1 MỞ ĐẦU Hemophilia B là hội chứng rối loạn chảy máu nghiêm trọng. Biểu hiện chính của bệnh là hiện tượng chảy máu lâu cầm sau nhổ răng, vết rách, sau chấn thương, sau phẫu thuật hoặc chảy máu sinh lý khác. Ở bệnh mức độ nặng hiện tượng chảy máu trong có thể gây tổn thương các cơ quan và mô, dẫn đến tàn phế và đe dọa tính mạng của người bệnh [1] [2]. Đây là bệnh lý dai dẳng, khó điều trị và ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh.
Hemophilia B chiếm tỷ lệ từ 15-20% trong nhóm bệnh hemophilia với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30. Cơ chế sinh bệnh xuất phát từ các đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9). Các đột biến tác động làm suy giảm hoặc làm ngừng quá trình tổng hợp yếu tố IX của gen, gây thiếu hụt yếu tố IX và dẫn đến hiện tượng chảy máu kéo dài. Gen F9 là gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể X (Xq27.2) do đó hemophilia B là bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính.
Nam giới bị bệnh sinh ra tất cả con gái là người mang gen bệnh. Phụ nữ mang gen bệnh có 50% nguy cơ truyền nhiễm sắc thể X đột biến cho con trong mỗi lần sinh [5]. Chính vì vậy, phòng bệnh thông qua chẩn đoán người mang gen bệnh là cách tiếp cận hữu hiệu và duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh. Đây là nhiệm vụ, là mục tiêu chính của các chiến lược quản lý bệnh hemophilia B.
Hiện nay, trên thế giới có hai cách tiếp cận khác nhau để chẩn đoán người mang gen bệnh đó là phương pháp phân tích trực tiếp đột biến gây bệnh và phương pháp chẩn đoán gián tiếp thông qua các đa hình nucleotide liên kết với gen F9. Phân tích trực tiếp là phương pháp đi tìm đột biến gen ở người bị bệnh, sau đó sử dụng chính đột biến ở người bệnh làm chỉ thị phân tử để chẩn đoán tình trạng mang gen và chẩn đoán trước sinh cho các thành viên nữ trong gia đình. Như vậy, trong phương pháp phân tích trực tiếp, đột biến gen ở người bệnh là cơ sở để xác định tình trạng mang gen bệnh. Phân tích gián tiếp còn được gọi là phân tích liên kết (linkage analysis).
Phương pháp này không cần xác định cụ thể đột biến gây bệnh mà sử dụng các đa hình liên kết với gen F9 bệnh như những “chỉ điểm” để lần theo dấu vết gen 2 bệnh, từ đó xác định người mang gen bệnh. Để áp dụng phân tích liên kết, ngoài việc đáp ứng các yêu cầu về mẫu bệnh phẩm, trong gia đình người bệnh cần xác định được người chắc chắn mang gen bệnh và dị hợp tử với ít nhất một đa hình trên gen F9. Việc tìm ra được một đa hình dị hợp tử ở người mang gen sẽ gặp nhiều khó khăn nếu như không có thông tin về tần suất dị hợp tử của các đa hình. Do đó, khảo sát để tìm ra các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao, đặc trưng cho quần thể đóng là bước quan trọng đầu tiên để có thể ứng dụng hiệu quả phương pháp phân tích liên kết [5] [6].
Trên thế giới, các nghiên cứu về biến đổi di truyền trên gen F9 đã được thực hiện từ rất lâu [7]. Đến nay, cơ sở dữ liệu đột biến trên thế giới đã ghi nhận trên 1000 đột biến gen liên quan đến bệnh hemophilia B và nhiều đa hình nucleotide trên gen F9 [4]. Nhiều quốc gia đã xây dựng được cơ sở dữ liệu đột biến gen của bệnh nhân đồng thời xác định được các đa hình có giá trị trong chẩn đoán, do đó áp dụng linh hoạt được cả hai phương pháp phân tích trực tiếp và gián tiếp trong chẩn đoán người mang gen, hỗ trợ hiệu quả công tác kiểm soát và quản lý bệnh [8] [9] [10] [11] [12] [13]. Tại Việt Nam, chẩn đoán và quản lý bệnh hemophilia B vẫn còn là một vấn đề nan giải.
Theo ghi nhận của Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học - Truyền máu TW, mỗi năm có hàng trăm ca bệnh mới được phát hiện. Số liệu ước tính của trung tâm cho thấy có ~ 30.000 người mang gen bệnh trên cả nước nhưng chỉ 20% trong số đó được chẩn đoán và quản lý [14]. Chẩn đoán người mang gen để tư vấn tiền hôn nhân và tư vấn sinh sản là biện pháp duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh. Tuy nhiên, hiện chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện để tìm hiểu về các đa hình nucleotide trên gen F9 ở người Việt Nam; nghiên cứu về đột biến gen F9 liên quan đến bệnh hemophilia B mặc dù đã được tiến hành trong một vài nghiên cứu nhưng cỡ mẫu chưa nhiều do đó dữ liệu về đột biến gen ở bệnh nhân còn rất thiếu.
Do đó công tác chẩn đoán và quản lý người mang gen chưa hiệu quả dẫn đến tỷ lệ mắc bệnh gia tăng. Chính vì vậy, với mong muốn tiếp cận để phối hợp được cả hai phương pháp phân tích trực tiếp và phân tích gián tiếp trong chẩn đoán người mang gen bệnh hemophilia B tại Việt Nam, nghiên cứu sinh thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B”. 3 MỤC TIÊU Mục tiêu 1: Lập bản đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX của bệnh nhân hemophilia B. Mục tiêu 2: Khảo sát để xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm cơ sở để chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết.
Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX trên máy giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing). - Thiết kế các cặp mồi gối đầu nhau để khuếch đại toàn bộ gen F9 - Xây dựng và tối ưu quy trình Long-range PCR khuếch đại gen F9 - Xây dựng quy trình giải trình tự gen F9 bằng kỹ thuật NGS - Khẳng định độ tin cậy của quy trình NGS bằng phương pháp Sanger 2. Giải trình tự gen F9 và lập bản đồ đột biến gen F9 ở 100 bệnh nhân hemophilia B. Khảo sát mối tương quan kiểu gen đột biến và tình trạng bệnh ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu.
Giải trình tự gen F9 ở 100 người phụ nữ khỏe mạnh. Xác định tần suất và tỷ lệ dị hợp tử các đa hình nucleotide trên gen F9. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu số lượng lớn và tổng thể về đột biến trên toàn bộ gen mã hóa yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, bao gồm tất cả các vùng chức năng, các exon và intron, sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen NGS.
Là công trình nghiên cứu tính đa hình nucleotid trên gen mã hóa yếu tố IX đầu tiên tại Việt Nam, thực hiện nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn, phục vụ chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bệnh hemophilia B 1. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B Theo ghi chép của các sử gia Châu Âu, những ghi nhận đầu tiên về bệnh máu khó đông, tên gọi khác của bệnh hemophilia B đã được đề cập đến từ thế kỷ thứ hai sau công nguyên khi các giáo sỹ Do Thái cổ đại thực hiện thủ thuật cắt bao quy đầu cho các bé trai mới sinh.
Người ta quan sát thấy nhiều em bé bị chảy máu kéo dài dẫn tới tử vong sau khi thực hiện thủ thuật này. Ở thời điểm đó, hiện tượng này chưa được coi là một căn bệnh, cũng chưa được mô tả hay điều trị gì, mà chỉ được xem như một sự nhiễm trùng. Mặc dù vậy, với những hậu quả nghiêm trọng đã xảy ra, quy định cắt bao quy đầu sau đó đã được miễn cho các cậu bé mà tiền sử đã có hai anh trai bị chết vì chảy máu [15] [16]. Vào thế kỷ thứ 10, bác sỹ người Ả Rập, Al-Zahrawi - Albucasis (936-1013), người đầu tiên mô tả về căn bệnh này, đã phát hiện ra ở một số người nam giới có hiện tượng dễ bị chảy máu kéo dài khi gặp chấn thương dù rất nhỏ.
Mặc dù chưa biết nguyên nhân của bệnh nhưng ông đã đặt tên là “bệnh máu”, đồng thời đề xuất phương pháp điều trị là đốt vị trí tổn thương đến khi mạch ngừng chảy máu. Đây được coi là phương pháp điều trị sơ khai đầu tiên của căn bệnh này [15] [16]. Năm 1803, bác sỹ người Mỹ, John Conrad Otto đã công bố kết quả của nghiên cứu “mô tả tình trạng máu khó đông ở một số gia đình” [17]. Trong nghiên cứu, ông đã nhận ra rối loạn này có tính chất di truyền, chỉ người nam giới mới bị và bệnh là do những người phụ nữ không bị bệnh truyền cho các con trai của họ với một tỷ lệ nhất định.
Những phát hiện này định hình cơ bản đặc điểm của một căn bệnh và là tiền đề cho những nghiên cứu vô vùng mạnh mẽ ở thế kỷ 19. Năm 1928, thuật ngữ “hemophilia” với ý nghĩa bệnh ưa chảy máu mới được đề cập lần đầu tiên tại đại học Zurich để mô tả về căn bệnh này [15]. Bệnh hemophilia B bùng nổ vào thế kỷ 19 đến 20 và được xem như một căn bệnh “hoàng gia” khi nhiều hoàng tộc Châu Âu đều mắc bệnh này. Nữ hoàng Anh, Victoria được coi là người đầu tiên mang gen bệnh hemophilia B.
Con trai bà mất do xuất huyết não sau chấn thương 5 ở tuổi 31. Gen bệnh từ hai người con gái của bà đã lan truyền khắp các hoàng tộc như Tây Ban Nha, Đức và Nga. Sự bùng nổ của bệnh hemophilia trong các gia đình hoàng gia lúc bấy giờ đã thúc đẩy mạnh mẽ việc tìm hiểu các kiến thức y học của căn bệnh này [15] [16]. Năm 1952, Rosemary Biggs phát hiện ra bệnh hemophilia B, còn được gọi là bệnh Chrismas (theo họ của bệnh nhân hemophilia B đầu tiên, Stephan Chrismas).
Yếu tố IX đồng thời cũng được gọi là yếu tố Christmas. Các mô hình nghiên cứu điều trị bệnh hemophia B được tập trung nghiên cứu. Các chế phẩm điều trị bệnh hemophilia B được tối ưu qua từng giai đoạn: chế phẩm huyết tương tươi và máu toàn phần (1960), tủa lạnh (1964), yếu tố cô đặc có nguồn gốc huyết tương (từ 1970), yếu tố cô đặc tái tổ hợp (từ 1994 đến nay) [15] [16] [18]. Năm 1963, Liên đoàn hemophilia thế giới được thành lập, cho thấy một sự quan tâm đặc biệt tới căn bệnh này.