Tổng quan luận án

Bệnh hemophilia B (hay bệnh máu khó đông thể B) là một hội chứng rối loạn đông máu di truyền nghiêm trọng, xuất phát từ các đột biến trên gen F9 nằm trên nhiễm sắc thể X (vị trí Xq27.1–Xq27.2) mã hóa yếu tố đông máu IX (FIX). Bệnh chiếm tỷ lệ từ 15% đến 20% trong nhóm bệnh hemophilia với tỷ lệ mắc bệnh được ghi nhận là 1:30. Cơ chế bệnh sinh do các đột biến làm suy giảm hoặc ngừng trệ quá trình sinh tổng hợp protein yếu tố IX, dẫn đến thiếu hụt yếu tố IX và gây ra hiện tượng chảy máu kéo dài sau chấn thương, can thiệp phẫu thuật, nhổ răng hoặc chảy máu tự phát trong các bao cơ khớp và nội tạng, có nguy cơ gây tàn tật vĩnh viễn hoặc tử vong. Do di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, nam giới mang đột biến sẽ biểu hiện bệnh và truyền gen cho 100% con gái (người mang gen bắt buộc), trong khi phụ nữ mang gen có 50% nguy cơ truyền nhiễm sắc thể X mang đột biến cho con trong mỗi lần sinh.

Tại Việt Nam, Trung tâm hemophilia thuộc Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương ước tính cả nước có khoảng 30.000 người mang gen bệnh, song chỉ có khoảng 20% trong số đó được chẩn đoán và quản lý y tế. Hiện tại cơ sở này đang theo dõi và điều trị cho hơn 400 bệnh nhân hemophilia B (tương đương 40% tổng số bệnh nhân toàn quốc), với hàng trăm ca bệnh mới được phát hiện hằng năm. Khoảng trống nghiên cứu lớn đặt ra là Việt Nam chưa từng có nghiên cứu hệ thống nào khảo sát các đa hình nucleotide trên gen F9 để phục vụ chẩn đoán người mang gen bằng phân tích liên kết. Các nghiên cứu về đột biến gen F9 trước đây chỉ được tiến hành trên cỡ mẫu rất nhỏ (như nghiên cứu của Nguyễn Thị Băng Sương trên 1 gia đình gồm 2 bệnh nhân và 3 phụ nữ; nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi đồng 1 trên 23 bệnh nhân) bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger truyền thống. Phương pháp Sanger chi phí cao, không phân tích đồng thời được nhiều mẫu và có nguy cơ bỏ sót 5% đến 10% các tổn thương di truyền nằm ở vùng intron hoặc vùng điều hòa phiên mã.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể:

  1. Mục tiêu 1: Lập bản đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX của bệnh nhân hemophilia B.
  2. Mục tiêu 2: Khảo sát để xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm cơ sở để chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết.

Các nhiệm vụ cụ thể được đánh số trong đề tài gồm:

  • Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX trên máy giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS): thiết kế các cặp mồi gối đầu khuếch đại toàn bộ gen F9, tối ưu quy trình Long-range PCR, xây dựng quy trình giải trình tự NGS và khẳng định độ tin cậy bằng phương pháp giải trình tự Sanger.
  • Giải trình tự gen F9 và lập bản đồ đột biến ở 100 bệnh nhân hemophilia B; khảo sát mối tương quan giữa kiểu gen đột biến và tình trạng bệnh ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu.
  • Giải trình tự gen F9 ở 100 người phụ nữ khỏe mạnh; xác định tần suất alen và tỷ lệ dị hợp tử của các đa hình nucleotide trên gen F9.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Gồm 100 bệnh nhân nam mắc hemophilia B không có quan hệ huyết thống, có nồng độ yếu tố IX hoạt tính dưới 40% (mã số HB01 đến HB100); 100 người phụ nữ khỏe mạnh tham gia hiến máu, không có tiền sử chảy máu gia đình (mã số NK01 đến NK100); 23 người phụ nữ mang gen F9 bệnh đã được xác định theo tiêu chuẩn phả hệ (mã số MG01 đến MG23) dùng để đánh giá hiệu quả của bộ đa hình; và 10 mẫu bệnh nhân được chọn để giải trình tự song song bằng hai phương pháp Sanger và NGS nhằm đánh giá độ tin cậy.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương; thời gian thu thập mẫu bệnh phẩm từ tháng 11/2016 đến tháng 12/2018.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Lịch sử y học ghi nhận các mô tả đầu tiên về bệnh máu khó đông từ thế kỷ thứ hai sau Công nguyên qua các ghi chép miễn thủ thuật cắt bao quy đầu của các giáo sĩ Do Thái đối với các bé trai có hai anh trai tử vong vì xuất huyết. Đến thế kỷ thứ 10, bác sĩ Al-Zahrawi - Albucasis (936–1013) là người đầu tiên mô tả bệnh ở nam giới và đề xuất biện pháp đốt nhiệt cầm máu. Năm 1803, bác sĩ người Mỹ John Conrad Otto công bố công trình nghiên cứu chứng minh tính chất di truyền liên kết dòng mẹ của bệnh. Thuật ngữ "hemophilia" chính thức được sử dụng năm 1928 tại Đại học Zurich. Bệnh lây lan trong nhiều hoàng tộc Châu Âu thông qua các hậu duệ của Nữ hoàng Anh Victoria. Năm 1952, Rosemary Biggs phát hiện thể bệnh hemophilia B (còn gọi là bệnh Christmas, đặt theo tên bệnh nhân Stephan Christmas). Năm 1963, Liên đoàn Hemophilia Thế giới được thành lập và hiện có 97 quốc gia thành viên. Trình tự toàn bộ gen F9 dài xấp xỉ 34 kb bao gồm 8 exon và 7 intron được Yoshitake và cộng sự công bố hoàn chỉnh vào năm 1985. Năm 1970, Veltkamp và cộng sự công bố kiểu hình hemophilia B Leyden.

Cơ sở dữ liệu quốc tế về đột biến gen F9 do Giannelli và cộng sự khởi xướng năm 1990 với 216 đột biến ban đầu. Đến năm 2013, phân tích của Rallapalli và cộng sự trên cơ sở dữ liệu gồm 3.721 bệnh nhân ghi nhận 1.113 đột biến khác nhau, trải rộng trên 73% (336/461) các axit amin của phân tử protein yếu tố IX. Nghiên cứu này cũng ghi nhận 59 ca (chiếm 1,6%) sinh kháng thể kháng yếu tố IX (chất ức chế), trong đó 27 ca mang đột biến mất đoạn lớn và 20 ca mang đột biến vô nghĩa. Đánh giá về mối liên quan giữa kiểu đột biến và nguy cơ tạo chất ức chế, Claudia Pamela Radic và cộng sự (2013) chỉ ra đột biến vô nghĩa p.W240* làm tăng nguy cơ sinh chất ức chế gấp 11 lần, và đột biến mất toàn bộ gen F9 làm tăng nguy cơ gấp 32 lần. Tengguo Li và cộng sự (2013, 2014) khảo sát 226 bệnh nhân tại Mỹ, phát hiện 87 loại đột biến (đột biến điểm chiếm 86%), trong đó toàn bộ 39 bệnh nhân sinh chất ức chế đều mang đột biến vô nghĩa hoặc đột biến mất đoạn.

Nghiên cứu về cơ chế đột biến tự phát của Montandon và cộng sự trên quần thể Thụy Điển ghi nhận tỷ lệ phát sinh đột biến ở giao tử nam so với nữ là 11:1. Bên cạnh các điểm nóng đột biến tại đảo CpG do quá trình khử amin 5-methylcytosine, các đột biến do hiệu ứng sáng lập (founder effect) cũng được xác nhận tại nhiều khu vực: đột biến Ile443T ở Bắc Mỹ (Thomson và cộng sự, 1990); c.17781 A>G tại Anh; g.-35 G>A và Ala317Val tại Ireland. Nhiều nghiên cứu dịch tễ phân tử quy mô lớn đã được công bố trên thế giới: Belvini và cộng sự (2005) tại Ý (238 bệnh nhân, 137 đột biến, 36,5% đột biến mới); Tagariello và cộng sự (2007) tại Ý (306 bệnh nhân); Pauline BalRaj và cộng sự (2012) tại Malaysia (16 bệnh nhân, 8 loại đột biến, ghi nhận đột biến mới 6660-6664delTTCTT); V. Surin (2016) tại Nga (56 bệnh nhân, 46 đột biến, 11 đột biến mới, đột biến sai nghĩa chiếm 30/46); Wang và cộng sự (2016) tại Trung Quốc (23 bệnh nhân, 19 đột biến điểm); dự án My Life, Our Future (2017) tại Mỹ (599 bệnh nhân thể B, phát hiện 217 đột biến trên 595 người, 25,3% đột biến mới, đột biến sai nghĩa chiếm 87,1%); Muhammad và cộng sự (2018) tại Pakistan (34 bệnh nhân, 17 đột biến, đột biến điểm chiếm 88,2%); và chương trình quốc gia Canada (267 bệnh nhân thể B, 125 đột biến, 28,8% đột biến mới).

Về nghiên cứu đa hình nucleotide, Graham JB và cộng sự (1985) phát hiện đa hình Malmo (MnlI) tại exon 6 làm biến đổi threonin thành alanin ở vị trí 148. Winship và cộng sự công bố đa hình HhaI ở đầu 3' (1989) và đa hình MseI ở đầu 5' (1993). Phân tích liên kết phụ thuộc chặt chẽ vào đặc điểm chủng tộc: Goodeve và cộng sự (1994) ghi nhận đa hình MseI đạt tỷ lệ dị hợp tử 43% ở người Thái Lan; Mitchell và cộng sự (2007) tại Nam Phi phối hợp MseI cùng hai chỉ thị vi vệ tinh đạt hiệu quả 89%; Shin JS và cộng sự (2010) tại Hàn Quốc ghi nhận các đa hình SalI, NruI, HhaI đạt hiệu quả chẩn đoán 71%, trong khi XmnI, DdeI, TaqI không có giá trị thông tin. Tại Việt Nam, một khảo sát sơ bộ năm 2018 tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương trên 159 người khỏe mạnh cho thấy MseI và HhaI có tỷ lệ dị hợp tử lần lượt là 40,95% và 31,5%, trong khi XmnI, TaqI, DdeI đồng hợp tử gần 100%. Luận án định vị vai trò giải quyết khoảng trống dữ liệu di truyền người Việt bằng cách ứng dụng kỹ thuật giải trình tự NGS bao phủ toàn bộ gen F9 trên cỡ mẫu 100 bệnh nhân và thiết lập bộ đa hình phục vụ chẩn đoán liên kết.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Về cơ sở lý thuyết, quá trình đông máu diễn ra qua con đường nội sinh và ngoại sinh. Phức hợp yếu tố mô và yếu tố VII hoạt hóa (TF/FVIIa) cùng với yếu tố XIa hoạt hóa yếu tố IX thành yếu tố IX hoạt hóa (FIXa). FIXa đóng vai trò là một serin protease, kết hợp với yếu tố VIIIa và phospholipid màng tiểu cầu tạo thành phức hợp tenase hoạt hóa yếu tố X thành Xa. Xa cùng Va tạo phức hợp prothrombinase chuyển prothrombin thành thrombin, từ đó chuyển fibrinogen thành mạng lưới fibrin giữ các tế bào máu để cầm máu. Yếu tố IX huyết tương có nồng độ 90 nM, trọng lượng phân tử 57 kDa. Gen F9 dài xấp xỉ 34–35 kb, phiên mã ra phân tử mRNA dài 2.803 nucleotide gồm vùng 5'UTR (29 bp), khung đọc mở (1.383 bp) và vùng 3'UTR (1.390 bp). Protein tiền chất gồm 461 axit amin: peptide tín hiệu (28 axit amin), propeptide (18 axit amin) và protein trưởng thành (415 axit amin) chia làm 5 domain chức năng: GLA, EGF1, EGF2, peptide hoạt hóa (AP) và domain xúc tác (CAT/SP). Quá trình hoạt hóa FIX diễn ra khi phân tử bị cắt tại vị trí Arg145 và Arg180 giải phóng peptide 35 axit amin, tạo thành chuỗi nhẹ (chứa domain GLA, EGF1, EGF2) và chuỗi nặng (chứa domain xúc tác), nối với nhau bằng cầu disulphide giữa Cys132 và Cys279.

Dựa vào nồng độ yếu tố IX hoạt tính trong huyết tương, bệnh chia làm 3 mức độ:

  • Mức độ nặng: Yếu tố IX < 1%, biểu hiện chảy máu khớp, cơ tự phát.
  • Mức độ trung bình: Yếu tố IX từ 1% đến 5%, chảy máu sau chấn thương hoặc phẫu thuật nhỏ.
  • Mức độ nhẹ: Yếu tố IX > 5% đến < 40%, chỉ chảy máu sau phẫu thuật lớn hoặc chấn thương nặng.

Phương pháp nghiên cứu được thiết kế theo mô hình nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích. Cỡ mẫu nghiên cứu đa hình nucleotide được tính toán theo công thức Leslie Kish:

$$n = \frac{(Z_{1-\alpha/2})^2 \cdot p(1-p)}{D^2}$$

Trong đó, độ tin cậy được chọn là 95% ($\alpha = 0,05$ tương ứng $Z_{1-\alpha/2} = 1,96$); tần số dị hợp tử lý thuyết theo công bố quốc tế $p = 0,44$; độ sai lệch cho phép so với quần thể $D = 0,1$ (10%). Công thức cho kết quả cỡ mẫu tối thiểu là 95 mẫu; nghiên cứu thực tế thu thập 100 mẫu người nữ khỏe mạnh.

Quy trình kỹ thuật và nguồn tư liệu thực nghiệm:

  • Tách chiết ADN tổng số từ 2 ml máu ngoại vi chống đông EDTA bằng bộ kit QIAamp DNA Mini (Qiagen).
  • Kỹ thuật Long-range PCR: Sử dụng 8 cặp mồi gối đầu đặc hiệu do IDT tổng hợp để khuếch đại toàn bộ gen F9 dài 35 kb, dùng hóa chất 2x Q5 HiFi Mastermix (NEB) hoặc Longrange PCR kit (Qiagen). Kiểm tra sản phẩm qua điện di gel agarose với dung dịch TBE 5X, RedSafe và thang chuẩn 100 bp ladder.
  • Kỹ thuật giải trình tự NGS: Sử dụng bộ kit Nextera XT library prep (chuẩn bị thư viện, gắn adapter và index phân biệt mẫu), định lượng bằng Qubit dsDNA HS assay kit, làm sạch bằng hạt từ Agencourt AMPure XP và giải trình tự trên hệ thống Illumina MiSeq với bộ hóa chất MiSeq reagent kit v2 (300 cycles PE).
  • Kỹ thuật giải trình tự Sanger: Dùng để đối chiếu, kiểm chứng 10 mẫu với NGS theo phác đồ của Vidal và cộng sự (2000), khuếch đại 8 exon, các vùng nối exon-intron, vùng promoter 5' và vùng polyA 3'. Tinh sạch bằng ExoSAP-IT, phản ứng đọc trình tự bằng BigDye Terminator v3.1, tinh sạch bằng BigDye XTerminator và phân tích mao quản trên máy Applied Biosystems 3500 Series Genetic Analyzer dùng polymer POP-7.
  • Kỹ thuật MLPA: Sử dụng bộ kit SALSA MLPA P207 F9 (MRC Holland) gồm 9 probe đặc hiệu (exon 8 có 2 probe) để phát hiện và xác nhận đột biến mất đoạn hoặc lặp đoạn lớn ở những mẫu không khuếch đại được sản phẩm PCR.
  • Phương pháp phân tích liên kết: Dựa trên kỹ thuật PCR-RFLP cắt sản phẩm bằng enzym giới hạn hoặc giải trình tự Sanger/AS-PCR để xác định sự phân ly của các alen đa hình nội gen trong gia đình bệnh nhân.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Nội dung chương trình bày chi tiết về bệnh sinh học, dịch tễ học và các tiến bộ trong chẩn đoán, điều trị hemophilia B. Văn bản hệ thống hóa toàn bộ các giai đoạn phát triển của liệu pháp thay thế protein từ huyết tương tươi (1960), tủa lạnh (1964), yếu tố cô đặc từ huyết tương (từ 1970) đến các yếu tố tái tổ hợp (từ 1994) và các thử nghiệm lâm sàng liệu pháp gen (công trình của Nathwani theo dõi 6 năm, George theo dõi 52 tuần với biến thể F9 Padua).

Chương phân tích sâu cấu trúc phân tử của gen F9 và phân loại các biến đổi di truyền: đột biến thay thế đơn nucleotide (chiếm 64% tổng số đột biến; gồm đột biến sai nghĩa nhóm I làm giảm số lượng protein, nhóm II làm suy giảm chức năng; đột biến vô nghĩa; đột biến vị trí cắt nối splicing chiếm 9%); đột biến mất đoạn/chèn đoạn nhỏ (chiếm 18%); các bất thường di truyền lớn như mất đoạn lớn hoặc sắp xếp lại gen (chiếm 3% đến 5%); các đột biến do hiệu ứng sáng lập; và các đột biến vùng promoter dẫn đến thể hemophilia B Leyden (liên quan đến 21 đột biến điểm phá vỡ vị trí gắn của 3 yếu tố phiên mã HNF4α, C/EBPα và OCT1/2 trong giai đoạn trước tuổi dậy thì). Phần đa hình nucleotide phân tích chi tiết khái niệm đa hình có thông tin, cân bằng và mất cân bằng liên kết, các đa hình nội gen (Malmo/MnlI, HhaI, MseI, BamHI, XmnI, TaqI, MspI) cùng hai vùng lặp vi vệ tinh (RY)n tại intron 1 và exon 8.

Bảng 1: Kích thước các exon và intron trên gen F9 ở người (trích xuất từ văn bản)

Exon Kích thước exon (bp) Intron Kích thước intron (bp)
Exon 1 117 Intron 1 6206
Exon 2 164 Intron 2 188
Exon 3 25 Intron 3 3689
Exon 4 114 Intron 4 7163
Exon 5 129 Intron 5 2565
Exon 6 203 Intron 6 9473
Exon 7 115 Intron 7 668
Exon 8 1935 - -

Bảng 2: Tần suất alen của một số chỉ thị đa hình trong các quần thể khác nhau (trích xuất từ văn bản)

Vị trí Đa hình Alen Người da trắng Nhật Bản Trung Quốc Người Mỹ da đen
5' BamHI +
-		 0,02
0,98		 -
1		 0
1		 0,36
0,64
Intron 3 XmnI +
-		 0,29
0,71		 0
1		 0,01
0,99		 0,12
0,88
Intron 3 BamHI +
-		 0,06
0,94		 -
-		 0,02
0,98		 0,13
0,87
Intron 4 TaqI +
-		 0,35
0,65		 0
1		 0,01
0,99		 0,14
0,86
Intron 4 MspI +
-		 0,80
0,20		 0
1		 0
1		 0,61
0,39
Exon 6 MnlI +
-		 0,33
0,67		 -
-		 0,03
0,97		 0,11
0,89
3' HhaI +
-		 0,61
0,39		 0,24
0,76		 0,17
0,83		 0,57
0,43

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết tiêu chuẩn chọn lựa và tiêu chuẩn loại trừ của 3 nhóm đối tượng nghiên cứu. Quy trình nghiên cứu gồm 4 bước liên hoàn:

  • Bước 1: Thu thập mẫu máu chống đông EDTA, tách chiết ADN tổng số và kiểm tra độ tinh sạch.
  • Bước 2: Thiết lập hệ thống Long-range PCR sử dụng 8 cặp mồi gối đầu bao phủ toàn bộ 35 kb gen F9, tối ưu hóa quy trình giải trình tự NGS trên máy Illumina MiSeq. Kiểm chứng độ tin cậy bằng cách đối chiếu kết quả của 10 mẫu bệnh nhân được phân tích song song bằng phương pháp giải trình tự Sanger theo quy chuẩn quốc tế của Vidal và cộng sự (2000).
  • Bước 3: Phân tích trình tự gen F9 ở 100 bệnh nhân hemophilia B; xử lý các mẫu nghi ngờ mất đoạn lớn không khuếch đại được bằng kỹ thuật SALSA MLPA P207 F9; thiết lập bản đồ đột biến và đối chiếu mối tương quan giữa kiểu gen đột biến với mức độ bệnh lâm sàng (dựa trên hoạt tính yếu tố IX <1%, 1-5%, và >5% đến <40%).
  • Bước 4: Giải trình tự toàn bộ gen F9 ở 100 phụ nữ khỏe mạnh; xử lý tin sinh học phân tích tần số alen trên dữ liệu của 200 cá thể (100 bệnh nhân và 100 người khỏe mạnh); xác định tỷ lệ dị hợp tử thực tế trên 100 phụ nữ khỏe mạnh; lựa chọn các đa hình có giá trị thông tin cao để thiết lập bộ chỉ thị; và đánh giá khả năng ứng dụng thực tế của bộ chỉ thị đa hình này trên 23 người phụ nữ mang gen hemophilia B. Toàn bộ danh mục hóa chất, bộ kit chuẩn bị thư viện, hóa chất giải trình tự và thiết bị phân tích mao quản được mô tả đầy đủ quy cách, nguồn gốc sản xuất.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Căn cứ vào dữ liệu văn bản, kết quả nghiên cứu triển khai theo 3 nội dung trọng tâm:

  1. Xây dựng và kiểm định quy trình công nghệ: Thiết kế thành công 8 cặp mồi gối đầu khuếch đại hoàn chỉnh gen F9 dài 35 kb bằng kỹ thuật Long-range PCR; hoàn thiện quy trình giải trình tự gen thế hệ mới NGS trên hệ thống MiSeq. Kết quả đối chiếu phân tích đột biến trên 10 mẫu bệnh nhân bằng cả hai phương pháp NGS và Sanger cho thấy sự tương đồng hoàn toàn, khẳng định quy trình NGS đạt độ chính xác cần thiết để ứng dụng trên diện rộng.
  2. Bản đồ đột biến gen F9 ở 100 bệnh nhân hemophilia B: Dữ liệu NGS và MLPA xác định đầy đủ các dạng tổn thương di truyền bao gồm đột biến điểm (đột biến sai nghĩa, vô nghĩa, cắt nối), các vi mất đoạn/chèn đoạn và đột biến mất đoạn gen lớn; xác lập mối tương quan giữa tổn thương kiểu gen và mức độ bệnh trên lâm sàng ở nhóm 100 bệnh nhân nghiên cứu.
  3. Đặc điểm đa hình nucleotide và bộ chỉ thị chẩn đoán: Phân tích tần số alen từ 200 bộ dữ liệu giải trình tự và tỷ lệ dị hợp tử từ 100 phụ nữ khỏe mạnh. Kết quả khẳng định đặc tính chủng tộc của các đa hình tại Việt Nam, ghi nhận các đa hình có giá trị thông tin cao (như MseI, HhaI) và loại trừ các đa hình gần như đồng hợp tử hoàn toàn (XmnI, TaqI, DdeI). Ứng dụng kiểm chứng bộ đa hình trên 23 phụ nữ mang gen bệnh (MG01–MG23) chứng minh hiệu quả thực tế của phương pháp phân tích liên kết trong việc xác định tình trạng mang gen.

Chương 4: Bàn luận

Chương này tập trung bàn luận về các luận điểm chuyên môn:

  • So sánh hiệu quả kỹ thuật: Giải trình tự NGS chứng minh tính ưu việt về hiệu năng xử lý mẫu lớn, độ bao phủ toàn diện cả các vùng exon, intron và các vùng điều hòa, khắc phục nhược điểm tốn kém và nguy cơ bỏ sót tổn thương của phương pháp giải trình tự Sanger.
  • Phổ đột biến và đặc trưng phân tử: Đánh giá tỷ lệ đột biến điểm, đột biến mất đoạn so với các công bố quốc tế lớn (như dự án MLOF tại Mỹ, các nghiên cứu tại Ý, Nga, Canada). Bàn luận về nguy cơ xuất hiện kháng thể ức chế ở bệnh nhân mang đột biến vô nghĩa và mất đoạn lớn trên cơ sở các công bố của Rallapalli, Claudia Pamela Radic và Tengguo Li.
  • Giá trị của bộ đa hình quần thể: Phân tích sự khác biệt về tần số alen giữa người Việt Nam với người da trắng, người Mỹ da đen, người Trung Quốc và Nhật Bản. Luận điểm nhấn mạnh sự cần thiết phải khảo sát thực nghiệm trên quần thể bản địa thay vì áp dụng trực tiếp các bộ đa hình ngoại lai, nhằm tránh sai sót trong tư vấn di truyền do hiện tượng đồng hợp tử hoặc mất cân bằng liên kết.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án công bố hai đóng góp mới:

  1. Là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu số lượng lớn và tổng thể về đột biến trên toàn bộ gen mã hóa yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, bao gồm tất cả các vùng chức năng, các exon và intron, sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS).
  2. Là công trình nghiên cứu tính đa hình nucleotide trên gen mã hóa yếu tố IX đầu tiên tại Việt Nam, thực hiện nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn, phục vụ chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết.

Về mặt ứng dụng và đề xuất giải pháp, công trình cung cấp cơ sở dữ liệu đột biến gen F9 cho 100 bệnh nhân hemophilia B, làm cơ sở khoa học để thiết lập phác đồ phân tử chẩn đoán trực tiếp bằng NGS/Sanger kết hợp kỹ thuật MLPA để tầm soát mất đoạn lớn. Đồng thời, nghiên cứu đề xuất ứng dụng bộ chỉ thị đa hình nucleotide đặc trưng cho người Việt Nam để triển khai kỹ thuật chẩn đoán gián tiếp (phân tích liên kết) chi phí thấp tại các cơ sở y tế trong nước, hỗ trợ công tác tư vấn tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh nhằm kiểm soát nguồn gen bệnh trong cộng đồng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Kỹ thuật giải trình tự gen NGS không thể tự phát hiện được các đột biến mất đoạn lớn (chiếm khoảng 3% đến 5% trường hợp), do đó bắt buộc phải thực hiện thêm kỹ thuật MLPA để bổ khuyết khi phản ứng PCR không khuếch đại được sản phẩm.
  • Nhóm đối tượng bệnh nhân và người khỏe mạnh được thu thập tập trung tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, mặc dù đây là trung tâm lớn nhất cả nước quản lý 40% bệnh nhân nhưng vẫn mang tính chất đại diện của một trung tâm điều trị.
  • Phương pháp chẩn đoán gián tiếp bằng phân tích liên kết chỉ áp dụng được khi thu thập đầy đủ mẫu bệnh phẩm của các thành viên liên quan trong gia đình (bố, mẹ, bệnh nhân) và người phụ nữ phải ở trạng thái dị hợp tử với đa hình được khảo sát.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Đưa quy trình giải trình tự gen thế hệ mới và bộ chỉ thị đa hình đã thiết lập vào quy trình xét nghiệm thường quy tại các trung tâm huyết học và di truyền lâm sàng.
  • Ứng dụng dữ liệu đột biến gen để theo dõi dọc, đánh giá nguy cơ phát sinh chất ức chế yếu tố IX trên các bệnh nhân mang đột biến vô nghĩa hoặc mất đoạn lớn trong quá trình điều trị bằng liệu pháp thay thế protein.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho nhiều nhóm chuyên môn:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Huyết học – Truyền máu, Di truyền Y học: Tài liệu cung cấp bức tranh tổng thể về cơ chế phân tử, sinh lý học đông máu của yếu tố IX, cấu trúc gen F9 và các cơ chế biến đổi di truyền chi tiết từ mức độ nucleotide đến domain protein.
  • Chuyên viên phòng xét nghiệm sinh học phân tử: Có thể tham khảo trực tiếp thông số kỹ thuật của 8 cặp mồi gối đầu khuếch đại đoạn gen dài 35 kb, quy trình tối ưu Long-range PCR, quy trình chuẩn bị thư viện NGS trên nền tảng Illumina MiSeq, kỹ thuật MLPA với bộ kit SALSA P207 và quy trình kiểm chứng bằng giải trình tự Sanger theo chuẩn Vidal (2000).
  • Bác sĩ lâm sàng và cán bộ tư vấn di truyền: Cung cấp bằng chứng thực tiễn về mối tương quan giữa kiểu gen và mức độ bệnh, hướng dẫn chiến lược phối hợp linh hoạt giữa phân tích trực tiếp và phân tích liên kết gián tiếp để chẩn đoán người mang gen và chẩn đoán trước sinh cho các gia đình có tiền sử bệnh.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao chẩn đoán người mang gen được xem là biện pháp hữu hiệu và duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh hemophilia B? Do bệnh di truyền gen lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, người nam mắc bệnh sẽ truyền gen đột biến cho toàn bộ con gái, và người phụ nữ mang gen có 50% nguy cơ truyền nhiễm sắc thể bệnh cho con trong mỗi lần sinh. Hiện tại các liệu pháp điều trị chủ yếu là bổ sung yếu tố IX thiếu hụt mà không thay đổi được gen di truyền trong cơ thể người bệnh. Với ước tính khoảng 30.000 người mang gen tại Việt Nam nhưng chỉ 20% được quản lý, việc chẩn đoán sớm người mang gen để tư vấn tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh là cách tiếp cận duy nhất ngăn chặn sự lan truyền gen bệnh trong cộng đồng.

  2. Kỹ thuật MLPA đóng vai trò gì và có nguyên lý như thế nào trong nghiên cứu gen F9? Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) được sử dụng để phát hiện các mất đoạn hoặc lặp đoạn gen lớn (chiếm 3% đến 5% đột biến gen F9) mà các phương pháp giải trình tự gen thông thường không phát hiện được. Kỹ thuật sử dụng bộ kít SALSA MLPA P207 F9 gồm 9 probe gắn đặc hiệu với các exon của gen F9 (riêng exon 8 có 2 probe do kích thước lớn). Sau phản ứng nối (ligation), các probe được khuếch đại đồng thời bằng một cặp mồi duy nhất có gắn huỳnh quang và điện di mao quản. Số lượng bản sao gen được định lượng thông qua chiều cao của đỉnh tín hiệu so với mẫu tham chiếu.

  3. Nhóm đột biến nào trên gen F9 có liên quan chặt chẽ nhất đến nguy cơ sinh chất ức chế kháng yếu tố IX? Các số liệu dịch tễ học phân tử quốc tế cho thấy nguy cơ hình thành chất ức chế tập trung chủ yếu ở nhóm bệnh nhân mang đột biến vô nghĩa (nonsense) và đột biến mất đoạn lớn. Phân tích của Rallapalli trên 3.713 bệnh nhân ghi nhận 59 ca có chất ức chế thì có 27 ca mất đoạn lớn và 20 ca đột biến vô nghĩa. Nghiên cứu của Claudia Pamela Radic chỉ ra đột biến vô nghĩa p.W240* làm tăng nguy cơ sinh chất ức chế gấp 11 lần, và mất toàn bộ gen F9 làm tăng nguy cơ gấp 32 lần. Tengguo Li khảo sát 226 bệnh nhân tại Mỹ cũng xác nhận toàn bộ 39 ca có chất ức chế đều mang hai loại đột biến này.

  4. Đặc điểm phân tử và biểu hiện lâm sàng đặc biệt của thể bệnh hemophilia B Leyden là gì? Hemophilia B Leyden chiếm khoảng 3% tổng số bệnh nhân, đặc trưng bởi sự thiếu hụt yếu tố IX nghiêm trọng khi mới sinh (nồng độ <1%), nhưng nồng độ yếu tố IX tăng dần từ tuổi thứ 10 và đạt mức gần như bình thường sau tuổi 20, giúp bệnh nhân không cần điều trị thường quy ở tuổi trưởng thành. Cơ chế phân tử do các đột biến điểm nằm trong vùng promoter của gen F9 làm phá hủy vị trí gắn của các nhân tố phiên mã gan (HNF4α, C/EBPα, OCT1/2) trong thời thơ ấu; khi bước vào tuổi dậy thì, các yếu tố phiên mã đáp ứng hormon androgen bắt đầu hoạt động bù trừ, kích thích tăng cường phiên mã gen F9.

  5. Sự khác biệt về tần số alen của các chỉ thị đa hình nucleotide giữa người Việt Nam và các chủng tộc khác có ý nghĩa gì đối với chẩn đoán liên kết? Tần số alen mang tính đặc trưng chủng tộc cao. Các đa hình có giá trị thông tin cao ở người da trắng hoặc người Mỹ da đen như XmnI, TaqI, DdeI khi khảo sát tại Việt Nam (năm 2018 trên 159 người) lại có tỷ lệ đồng hợp tử gần 100%, đồng nghĩa với việc không mang giá trị thông tin chẩn đoán. Ngược lại, đa hình MseI (tỷ lệ dị hợp tử 40,95%) và HhaI (31,5%) có giá trị thông tin tốt. Do đó, việc xác định tần số alen và tỷ lệ dị hợp tử riêng cho quần thể người Việt là điều kiện bắt buộc để lựa chọn đúng bộ đa hình chỉ thị, đảm bảo độ chính xác cho phân tích liên kết.

Kết luận

Luận án tiến sĩ đã giải quyết thành công các vấn đề học thuật và thực tiễn trong chẩn đoán di truyền bệnh hemophilia B tại Việt Nam thông qua việc thiết lập quy trình giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) bao phủ toàn bộ 35 kb gen F9. Công trình đã hoàn thành việc xây dựng bản đồ đột biến gen trên 100 bệnh nhân và xác lập bộ chỉ thị đa hình nucleotide đặc trưng dựa trên khảo sát tần số alen và tỷ lệ dị hợp tử ở 100 phụ nữ khỏe mạnh. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học để kết hợp linh hoạt phương pháp phân tích đột biến trực tiếp và phân tích liên kết gián tiếp, phục vụ hiệu quả công tác chẩn đoán người mang gen, chẩn đoán trước sinh và quản lý nguồn gen bệnh hemophilia B.