát hiện. Số liệu ước tính của trung tâm cho thấy có ~ 30.000 người mang gen bệnh trên cả nước nhưng chỉ 20% trong số đó được chẩn đoán và quản lý [14]. Chẩn đoán người mang gen để tư vấn tiền hôn nhân và tư vấn sinh sản là biện pháp duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh. Tuy nhiên, hiện chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện để tìm hiểu về các đa hình nucleotide trên gen F9 ở người Việt Nam; nghiên cứu về đột biến gen F9 liên quan đến bệnh hemophilia B mặc dù đã được tiến hành trong một vài nghiên cứu nhưng cỡ mẫu chưa nhiều do đó dữ liệu về đột biến gen ở bệnh nhân còn rất thiếu.

Do đó công tác chẩn đoán và quản lý người mang gen chưa hiệu quả dẫn đến tỷ lệ mắc bệnh gia tăng. Chính vì vậy, với mong muốn tiếp cận để phối hợp được cả hai phương pháp phân tích trực tiếp và phân tích gián tiếp trong chẩn đoán người mang gen bệnh hemophilia B tại Việt Nam, nghiên cứu sinh thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B”. 3 MỤC TIÊU Mục tiêu 1: Lập bản đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX của bệnh nhân hemophilia B. Mục tiêu 2: Khảo sát để xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm cơ sở để chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết.

Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX trên máy giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing). - Thiết kế các cặp mồi gối đầu nhau để khuếch đại toàn bộ gen F9 - Xây dựng và tối ưu quy trình Long-range PCR khuếch đại gen F9 - Xây dựng quy trình giải trình tự gen F9 bằng kỹ thuật NGS - Khẳng định độ tin cậy của quy trình NGS bằng phương pháp Sanger 2. Giải trình tự gen F9 và lập bản đồ đột biến gen F9 ở 100 bệnh nhân hemophilia B. Khảo sát mối tương quan kiểu gen đột biến và tình trạng bệnh ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu.

Giải trình tự gen F9 ở 100 người phụ nữ khỏe mạnh. Xác định tần suất và tỷ lệ dị hợp tử các đa hình nucleotide trên gen F9. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu số lượng lớn và tổng thể về đột biến trên toàn bộ gen mã hóa yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, bao gồm tất cả các vùng chức năng, các exon và intron, sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen NGS.

Là công trình nghiên cứu tính đa hình nucleotid trên gen mã hóa yếu tố IX đầu tiên tại Việt Nam, thực hiện nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn, phục vụ chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bệnh hemophilia B 1. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B Theo ghi chép của các sử gia Châu Âu, những ghi nhận đầu tiên về bệnh máu khó đông, tên gọi khác của bệnh hemophilia B đã được đề cập đến từ thế kỷ thứ hai sau công nguyên khi các giáo sỹ Do Thái cổ đại thực hiện thủ thuật cắt bao quy đầu cho các bé trai mới sinh.

Người ta quan sát thấy nhiều em bé bị chảy máu kéo dài dẫn tới tử vong sau khi thực hiện thủ thuật này. Ở thời điểm đó, hiện tượng này chưa được coi là một căn bệnh, cũng chưa được mô tả hay điều trị gì, mà chỉ được xem như một sự nhiễm trùng. Mặc dù vậy, với những hậu quả nghiêm trọng đã xảy ra, quy định cắt bao quy đầu sau đó đã được miễn cho các cậu bé mà tiền sử đã có hai anh trai bị chết vì chảy máu [15] [16]. Vào thế kỷ thứ 10, bác sỹ người Ả Rập, Al-Zahrawi - Albucasis (936-1013), người đầu tiên mô tả về căn bệnh này, đã phát hiện ra ở một số người nam giới có hiện tượng dễ bị chảy máu kéo dài khi gặp chấn thương dù rất nhỏ.

Mặc dù chưa biết nguyên nhân của bệnh nhưng ông đã đặt tên là “bệnh máu”, đồng thời đề xuất phương pháp điều trị là đốt vị trí tổn thương đến khi mạch ngừng chảy máu. Đây được coi là phương pháp điều trị sơ khai đầu tiên của căn bệnh này [15] [16]. Năm 1803, bác sỹ người Mỹ, John Conrad Otto đã công bố kết quả của nghiên cứu “mô tả tình trạng máu khó đông ở một số gia đình” [17]. Trong nghiên cứu, ông đã nhận ra rối loạn này có tính chất di truyền, chỉ người nam giới mới bị và bệnh là do những người phụ nữ không bị bệnh truyền cho các con trai của họ với một tỷ lệ nhất định.

Những phát hiện này định hình cơ bản đặc điểm của một căn bệnh và là tiền đề cho những nghiên cứu vô vùng mạnh mẽ ở thế kỷ 19. Năm 1928, thuật ngữ “hemophilia” với ý nghĩa bệnh ưa chảy máu mới được đề cập lần đầu tiên tại đại học Zurich để mô tả về căn bệnh này [15]. Bệnh hemophilia B bùng nổ vào thế kỷ 19 đến 20 và được xem như một căn bệnh “hoàng gia” khi nhiều hoàng tộc Châu Âu đều mắc bệnh này. Nữ hoàng Anh, Victoria được coi là người đầu tiên mang gen bệnh hemophilia B.

Con trai bà mất do xuất huyết não sau chấn thương 5 ở tuổi 31. Gen bệnh từ hai người con gái của bà đã lan truyền khắp các hoàng tộc như Tây Ban Nha, Đức và Nga. Sự bùng nổ của bệnh hemophilia trong các gia đình hoàng gia lúc bấy giờ đã thúc đẩy mạnh mẽ việc tìm hiểu các kiến thức y học của căn bệnh này [15] [16]. Năm 1952, Rosemary Biggs phát hiện ra bệnh hemophilia B, còn được gọi là bệnh Chrismas (theo họ của bệnh nhân hemophilia B đầu tiên, Stephan Chrismas).

Yếu tố IX đồng thời cũng được gọi là yếu tố Christmas. Các mô hình nghiên cứu điều trị bệnh hemophia B được tập trung nghiên cứu. Các chế phẩm điều trị bệnh hemophilia B được tối ưu qua từng giai đoạn: chế phẩm huyết tương tươi và máu toàn phần (1960), tủa lạnh (1964), yếu tố cô đặc có nguồn gốc huyết tương (từ 1970), yếu tố cô đặc tái tổ hợp (từ 1994 đến nay) [15] [16] [18]. Năm 1963, Liên đoàn hemophilia thế giới được thành lập, cho thấy một sự quan tâm đặc biệt tới căn bệnh này.