CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về đoạn lặp ngắn ngẫu nhiên – STR 1. Short tandem repeat – STR 1.
STR là gì ADN đã được ứng dụng trong thực tế nghiên cứu pháp y từ thế kỉ XX, đi cùng với sự phát triển của công nghệ giải mã hệ gen người. Trong công tác giám định pháp y, dấu hiệu sinh học dựa trên ADN cung cấp rất nhiều thông tin đặc biệt quan trọng và cũng là một bước nhảy của khoa học hình sự. ADN mang những đặc điểm hóa sinh ưu thế khi mà các dấu vết sinh học khác còn có thể thu thập được ở hiện trường thường rất ít, bị phân hủy nhanh chóng và tiêu tốn thời gian. Hàng nghìn vụ án đã được đưa ra ánh sáng với sự hỗ trợ đắc lực của công nghệ giám định ADN.
Hiện nay, đối với giám định ADN trong khoa học hình sự cả trong và ngoài nước thì các chỉ thị short tandem repeats (STR) được sử dụng rất phổ biến do dựa trên phản ứng khuếch đại gen – polymerase chain reaction (PCR), có độ đặc hiệu cao cũng như cho phép thực hiện đối với Hình 1.1 Các locus thuộc bộ CODIS của FBI và vị trí trên NST người luan an 6 các loại mẫu phức tạp. Điển hình các tổ chức lớn như FBI (Federal Bureau of Investigation) đã công bố quy trình thường quy cho sử dụng 13 locus STR (CODIS) (Hình 1.1) hay Interpol cũng xác định bộ 10 locus STR chuẩn cho nước Anh và các nước Châu Âu cho công tác giám định xác định danh tính. Tại Việt Nam, việc sử dụng STR trong công tác giám định xác định danh tính cũng được sử dụng thường quy tại các viện Pháp y trong cả nước. STR là đoạn trình tự đa hình nằm trong vùng không mã hóa, có cấu trúc gồm các đoạn lặp lại của một trình tự nt có độ dài khoảng 2 – 7 bp, chiếm khoảng 3% hệ gen người.
Do nằm ngoài vùng mã hóa, các STR rất đa dạng giữa người với người về độ dài (có thể lên đến hàng nghìn base), trình tự đoạn lặp mà không ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của tế bào. Các đoạn lặp lại này nằm rải rác ở khắp nơi trong hệ gen của người. Từ những năm 1990 đến nay đã có hàng chục nghìn STR trên các nhiễm sắc thể (NST) được phát hiện. Trong quá trình phân bào, các đoạn STR này không bị phân cắt, chúng có tính bảo thủ cao.
Ngoại trừ trường hợp song sinh cùng trứng, số lượng lặp lại của các STR là độc nhất cho từng cá thể, được di truyền từ bố mẹ sang con cái và phân biệt các cá thể không có quan hệ huyết thống trực hệ. Do đó các cá thể này sẽ mang bộ số lượng đoạn lặp lại khác nhau của các STR [1], [2]. Bộ chỉ thị gồm nhiều các STR nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau cho phép phân biệt các cá thể riêng biệt, ngay cả với những cá thể có quan hệ họ hàng gần gũi. Đối với nghiên cứu di truyền quần thể, cơ sở di truyền của nghiên cứu dựa trên hai định luật căn bản của di truyền học Mendel đó là định luật di truyền phân ly độc lập và định luật di truyền phân ly.
Do đó, các chỉ số về di truyền liên kết cân bằng và cân bằng Hardy-Weinberg được kiểm định đồng thời các phép tính thống kê được sử dụng nhằm tăng tính chính xác, giảm sai số trong phân tích [11]. Trong giám định hình sự, xác định danh tính có thể được hiểu là sự so sánh hồ sơ ADN của một người nào đó, lấy từ mẫu sinh học vương lại hoặc từ luan an 7 các dấu vết như vết máu tại hiện trường của một vụ án với một người khác có mối liên quan nhằm xác định danh tính hoặc loại trừ khả năng. Phân loại và danh pháp STR được phân loại dựa trên số lượng nucleotide được lặp lại, ví dụ dinucleotide cho 2 nucleotide, trinucleotide cho 3 nucleotide… Tuy nhiên, STR cũng có thể phân loại bằng một vài cách khác dựa trên tính phức tạp của trình tự lặp lại. Các STR đơn giản là các STR cấu thành bởi sự lặp lại của một trình tự nucleotide (ví dụ (GATA)n) hay STR phức là các đoạn được cấu thành bởi sự lặp lại của 2 hoặc nhiều hơn trình tự nucleotide (ví dụ (CG)m– (CA)n).
Danh pháp hay tên của từng đoạn STR được đặt theo tên của gen nếu locus này nằm một phần hoặc nằm toàn bộ trong gen. Ví dụ chỉ thị STR TH01 có nguồn gốc từ tên gen tổng hợp enzym tyrosine hydroxylase của người, nằm trên NST số 11. Chữ "TH" xuất phát từ chữ cái đầu tyrosine hydroxylase. Phần "01" của ký hiệu "TH01" xuất phát từ vùng intron 1 của gen tổng hợp enzym tyrosine hydroxylase.
Các trình tự ADN nằm ngoài vùng gen thì được xác định tên bằng vị trí của chúng trên NST. Ví dụ như locus D5S818 hay DYS19 là các locus nằm ngoài vùng gen mã hóa, chữ “D” kí hiệu cho ADN, các kí hiệu tiếp theo lần lượt là NST số 5/ Y cho NST Y; “S” có nghĩa là trình tự chỉ có một bản copy trên genome; con số cuối tên là thứ tự chỉ thị này được phát hiện và sắp xếp theo từng NST cụ thể. Các chỉ thị STR thiết yếu Đối với công tác giám định, việc sử dụng một bộ các chỉ thị theo một tiêu chuẩn là cần thiết vì sự chính xác và đồng nhất của các kết quả giám định. Bộ các chỉ thị được sử dụng rộng rãi ngày nay đã được nghiên cứu và phát triển ở phòng thí nghiệm của tiến sĩ Thomas Caskey tại Trường đại học Y khoa luan an 8 Baylor cùng với viện Forensic Science Service tại Anh thực hiện vào đầu những năm 1990.
Những chỉ thị này được sử dụng nhiều hơn trong các kit xét nghiệm của hãng Promega (Mỹ) so với kit của hãng Applied Biosystems (Mỹ). Bộ kit thương mại được đưa ra thị trường đầu tiên được giới thiệu bởi hãng Promega năm 1994. Đây là bước nhảy lớn cho ứng dụng rộng rãi của STR trong công tác giám định pháp y. Bộ kit bao gồm các locus CSF1PO, TPOX và TH01, là các chỉ thị dạng “CTT”.
Các chỉ thị triplex thường có chỉ số xác xuất trùng hợp ngẫu nhiên chỉ khoảng 1/500 nhưng lại được sử dụng rộng rãi tại Mỹ do đây là bộ kit thương mại đầu tiên cho phép khuếch đại cùng lúc nhiều chỉ thị với chi phí thấp [11]. Vào năm 1990, Cục điều tra liên bang Mỹ - FBI đã khởi động một sự án thăm dò trên tổng cộng 14 bang và phòng thí nghiệm liên quan tại địa phương. Dự án được biết với tên “The DNA Identification Act” nhằm mục đích xây dựng hệ thống dữ liệu quốc gia cho công tác điều tra án (https://www.gov/services/laboratory/biometric-analysis/codis). Năm 1997, một bộ gồm 13 chỉ thị STR đã được chọn cho dự án xây dựng cơ sở dữ liệu của hệ thống Combined DNA Index System - CODIS.
Các chỉ thị bao gồm các locus CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, và D21S11 (Hình 1. Với bộ chỉ thị này, chỉ số trùng hợp ngẫu nhiên đã được nâng lên đến 1/1000000 trên các cá thể không có mối quan hệ huyết thống. Trong 13 locus thì các locus FGA, D18S51 và D21S11 có tính đa hình cao nhất. Một locus được sử dụng phổ biến thì có đặc tính riêng, trên cả số lượng allele, dạng trình tự lặp hay ngay cả các điểm đa dạng phổ biến quan sát được.
Lịch sử nghiên cứu và phát triển của phương pháp giám định gen trong khoa học hình sự luan an 9 Thuật ngữ “DNA fingerprinting” được miêu tả lần đầu tiên vào năm 1985 bởi nhà di truyền học người Anh Alec Jeffreys. Tiến sĩ Jeffreys đã tìm thấy các vùng gen nhất định chứa các đoạn trình tự lặp lại tuần tự, nối tiếp nhau khi nghiên cứu các đoạn phát huỳnh quang gắn đa locus. Ông cũng phát hiện ra rằng số đoạn lặp lại của các đoạn trình tự đặc biệt kia có tính cá thể cao, khác nhau giữa các cá thể khác nhau. Bằng cách phát triển một công nghệ giúp kiểm tra sự đa dạng của các đoạn lặp trên, tiến sĩ Jeffeys đã tạo ra phương thức định danh người [12].
Phát hiện đó đã mở ra một kỷ nguyên mới trong khoa học. Công nghệ này không chỉ nâng tầm khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học hệ thống, đa dạng sinh học, y học lâm sàng và cả trong khảo cổ học. Những ứng dụng của công nghệ này đã vượt ra khỏi phạm vi nghiên cứu khoa học thuần túy khi mà lần đầu tiên ứng dụng thành công trong điều tra án và chiến tranh bắt đầu từ năm 1987. Phương pháp xác định dấu vân tay ADN – DNA fingerprinting cổ điển sử dụng phương pháp cắt enzyme giới hạn (RFLP) và Southern blot.
Các đoạn vi vệ tinh hoặc các đoạn lặp lại được gắn với probe phóng xạ. Liên kết này sẽ bị phân giải bởi enzyme giới hạn, phân tách thành các đoạn riêng rẽ khi điện di gel agarose và cố định lên màng bằng lai Southern blot. Do chứa các trình tự nhận biết bởi enzyme giới hạn ở các vị trí khác nhau trên genome, các đoạn ADN đích (vi vệ tinh hoặc các đoạn lặp) sẽ bị cắt khỏi genome thành các đoạn có kích thước khác nhau theo số đơn vị đoạn lặp. Các đoạn này sẽ được rửa và hiển thị trên phim X-Quang và được dùng để so sánh giữa các cá thể.
Các đoạn vi vệ tinh được gọi là 33,6 và 33,15 được dùng phổ biến ở Anh, phần lớn các nước khối EU và Hoa Kỳ. Mặt khác, đoạn lặp năm – pentameric (CAC)/(GTG)5 lại được dùng phổ biến tại Đức. Những chỉ thị này cũng được gọi là các probe đa locus có thể hiện thị được dải 15 - 20 trình tự có kích thước từ 3,5 đến 20 kb.2 là hình ảnh ví dụ một kết quả một bộ hồ sơ ADN của các cá thể luan an 10 trong một gia đình. Tuy nhiên phương pháp này cho thấy một số hạn chế khi ứng dụng trong điều tra án hoặc các xét nghiệm xác định huyết thống khi mà điều kiện chạy hoặc chất lượng ADN quyết định rất lớn đến tính chính xác của các băng ADN hiển thị được.
Cho đến giữa những năm 1990, các phòng thí nghiệm hình sự đã kết hợp với nhau để quy định cách tính các băng ADN dựa trên các ô thang cố định nhằm khắc phục khó khăn trên. Các ô thang này quy định tương đối vị trí các đoạn ADN quan sát được trên một ảnh điện di tiêu chuẩn theo kích thước, từ đó làm tăng khả năng phân biệt của hệ thống.