Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu giải quyết vấn đề cấp thiết trong bối cảnh ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam chịu nhiều áp lực từ việc nhập nội các giống ngoại năng suất cao và khai thác không hợp lý, dẫn đến sự xói mòn và nguy cơ tuyệt chủng của các nguồn gen bản địa. Việt Nam hiện có khoảng 26 giống lợn bản địa, nhiều giống nằm trong Danh mục nguồn gen vật nuôi quý hiếm cần được bảo tồn như lợn Ỉ (hiện số lượng chỉ còn dưới 100 con giống tại Viện Chăn nuôi và tỉnh Thanh Hóa, không còn tìm thấy dạng hình Ỉ Mỡ thuần mà chỉ còn Ỉ Pha). Các giống khác như lợn Móng Cái, Mường Khương, lợn Hương, Mường Lay và Hạ Lang đều đối mặt với tình trạng suy giảm quy mô đàn. Khoảng trống nghiên cứu then chốt được tác giả chỉ ra là: trước thời điểm đề tài thực hiện, chưa có công trình khoa học nào công bố đầy đủ về trình tự toàn bộ hệ gen ty thể (mitochondrial genome - mtDNA) của các giống lợn bản địa Việt Nam để xác định cấu trúc phân tử, làm sáng tỏ nguồn gốc và quan hệ phát sinh chủng loại phục vụ công tác nhận dạng và bảo tồn.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung chính:

  1. Thu được dữ liệu hoàn chỉnh hệ gen ty thể của sáu giống lợn bản địa Việt Nam (lợn Ỉ, lợn Móng Cái, lợn Mường Lay, lợn Hương, lợn Mường Khương và lợn Hạ Lang), đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế GenBank.
  2. Xác định thành phần, cấu trúc hệ gen ty thể, so sánh sự sai khác trình tự, xác định đặc điểm di truyền đặc trưng của sáu giống lợn bản địa trên, qua đó đóng góp vào cơ sở dữ liệu phục vụ công tác nhận dạng và bảo tồn.
  3. Xác định mối quan hệ về di truyền, nhận định nguồn gốc, phát sinh chủng loại của sáu giống lợn bản địa Việt Nam trong tương quan với các giống lợn trên thế giới.

Đối tượng nghiên cứu là các cá thể lợn thuộc 6 giống lợn bản địa miền Bắc Việt Nam: lợn Ỉ, lợn Móng Cái, lợn Mường Lay, lợn Hương, lợn Mường Khương và lợn Hạ Lang. Phạm vi không gian thu mẫu thực địa bao gồm 5 tỉnh, thành phố: Thanh Hóa (thành phố Thanh Hóa, Hoằng Hóa, Thiệu Hóa, Yên Định, Bỉm Sơn, Đông Sơn); Hải Phòng (Trung tâm Giống Tràng Duệ, huyện An Dương); Điện Biên (thị xã Mường Lay); Cao Bằng (Trung tâm giống cây trồng, vật nuôi, thủy sản Cao Bằng tại huyện Hòa An); Lào Cai (huyện Mường Khương). Phạm vi phòng thí nghiệm được thực hiện tại Viện Nghiên cứu hệ gen thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Dữ liệu đối chiếu bao gồm 23 trình tự hệ gen ty thể của các giống lợn thuộc 6 khu vực địa lý ở Châu Á và Châu Âu được truy xuất từ cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các hướng nghiên cứu lớn trên thế giới và tại Việt Nam về nguồn gốc thuần hóa, phân loại học và ứng dụng chỉ thị phân tử ty thể:

  • Nguồn gốc thuần hóa và phân loại học lợn nhà: Các công trình của Giuffra và cs. (2000), Larson và cs. (2005, 2007) xác lập lịch sử thuần hóa lợn qua 5 sự kiện lớn từ tổ tiên lợn rừng (Sus scrofa). Lợn nhà hiện đại được hình thành từ hai trung tâm thuần hóa chính độc lập tại Cận Đông và Đông Á/Đông Nam Á. Larson (2005) khẳng định vùng Đông Nam Á là nơi phát sinh của các quần thể lợn rừng nguyên thủy di cư sang các đảo Thái Bình Dương khoảng 3.000 năm trước. Kim và cs. (2002) chỉ ra sự lai tạp giữa lợn Châu Á nhập khẩu vào Anh ở thế kỷ 18-19 với lợn bản địa Châu Âu, tạo nên sự đa dạng di truyền lớn ở các giống thương phẩm hiện đại.
  • Hệ gen ty thể và ứng dụng trong phát sinh chủng loại: Lin và cs. (1998) lần đầu tiên công bố trình tự hoàn chỉnh hệ gen ty thể của loài Sus scrofa (kích thước xấp xỉ 16,6 kb, mã hóa 13 polypeptide, 22 tRNA, 2 rRNA và vùng kiểm soát D-loop). Spychaj và cs. (2016), Dawnay và cs. ứng dụng gen COI ty thể làm mã vạch DNA định danh loài. Wu và cs. (2007), Watanobe và cs. (2003), Wang và cs. (2014), Yu và cs. (2013) sử dụng trình tự D-loop và toàn bộ mtDNA để phân tích cấu trúc di truyền các giống lợn Châu Á (lợn Lanyu, lợn Duroc, lợn hoang Malaysia). Vùng siêu biến (HV1, HV2) và các khối trình tự bảo thủ (CSB-I, CSB-II, CSB-III) trong D-loop được chứng minh có tốc độ thay thế nucleotide nhanh (khoảng 1,5–2,0 × 10⁻⁸ thay thế/vị trí/năm), thích hợp để phân tích các biến cố phân ly tiến hóa gần.
  • Nghiên cứu di truyền trên đàn lợn Việt Nam:
    • Nghiên cứu hình thái và sinh lý: Nguyễn Văn Thiện và cs. (1995) trên lợn Ỉ và Móng Cái; Lê Viết Ly và cs. (1999) trên lợn Ba Xuyên, Thuộc Nhiêu; Trần Văn Do và cs. (2005) trên lợn Lang, Móng Cái, Vân Pa; Trần Thanh Vân và Đinh Thu Hà (2005) trên lợn Mẹo; Hongo và cs. (2002) dựa vào giải phẫu bộ xương phân lợn Việt Nam thành hai nhóm lớn và nhỏ.
    • Nghiên cứu chỉ thị gen đơn lẻ và tính trạng sản xuất: Lê Thị Thúy và cs. (2004) khảo sát đa hình gen leptin; Đỗ Võ Anh Khoa và cs. khảo sát gen MASP1; Đặng Vũ Bình và cs. (2012), Lê Thị Thu Phương (2003) nghiên cứu gen halothan và thụ thể estrogen; Nguyễn Thị Diệu Thúy và cs. (2004) phân tích gen hormone sinh trưởng bằng PCR-RFLP; Nguyễn Thị Hoa (2013) khảo sát gen H-FABP và Lpin1; Trần Xuân Hoàn và cs. (2013) khảo sát gen Mc4R; Nguyễn Văn Cường và cs. (2009) phân tích gen kháng bệnh.
    • Nghiên cứu phân tử ty thể và phả hệ: Lê Thành Long và cs. (2014) khảo sát gen Cytochrome b ở lợn Tây Nguyên; Nguyễn Thị Phương Mai (2017) xác định 3 SNP mới trên vùng D-loop và 3 SNP trên gen Cytochrome b của heo rừng Tây Nguyên; Ishihara và cs. (2010) dùng chỉ thị SNP trên 15 giống lợn nội; Trần Thị Thúy Nhiên (2016) giải mã hoàn chỉnh hệ gen ty thể lợn Móng Cái (16.632 bp) và chỉ ra quan hệ gần gũi với lợn Bama miniature (Nam Trung Quốc).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết: Phần lớn các nghiên cứu trong nước trước đây chỉ tập trung vào các tính trạng ngoại hình, năng suất sinh sản hoặc khảo sát các đoạn gen nhân và gen ty thể ngắn đơn lẻ. Luận án này tiến hành giải mã, lắp ráp và chú giải đồng bộ toàn bộ hệ gen ty thể hoàn chỉnh cho cả 6 giống lợn bản địa tiêu biểu ở miền Bắc Việt Nam, xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp suy luận Bayes để làm rõ nguồn gốc và vị trí phân loại của các giống này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết tiến hóa phân tử của hệ gen ty thể ở động vật có vú: phân tử DNA vòng kép, di truyền theo dòng mẹ, đơn bội, không xảy ra tái tổ hợp di truyền và có tốc độ đột biến thay thế nucleotide cao hơn hệ gen nhân. Khung phân tích phát sinh chủng loại phân tử tuân thủ quy trình 5 bước: thu nhận trình tự, dóng hàng đa trình tự, lựa chọn mô hình tiến hóa thống kê thích hợp (Jukes-Cantor, Kimura 2 thông số, Tamura), xây dựng cây tiến hóa và đánh giá độ tin cậy cây bằng phân tích bootstrap và xác suất hậu nghiệm Bayes.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

[Khảo sát ngoại hình 3 cấp (Lông da -> Tầm vóc/Khối lượng -> Hình dáng cơ thể)]
[Thu mẫu máu vô trùng có EDTA (QCVN 01-83:2011/BNNPTNT)]
[Tách chiết DNA tổng số (Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1)]
[Khuếch đại PCR 30 phân đoạn mtDNA (GoTaq Green Master Mix, Ta 53-55°C)]
[Tinh sạch sản phẩm PCR (QIAquick) & Điện di kiểm tra trên Agarose 1%]
[Giải trình tự Sanger 2 chiều trên ABI 3500 (BigDye Terminator v3.1)]
  • Khảo sát và sàng lọc cá thể: Đánh giá cá thể cái 8 tháng tuổi (riêng lợn Ỉ đánh giá trên toàn bộ cá thể còn lại) qua 3 cấp độ chỉ tiêu: (1) Màu sắc lông da (nhóm A+, A, B); (2) Tầm vóc và khối lượng (dài thân, vòng ngực, cao vai, khối lượng); (3) Đặc điểm hình dáng cơ thể và số lượng núm vú theo tiêu chuẩn Át lát giống vật nuôi Việt Nam. Mỗi giống chọn 6 mẫu máu đại diện đạt chuẩn để tách chiết DNA.
  • Tách chiết DNA và phản ứng PCR: Máu lấy từ tĩnh mạch tai/cổ (3–5 ml) bảo quản ở -20°C. Tách chiết DNA tổng số bằng dung dịch đệm Lysis, Proteinase K (2,5 mg/ml) và hỗn hợp Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1), kết tủa bằng ethanol và natri axetat (pH 5,2) theo quy trình Sambrook và cs. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch qua chỉ số OD 260/280 nm trên máy Nanodrop và điện di gel agarose 1%.
  • Khuếch đại và giải trình tự: Sử dụng 30 cặp mồi đặc hiệu kế thừa và hiệu chỉnh từ Yu và cs. (2013), nhiệt độ gắn mồi ($T_a$) dao động từ 53°C đến 55°C, sử dụng kit GoTaq® Green Master Mix (Promega). Tinh sạch sản phẩm bằng QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen). Giải trình tự phân đoạn Sanger trên hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher) sử dụng hóa chất BigDye® Terminator v3.1.

Phương pháp tin sinh học và phân tích dữ liệu

[Ghép contig & Khép vòng mtDNA (DNA Dragon v1.0, EditSeq)]
[Loại bỏ đoạn lặp 5'-CGTGCGTACA-3' vùng D-loop & Dóng hàng MUSCLE (MEGA7)]
[Chú giải gen (MITOS Web Server, DOGMA, đối chiếu BLAST NCBI)]
[Phân tích thống kê: DAMBE v6 (AT/GC skew), DnaSP (SNP, đa hình)]
[Dựng cây phát sinh Bayes (BEAST v1, TreeAnnotator, FigTree v1.2)]
             (Nhóm ngoại: Sus barbatus - WB-Malaysia; Bootstrap 1.000 lần)
  • Lắp ráp và chú giải hệ gen: Xử lý file tín hiệu .ab1 bằng BioEdit v7, ghép nối các đoạn contig bằng phần mềm DNA Dragon v1.0 và EditSeq. Xác định và loại bỏ các đoạn lặp ngắn 10 bp ($5'\text{-CGTGCGTACA-}3'$) ở vùng D-loop để loại trừ sai số heteroplasmy. Dóng hàng đa trình tự bằng thuật toán MUSCLE trên phần mềm MEGA7. Chú giải 13 gen mã hóa protein, 22 gen tRNA và 2 gen rRNA bằng hai công cụ trực tuyến MITOS và DOGMA, kiểm tra chéo bằng BLASTx và BLASTn trên NCBI.
  • Phân tích đặc tính phân tử và phát sinh loài: Tính tỷ lệ nucleotide, chỉ số AT-skew $[(A-T)/(A+T)]$ và GC-skew $[(G-C)/(G+C)]$ bằng DAMBE v6. Xác định đột biến SNP và đa hình trình tự bằng DnaSP v5. Tính khoảng cách di truyền cặp ($p\text{-distance}$) theo mô hình Kimura 2 thông số trên MEGA7. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp suy luận Bayes trên phần mềm BEAST v1, chọn cây tối ưu bằng TreeAnnotator và hiển thị bằng FigTree v1.2. Nhóm ngoại (outgroup) được sử dụng là lợn hoang Malaysia (Sus barbatus, mã số GenBank EF545592.1). Kiểm định độ tin cậy của các nút phân nhánh bằng phân tích bootstrap 1.000 lần lặp trên MEGA.

Nội dung chính theo từng chương

Phần Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết, mục đích, nội dung nghiên cứu, 3 điểm mới về mặt học thuật và ý nghĩa khoa học - thực tiễn của đề tài trong việc cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử phục vụ bảo tồn 6 giống lợn bản địa miền Bắc.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học về 4 nhóm nội dung:

  1. Phân loại và lịch sử thuần hóa lợn: Lịch sử chi Sus từ 4–2 triệu năm trước, phân ly hai dòng Âu - Á cách đây khoảng 1,2 triệu năm, các sự kiện thuần hóa độc lập ở Cận Đông và Trung Quốc/Đông Nam Á (khoảng 9.000–10.000 năm trước).
Đơn vị phân loại Tên khoa học
Giới (Kingdom) Động vật (Animalia)
Ngành (Phylum) Động vật có xương sống (Chordata)
Lớp (Class) Động vật có vú (Mammalia)
Bộ (Order) Guốc chẵn (Artiodactyla)
Họ (Family) Lợn (Suidae)
Chi (Genus) Sus
Loài (Species) Sus scrofa
Phân loài (Subspecies) Sus domesticus
  1. Cấu trúc và cơ chế tiến hóa mtDNA động vật có vú: Trình bày cấu trúc mạch vòng kép gồm chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L), mã di truyền đặc thù của ty thể động vật có xương sống (TGA mã hóa Tryptophan; ATA mã hóa Methionine; AGA/AGG là bộ ba kết thúc), đặc điểm vùng kiểm soát D-loop chứa promoter và các khối CSB điều hòa phiên mã/sao chép.
  2. Phương pháp luận phát sinh chủng loại học: Cơ chế thay thế nucleotide trong phân tử DNA (thay thế song song, đơn nhất, liên tiếp, ngẫu nhiên, trùng hợp hội tụ, hồi quy); các thuật toán dựng cây (UPGMA, Neighbor-Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Suy luận Bayes sử dụng chuỗi Markov Monte Carlo - MCMC) và phương pháp đánh giá cây bằng phân tích bootstrap.
  3. Hiện trạng 26 giống lợn bản địa Việt Nam: Tổng kết phân bố địa lý theo 5 vùng sinh thái và mô tả chi tiết đặc điểm ngoại hình, tình trạng số lượng của 6 giống nghiên cứu (Ỉ, Móng Cái, Hạ Lang, Mường Lay 14 vú, Mường Khương, Hương).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết địa điểm thu mẫu, hóa chất, thiết bị, 30 cặp mồi PCR và các tham số kỹ thuật giải trình tự. Chương này lập danh mục 23 trình tự mtDNA đối chứng từ GenBank đại diện cho các vùng địa lý để phân tích so sánh:

Khu vực địa lý Tên giống lợn (Tiếng Việt / Tiếng Anh) Mã số truy cập GenBank
Đông Bắc Á Lợn rừng Hàn Quốc (WB-Korea) AY574047.1
Lợn rừng Đông Bắc Trung Quốc (WB-China northeast) EU333163.1
Khu vực Mê Kông Lợn rừng Việt Nam (WB-Vietnam) EF545584.1
Lợn Ban-na mini (Banna mini) GQ220328.1
Lợn Đa-hê (Dahe) GQ220329.1
Lợn rừng Malaysia (WB-Malaysia) EF545592.1
Nam Trung Quốc Lợn rừng Vân Nam (WB-Yunnan) EF545573.1
Lợn rừng Phúc Kiến (WB-Fujian) EF545569.1
Lợn rừng Hải Nam (WB-Hainan) EF545572.1
Lợn Lang-tan (Lantang) KC250274
Lợn La-ny-u (Lanyu) DQ518915.2
Lưu vực sông Dương Tử Lợn A-ba (Aba) EF545578.1
Lợn rừng Giang Tây (WB-Jiangxi) EF545579.1
Lợn Kim Hoa (Jinhua) KC469586
Lợn Xi-ang (Xiangg) KC250273
Lưu vực sông Hoàng Hà Lợn Bi-hu (Bihu) EF545591.1
Lợn Wei (Wei) EF545577.1
Lợn Ba-mây (Bamei) EF545583.1
Lợn Hu-du (Huzu) EF545588.1
Các nước Châu Âu Lợn Béc-sai (Berkshire) AY574045.1
Lợn Đu-rốc / Heo bò (Duroc) AY337045.1
Lợn đen I-bê-ria (Iberian) FJ236994.1
Lợn Ham-p-shơ (Hampshire) AY574046.1
Lợn Đại Bạch (Large-white) KC250275
Lợn Lan-đờ-rát (Landrace) AF034253.1
Lợn Pi-ê-tờ-ranh (Pietrain) KC469587
Lợn rừng Châu Âu (WB-European) FJ237000.1

Chương 2 cũng thiết lập chi tiết thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt giải trình tự chuỗi bằng BigDye Terminator v3.1 trên hệ thống ABI 3500:

Thành phần phản ứng giải trình tự Thể tích / Lượng
BigDye® Terminator v3.1 4 µl
BigDye® Sequencing Buffer 2 µl
Mồi (Primer) 3,2 pmol
DNA khuôn (Template) 5–20 ng
Nước khử ion Bổ sung vừa đủ 20 µl

Chu trình nhiệt giải trình tự: 96°C trong 1 phút; 25 chu kỳ (96°C trong 10 giây; 50°C trong 5 giây; 60°C trong 4 phút); giữ ở 4°C.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ khâu chọn giống thực địa đến lắp ráp phân tử:

  1. Kết quả khảo sát ngoại hình 3 cấp:
    • Đặc điểm màu sắc lông da: Tỷ lệ cá thể đạt tiêu chuẩn nhóm A/A+ gồm lợn Ỉ (100% nhóm A, 9/9 con); lợn Móng Cái (18% nhóm A, 18/100 con); lợn Mường Khương (23% nhóm A, 23/100 con); lợn Hương (42,1% nhóm A, 16/38 con); lợn Hạ Lang (68,3% nhóm A, 28/41 con); lợn Mường Lay (11,4% nhóm A và 38,5% nhóm A+, tổng 35/70 con).
    • Kích thước và khối lượng lúc 8 tháng tuổi:
Giống lợn Số cá thể ($N$) Khối lượng (kg) $\bar{X} \pm SD$ Dài thân (cm) $\bar{X} \pm SD$ Vòng ngực (cm) $\bar{X} \pm SD$ Cao vai (cm) $\bar{X} \pm SD$
Lợn Ỉ 9 $40,34 \pm 0,92$ $85,76 \pm 1,32$ $83,93 \pm 1,44$ $39,58 \pm 0,91$
Lợn Móng Cái 18 $51,47 \pm 0,32$ $92,41 \pm 1,35$ $90,77 \pm 1,46$ $45,25 \pm 0,93$
Lợn Hương 16 $40,55 \pm 0,22$ $86,73 \pm 1,33$ $81,31 \pm 1,42$ $42,56 \pm 0,36$
Lợn Hạ Lang 28 $42,68 \pm 0,42$ $87,12 \pm 1,33$ $84,34 \pm 1,43$ $43,68 \pm 0,98$
Lợn Mường Khương 23 $52,64 \pm 0,92$ $93,94 \pm 1,32$ $90,52 \pm 1,46$ $46,14 \pm 0,96$
Lợn Mường Lay 27 $40,43 \pm 0,95$ $85,71 \pm 1,38$ $83,97 \pm 1,46$ $43,25 \pm 0,94$
  • Khảo sát hình dáng cơ thể và số lượng núm vú: Tỷ lệ cá thể đáp ứng đúng chuẩn đạt 100% ở lợn Ỉ (9/9 con); 83,3% ở lợn Móng Cái (15/18 con); 86,9% ở lợn Mường Khương (20/23 con); 62,5% ở lợn Hương (10/16 con); 89,2% ở lợn Hạ Lang (25/28 con); 48,1% ở lợn Mường Lay (13/27 con).
  1. Kết quả tách chiết DNA tổng số: 36 mẫu máu (6 mẫu/giống) đều cho băng điện di rõ nét, không bị đứt gãy. Chỉ số độ tinh sạch $\text{OD}_{260/280}$ đạt chuẩn từ 1,71 đến 2,53 (phần lớn dao động 1,80–2,03), nồng độ DNA đạt từ 51,24 ng/µl đến 192,37 ng/µl.
Giống lợn Ký hiệu mẫu Nồng độ DNA (ng/µl) Độ tinh sạch ($\text{OD}_{260/280}$)
Lợn Ỉ I1 – I6 51,25 – 92,15 1,80 – 2,03
Lợn Hương H1 – H6 51,24 – 84,28 1,81 – 2,14
Lợn Móng Cái MC1 – MC6 82,22 – 172,23 1,72 – 2,02
Lợn Mường Khương MK1 – MK6 52,65 – 95,04 1,71 – 2,53
Lợn Mường Lay ML1 – ML6 72,46 – 192,37 1,83 – 1,97
Lợn Hạ Lang HL1 – HL6 62,44 – 91,87 1,82 – 1,99
  1. Khuếch đại PCR và lắp ráp hệ gen ty thể: 30 phân đoạn PCR sau khi tinh sạch đều hiển thị băng sáng, đặc hiệu, kích thước chuẩn. Quá trình giải trình tự Sanger hai chiều và xử lý cắt tỉa trên BioEdit/DNA Dragon cho kết quả đồng đều ở cả 6 giống:
Chỉ số lắp ráp hệ gen Lợn Ỉ Lợn Móng Cái Lợn Hương Lợn Mường Khương Lợn Mường Lay Lợn Hạ Lang
Số lượng trình tự cần lắp ráp 46 46 46 46 46 46
Chiều dài trung bình trình tự trước lắp ráp (bp) 870,8 869,9 869,7 871,0 871,1 870,2
Chiều dài đoạn gối lên nhau tối thiểu (bp) 30 30 31 30 32 30
Số đoạn gối lên nhau 47 47 47 47 47 47

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Đã giải trình tự hoàn chỉnh toàn bộ hệ gen ty thể của 6 cá thể đại diện cho 6 giống lợn bản địa Việt Nam (lợn Ỉ, lợn Móng Cái, lợn Mường Khương, lợn Mường Lay, lợn Hương và lợn Hạ Lang); toàn bộ dữ liệu trình tự hoàn chỉnh đã được đăng ký và công bố trên Ngân hàng gen quốc tế GenBank (NCBI).
  2. Đã phân tích thành phần nucleotide, chú giải vị trí các gen mã hóa protein, tRNA, rRNA và dự đoán cấu trúc chức năng của hệ gen ty thể ở 6 giống lợn nghiên cứu, cung cấp bộ chỉ thị phân tử phục vụ công tác nhận dạng di truyền.
  3. Xây dựng giả thuyết khoa học về nguồn gốc phát sinh chủng loại: nhận định giống lợn Hương và lợn Hạ Lang (cùng phân bố tại tỉnh Cao Bằng) có thể có cùng một nguồn gốc di truyền chung.

Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đề xuất

  • Kết quả phân tích trình tự là nguồn dữ liệu di truyền cơ sở cho các nghiên cứu tiến hóa phân tử, phả hệ học và đánh giá tài nguyên di truyền vật nuôi bản địa tại Việt Nam.
  • Dữ liệu đóng góp trực tiếp vào Thư viện nguồn gen quốc gia và quốc tế, phục vụ công tác giám sát suy thoái đồng huyết, kiểm tra độ thuần chủng và xây dựng chiến lược bảo tồn nguồn gen vật nuôi nguy cấp (đặc biệt đối với quần thể lợn Ỉ đang ở mức báo động).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế được ghi nhận trong văn bản:
    • Do số lượng cá thể lợn Ỉ còn lại trong tự nhiên và trại giống quá ít (dưới 100 con trên toàn quốc, tại điểm khảo sát chỉ có 9 cá thể), đề tài không thể phân tầng theo nhóm tuổi mà phải chọn mẫu dựa trên hình thái và phả hệ có sẵn; đồng thời không còn tìm thấy cá thể nào thuộc dòng lợn Ỉ Mỡ thuần chủng, toàn bộ mẫu nghiên cứu thuộc dòng Ỉ Pha.
    • Nghiên cứu giải mã hệ gen ty thể hoàn chỉnh đại diện trên 1 cá thể cho mỗi giống sau khi sàng lọc nghiêm ngặt từ đàn khảo sát.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng giải mã trình tự hệ gen ty thể trên số lượng mẫu lớn hơn cho từng quần thể giống bản địa; mở rộng khảo sát các giống lợn bản địa khác tại khu vực miền Trung, Tây Nguyên và Đồng bằng sông Cửu Long; kết hợp phân tích hệ gen nhân và các chỉ thị phân tử chức năng để đánh giá toàn diện mức độ đa dạng di truyền.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Giảng viên, nghiên cứu sinh, học viên cao học: Chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học, Chăn nuôi và Thú y.
  • Các cơ quan quản lý và bảo tồn nguồn gen: Cán bộ kỹ thuật tại Viện Chăn nuôi, các Trung tâm Giống vật nuôi thuộc Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn các tỉnh trong công tác đánh giá độ thuần chủng và lập kế hoạch bảo tồn giống bản địa.
  • Nội dung giá trị nhất để tham khảo: Bộ 30 cặp mồi PCR và chu trình nhiệt khuếch đại toàn bộ mtDNA lợn; quy trình tin sinh học phối hợp giữa các phần mềm BioEdit, DNA Dragon, MITOS, DOGMA và BEAST; bộ số liệu đo đạc hình thái chuẩn của 6 giống lợn bản địa miền Bắc lúc 8 tháng tuổi.

Câu hỏi thường gặp

1. Sáu giống lợn bản địa được giải mã hệ gen ty thể trong luận án gồm những giống nào và phân bố ở đâu? Sáu giống lợn gồm: lợn Ỉ (tỉnh Thanh Hóa), lợn Móng Cái (tỉnh Quảng Ninh / nuôi tại Hải Phòng), lợn Mường Lay (tỉnh Điện Biên), lợn Hương (tỉnh Cao Bằng), lợn Mường Khương (tỉnh Lào Cai) và lợn Hạ Lang (tỉnh Cao Bằng).

2. Quy trình sàng lọc cá thể để lấy mẫu giải trình tự được tiến hành qua các bước nào? Quy trình thực hiện qua 3 cấp độ chỉ tiêu liên tiếp:

  1. Nhóm đặc điểm màu sắc lông da: Sàng lọc phân loại vào các nhóm A+, A, B; chỉ cá thể đạt nhóm A/A+ mới được giữ lại.
  2. Nhóm chỉ tiêu tầm vóc và khối lượng lúc 8 tháng tuổi: Đo dài thân, vòng ngực, cao vai và cân khối lượng.
  3. Nhóm đặc điểm hình dáng cơ thể: Đánh giá hình thái đầu, tai, lưng, bụng và số lượng núm vú. Mỗi giống chọn 6 mẫu máu đạt chuẩn để tách chiết DNA, sau đó chọn 1 cá thể đặc trưng nhất đem giải trình tự hoàn chỉnh hệ gen ty thể.

3. Phương pháp và công cụ tin sinh học nào được sử dụng để lắp ráp và chú giải hệ gen ty thể?

  • Lắp ráp contig và khép vòng hệ gen: Sử dụng phần mềm BioEdit v7 (cắt tỉa file thô .ab1), DNA Dragon v1.0 và EditSeq.
  • Dóng hàng đa trình tự: Dùng thuật toán MUSCLE trong phần mềm MEGA7 (sau khi đã loại bỏ đoạn lặp 10 bp $5'\text{-CGTGCGTACA-}3'$ ở vùng D-loop).
  • Chú giải hệ gen: Sử dụng đồng thời hai công cụ trực tuyến MITOS Web Server và DOGMA, đối chiếu kiểm tra lại bằng công cụ BLAST (BLASTn, BLASTx) trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank.

4. Luận án sử dụng nhóm đối chứng ngoại (outgroup) nào để dựng cây phát sinh loài và căn cứ vào đâu? Luận án sử dụng trình tự hệ gen ty thể của giống lợn hoang Malaysia (Sus barbatus, mã số GenBank: EF545592.1) làm nhóm đối chứng ngoại. Căn cứ lựa chọn vì đây là giống có trình tự mtDNA tách biệt rõ ràng với nhóm lợn hoang Châu Âu và Châu Á, thường được sử dụng làm outgroup chuẩn trong các nghiên cứu phát sinh chủng loại lợn quốc tế.

5. Kết quả kỹ thuật lắp ráp các đoạn trình tự hệ gen ty thể của 6 giống lợn đạt các thông số như thế nào? Ở cả 6 giống lợn, số lượng trình tự cần lắp ráp đều là 46 đoạn; chiều dài trung bình các trình tự trước lắp ráp dao động từ 869,7 bp đến 871,1 bp; chiều dài đoạn gối lên nhau tối thiểu đạt từ 30 bp đến 32 bp; và tổng số đoạn gối lên nhau để khép vòng phân tử là 47 đoạn.

Kết luận

Luận án đã hoàn thành việc xác định và phân tích hoàn chỉnh trình tự hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa miền Bắc Việt Nam (lợn Ỉ, Móng Cái, Mường Khương, Mường Lay, Hương và Hạ Lang), toàn bộ dữ liệu đã được công bố trên GenBank. Bằng việc kết hợp phương pháp khảo sát hình thái 3 cấp nghiêm ngặt, kỹ thuật giải trình tự Sanger 30 phân đoạn và các công cụ tin sinh học (MITOS, DOGMA, BEAST), đề tài đã cung cấp cấu trúc chú giải chi tiết và xác lập cây phát sinh chủng loại phân tử cho các giống lợn nghiên cứu. Công trình nêu ra giả thuyết về nguồn gốc chung giữa giống lợn Hương và lợn Hạ Lang, đồng thời cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử quan trọng phục vụ công tác bảo tồn, nhận dạng và khai thác bền vững nguồn gen vật nuôi bản địa quý hiếm của Việt Nam.