Luận án tiến sĩ về đa hình đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 ở người Kinh Việt Nam

Nghiên cứu đa hình đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 ở người Kinh Việt Nam, góp phần hiểu biết về di truyền và y học cá thể.

• Tác giả: Vũ Phương Nhung
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hải Hà
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đa Hình/Đột Biến Gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 Và CYP2D6 Cytochrome P450 Ở Người Kinh Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 2. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5. PHÂN TÍCH LIÊN KẾT VÀ Ý NGHĨA TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GEN CYP450
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Đa hình gen CYP2C9 CYP2C19 CYP3A5 và CYP2D6 ở người Kinh Việt Nam Tổng quan về chuyển hóa thuốc và di truyền học

Luận án Tiến sĩ Sinh học của Vũ Phương Nhung năm 2020 tập trung nghiên cứu đa hình gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 ở người Kinh Việt Nam. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực pharmacogenomics, đặc biệt là ứng dụng trong chuyển hóa thuốc. Các gen enzyme CYP này, thuộc họ gen CYP, đóng vai trò chủ chốt trong chuyển hóa thuốc. Sự đa dạng di truyền của chúng, thể hiện qua các đa hình gen, bao gồm SNP và CNV, ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme CYP, dẫn đến khác biệt trong đáp ứng thuốc và nguy cơ phản ứng có hại của thuốc (ADR). Luận án nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về đa hình gen này ở dân tộc Việt Nam, hỗ trợ việc cá thể hóa điều trị và tối ưu hiệu quả dùng thuốc. Nghiên cứu này góp phần vào sự phát triển của nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử ở Việt Nam.

1.1. Vai trò của các enzyme CYP trong chuyển hóa thuốc

Các enzyme CYP, đặc biệt là CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5, là thành phần quan trọng trong quá trình chuyển hóa thuốc ở gan. Chúng xúc tác các phản ứng oxi hóa, khử, thủy phân, giúp biến đổi các thuốc từ dạng ưa lipid sang dạng ưa nước dễ đào thải. Sự khác biệt về hoạt tính enzyme CYP do đa hình gen gây ra dẫn đến sự khác biệt đáng kể trong quá trình chuyển hóa thuốc giữa các cá nhân. Một số thuốc chỉ được chuyển hóa bởi một loại enzyme CYP cụ thể. Hiểu rõ cơ chế hoạt động của enzyme CYP và sự đa dạng di truyền của chúng là yếu tố then chốt trong việc dự đoán và tối ưu hóa đáp ứng thuốc ở từng người. Luận án đề cập đến pha I, II và III trong chuyển hóa thuốc tại gan và vai trò của enzyme CYP ở pha I. Hiểu biết về các enzyme CYP và sự ảnh hưởng của đa hình gen là nền tảng cho y học cá thể hóa.

1.2. Đa hình gen và ảnh hưởng đến tương tác thuốc

Đa hình gen ở các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 dẫn đến sự khác biệt đáng kể về kiểu hình chuyển hóa thuốc. Các kiểu hình này, bao gồm chuyển hóa thuốc yếu (PM), trung bình (IM), bình thường (EM) và cực nhanh (UM), có ảnh hưởng trực tiếp đến nồng độ thuốc trong huyết tương và do đó ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và nguy cơ ADR. Luận án nhấn mạnh tầm quan trọng của việc xác định kiểu gen để dự đoán kiểu hình chuyển hóa thuốc. Việc này giúp bác sĩ điều chỉnh liều lượng thuốc và lựa chọn thuốc phù hợp, giảm thiểu nguy cơ ADR và tăng hiệu quả điều trị. Đây là một ứng dụng thực tiễn quan trọng của pharmacogenomics trong thực hành lâm sàng. Tối ưu an toàn dùng thuốc dựa trên genomics và di truyền học là hướng đi quan trọng của y học hiện đại.

II. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu sử dụng mẫu là 136 người Kinh khỏe mạnh. Phương pháp phân tích đa hình chủ yếu là giải trình tự Sanger cho CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6, và MLPA cho CNV. Kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi trong quá trình khuếch đại gen. Phân tích thống kê được thực hiện để tính toán tần số alen và kiểu gen. Phân tích in silico được áp dụng để dự đoán chức năng của các biến thể mới phát hiện. Kết quả cho thấy sự đa dạng về kiểu gen và kiểu hình của các gen CYP nghiên cứu trong quần thể người Kinh Việt Nam. Luận án ghi nhận các biến thể di truyền mới, bổ sung vào cơ sở dữ liệu về đa hình gen CYP ở người Việt.

2.1. Phân tích đa hình gen bằng giải trình tự Sanger và MLPA

Giải trình tự Sanger cho phép xác định chính xác trình tự nucleotide của các gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6, từ đó phát hiện các SNP và indel. MLPA được sử dụng để xác định CNV, bao gồm mất hoặc lặp đoạn gen. Kết hợp hai phương pháp này giúp đánh giá toàn diện đa hình gen của các gen nghiên cứu. Việc sử dụng kỹ thuật PCR là bước quan trọng trong việc khuếch đại các đoạn gen cần nghiên cứu. Mẫu gen được xử lý để tách chiết DNA và xác định nồng độ DNA trước khi tiến hành phân tích. Các bước này đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả. Luận án đề cập chi tiết các thông số kỹ thuật của các phương pháp này, bao gồm thiết kế mồi, điều kiện phản ứng PCR, và phần mềm phân tích kết quả.

2.2. Phân tích thống kê và dự đoán chức năng in silico

Kết quả giải trình tự và MLPA được phân tích thống kê để xác định tần số alen và kiểu gen của mỗi gen trong quần thể nghiên cứu. Thống kê di truyền được áp dụng để đánh giá sự cân bằng Hardy-Weinberg. Phân tích liên kết được thực hiện để xem xét mối tương quan giữa các biến thể khác nhau. Phân tích in silico được thực hiện để đánh giá tác động của các biến thể mới phát hiện lên chức năng protein, cho phép đánh giá rủi ro và hiểu rõ hơn về cơ chế tác động của biến dị di truyền tới chức năng protein và hoạt tính enzyme CYP. Các phần mềm dự đoán chức năng protein được sử dụng trong luận án cần được nêu rõ. Kết quả phân tích thống kê và dự đoán chức năng giúp hiểu rõ hơn về ảnh hưởng của đa hình gen đến chuyển hóa thuốc ở người Kinh Việt Nam.

III. Thảo luận và ứng dụng

Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về phân bố gen các CYP ở người Việt. So sánh với các quần thể khác trên thế giới cho thấy sự khác biệt về tần số alen. Những biến thể mới phát hiện cần được nghiên cứu thêm để hiểu rõ chức năng. Nghiên cứu có ý nghĩa trong y học cá thể hóa, giúp dự đoán đáp ứng thuốc và tối ưu liệu lượng thuốc. Cơ sở dữ liệu gen được xây dựng từ luận án đóng góp giá trị cho nghiên cứu khoa học và chăm sóc sức khỏe ở Việt Nam. Những thông tin này rất cần thiết cho y học cộng đồng và hỗ trợ xây dựng các hướng dẫn dùng thuốc phù hợp với đặc điểm di truyền của người Việt. Personalized medicine dựa trên thông tin cơ sở dữ liệu gen là tương lai của y học.

3.1. Ý nghĩa của nghiên cứu đối với y học cá thể hóa

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển y học cá thể hóa (personalized medicine) ở Việt Nam. Bằng cách xác định kiểu gen của các gen CYP, có thể dự đoán được khả năng chuyển hóa thuốc của từng cá nhân. Điều này giúp bác sĩ lựa chọn thuốc và điều chỉnh liều lượng phù hợp, đảm bảo hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ ADR. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho việc xây dựng các phác đồ điều trị cá thể hóa dựa trên thông tin di truyền. Nghiên cứu này đóng góp vào việc phát triển y học chính xác ở Việt Nam. Quan hệ giữa gen và thuốc được làm rõ thông qua nghiên cứu này.

3.2. Ứng dụng trong thực hành lâm sàng và chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trực tiếp trong thực hành lâm sàng. Bác sĩ có thể sử dụng thông tin về đa hình gen CYP để dự đoán đáp ứng thuốc ở bệnh nhân và đưa ra quyết định điều trị chính xác hơn. Dữ liệu về tần số alen trong quần thể người Kinh Việt Nam giúp các nhà hoạch định chính sách chăm sóc sức khỏe đưa ra các chiến lược phòng ngừa và điều trị hiệu quả hơn. Nghiên cứu này góp phần vào việc nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng ở Việt Nam, đặc biệt trong việc tối ưu hóa việc sử dụng thuốc và giảm thiểu phản ứng phụ thuốc. An toàn dùng thuốc được nâng cao nhờ ứng dụng kết quả nghiên cứu này vào thực hành lâm sàng.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Sự biến thiên trong đáp ứng thuốc giữa các cá thể là một trong những thách thức trọng tâm của y học hiện đại, trực tiếp dẫn đến thất bại điều trị hoặc gây ra các phản ứng có hại của thuốc (Adverse Drug Reactions - ADR). Theo ước tính của Ingelman-Sundberg và cộng sự, các biến cố ADR tiêu tốn khoảng 100 tỉ USD và là nguyên nhân dẫn tới 100.000 ca tử vong mỗi năm tại Hoa Kỳ, đồng thời chiếm khoảng 7% tổng số ca nhập viện tại Anh và Thụy Điển. Phần lớn các thuốc kê đơn trên lâm sàng (khoảng 60–80%) được chuyển hóa bởi hệ enzyme Cytochrome P450 (CYP450) pha I tại gan, trong đó bốn enzyme giữ vai trò cốt lõi bao gồm CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5. Tuy nhiên, tính đa hình di truyền (genetic polymorphism) ở các gen mã hóa tương ứng tạo nên sự phân hóa rõ rệt về kiểu hình chuyển hóa, phân cấp từ chuyển hóa thuốc yếu (Poor Metabolizer - PM), chuyển hóa trung bình (Intermediate Metabolizer - IM), chuyển hóa bình thường (Extensive Metabolizer - EM) đến chuyển hóa cực nhanh (Ultrarapid Metabolizer - UM).

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ thực trạng phần lớn các hướng dẫn liều lượng quốc tế từ Hiệp hội Ứng dụng Di truyền Dược học Lâm sàng (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium - CPIC) và Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) được xây dựng dựa trên dữ liệu hệ gen của quần thể người da trắng (Caucasian) hoặc người Mỹ gốc Phi. Trước công trình này, dữ liệu về kiến trúc di truyền toàn diện của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở quần thể người Kinh Việt Nam còn rời rạc, chủ yếu khảo sát các đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) phổ biến mà bỏ sót các biến thể cấu trúc phức tạp (Structural Variants - SV), biến thể số bản sao (Copy Number Variants - CNV) cũng như các biến thể mới đặc thù quần thể.

Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học mã số 9420201 của nghiên cứu sinh Vũ Phương Nhung, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hải Hà và GS. Nông Văn Hải tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giải quyết trực diện khoảng trống học thuật này. Các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học được xác lập:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Tần số phân bố của các allele đã biết và các biến thể số bản sao (CNV/SV) của bốn gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 ở người Kinh Việt Nam là bao nhiêu?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Có tồn tại các biến thể di truyền mới (novel variants) trong vùng promoter, exon và intron của các gen này ở quần thể người Kinh hay không?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Mức độ ảnh hưởng chức năng sinh học của các biến thể mới đối với cấu trúc không gian và hoạt tính xúc tác của protein tương ứng được dự đoán như thế nào?
• Giả thuyết khoa học 1 (H1): Quần thể người Kinh mang đặc trưng phân bố allele chuyển hóa thuốc riêng biệt so với quần thể da trắng và có những haplotype/biến thể cấu trúc đặc thù khu vực Đông Nam Á.
• Giả thuyết khoa học 2 (H2): Phân tích giải trình tự sâu kết hợp phân tích số bản sao sẽ phát hiện các biến thể mới chưa từng công bố trên cơ sở dữ liệu quốc tế PharmVar, gây suy giảm hoặc mất hoạt tính xúc tác enzyme.

Khung lý thuyết của luận án tích hợp Thuyết chuyển hóa sinh học ngoại lai (Xenobiotic Biotransformation Theory), Mô hình động học enzyme Michaelis-Menten và Cấu trúc vị trí nhận biết cơ chất (Substrate Recognition Sites - SRS) của enzyme CYP450. Nghiên cứu thực hiện trên cỡ mẫu 136 cá thể người Kinh khỏe mạnh không có quan hệ huyết thống, tạo lập bộ cơ sở dữ liệu hệ gen dược học chuẩn hóa đầu tiên tại Việt Nam, mang ý nghĩa tiên phong trong việc định hình nền tảng y học cá thể hóa (personalized medicine).

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về Cytochrome P450 khởi nguồn từ phát hiện đầu tiên của Klingenberg (1954) về sắc tố tế bào hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 450 nm trong microsome gan, tiếp nối bởi công trình kinh điển của Estabrook và cộng sự (1963) cùng Cooper và cộng sự (1965) chứng minh vai trò xúc tác của CYP450 trong phản ứng hydroxyl hóa steroid và chuyển hóa thuốc. Trong nửa thế kỷ qua, y văn quốc tế đã hình thành ba dòng nghiên cứu chính:

1. Dòng nghiên cứu di truyền dược học chức năng: Xác lập mối liên kết giữa các SNP mã hóa kinh điển (CYP2C9*2, *3; CYP2C19*2, *3, *17; CYP2D6*4, *10; CYP3A5*3) với sự biến đổi dược động học (PK) và dược lực học (PD) của các thuốc có chỉ số điều trị hẹp như warfarin, clopidogrel, tamoxifen, codeine và tacrolimus (Relling & Evans, 2015; Caudle et al., CPIC guidelines).
2. Dòng nghiên cứu biến thể cấu trúc và số bản sao: Tập trung vào các tái tổ hợp tương đồng không tương hỗ (non-allelic homologous recombination) tại locus CYP2D6 và CYP2A6, dẫn đến mất toàn bộ gen (CYP2D6*5), nhân bản gen (CYP2D6*1xN, *2xN) hoặc hình thành các gen lai bất thường (CYP2D6*13, CYP2D6*36-*10) (Gaedigk et al., 2008, 2017).
3. Dòng nghiên cứu điều hòa biểu hiện ngoài vùng mã hóa: Phân tích các SNP tại vùng promoter và intron sâu ảnh hưởng đến vị trí bám của các yếu tố phiên mã (như Nrf2, PXR, CAR) hoặc tạo vị trí cắt nối ẩn (cryptic splice sites) như allele CYP3A5*3 (6986A>G) gây dịch khung và cắt ngắn chuỗi polypeptide (Kuehl et al., 2001; van Schaik et al., 2002).

Trong y văn tồn tại hai cuộc tranh luận học thuật nổi bật. Tranh luận thứ nhất xoay quanh việc liệu chỉ giải trình tự vùng exome (chiếm 1,5% hệ gen) có đủ để giải thích toàn bộ sự biến thiên kiểu hình chuyển hóa hay không. Một số tác giả cho rằng các biến thể vùng không mã hóa như CYP2C19*17 (-806C>T) làm tăng biểu hiện mRNA gấp 1,9 lần (Sim et al., 2006) hay biến thể intron CYP2C9 rs7089580 quyết định liều warfarin (Cavallari et al., 2011), chứng minh tầm quan trọng bắt buộc của vùng điều hòa. Tranh luận thứ hai liên quan đến độ chính xác của các xét nghiệm thương mại (SNP array như AmpliChip CYP450 hay Luminex Taq-It) khi không thể phân tách chính xác số lượng bản sao cụ thể và bỏ sót các cấu trúc lai như CYP2D6*36-*10, dẫn đến việc phân loại sai kiểu hình từ IM thành EM hoặc ngược lại.

Về mặt định vị khoa học, luận án đã lấp đầy khoảng trống dữ liệu khu vực Đông Nam Á thông qua việc so sánh đối sánh trực tiếp với hai nhóm nghiên cứu quốc tế lớn:

• So sánh với quần thể người da trắng (Caucasian): Quần thể da trắng có tần số allele mất chức năng CYP2C9*2 (p.Arg144Cys) chiếm 10–15% và CYP2D6*4 chiếm 15–20%, dẫn đến tỷ lệ kiểu hình PM ở CYP2D6 lên tới 5–10% (Ingelman-Sundberg, 2005). Ngược lại, nghiên cứu chứng minh người Kinh Việt Nam hầu như vắng bóng CYP2C9*2 và CYP2D6*4, nhưng lại chiếm ưu thế tuyệt đối bởi allele giảm chức năng CYP2D6*10 (43,75%) và gen lai CYP2D6*36-*10 (12,13%).
• So sánh với các quần thể Đông Á (Han Chinese, Japanese): Mặc dù có sự tương đồng về tần số cao của CYP2D6*10 và CYP3A5*3, luận án phát hiện quần thể người Kinh Việt Nam sở hữu phổ biến thể mới độc bản không xuất hiện trong cơ sở dữ liệu của người Hán hay người Nhật Bản, đồng thời xác định tỷ lệ mang gen lai CYP2D6*36-*10 và mất đoạn CYP2D6*5 có cấu trúc haplotype đặc thù.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng trực tiếp Lý thuyết Dược lý học Hệ gen (Pharmacogenomics Theory) và Lý thuyết Cấu trúc Vị trí Nhận diện Cơ chất (Gotoh’s Substrate Recognition Sites Framework). Cụ thể:

• Mở rộng mô hình xác định kiểu hình enzyme: Luận án chứng minh rằng công thức tính điểm hoạt tính (Activity Score - AS) của CYP2D6 theo chuẩn quốc tế cần phải tích hợp chặt chẽ việc phát hiện gen lai thể lặp CYP2D6*36-*10. Nếu chỉ xác định SNP 100C>T mà không khảo sát biến thể cấu trúc, các cá thể mang cấu trúc tandem *36-*10 sẽ bị đánh giá sai lệch hoạt tính enzyme.
• Bổ sung các locus bảo thủ tiến hóa: Nghiên cứu cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tính bảo thủ cao độ của amino acid Proline tại vị trí 363 trên protein CYP2C9 và Arginine tại vị trí 329 trên protein CYP2D6. Các đột biến mới phát hiện tại những vị trí này làm thay đổi cấu hình không gian bậc ba của enzyme, thách thức tính ổn định của liên kết phối tử-nhân heme.

[Kiểu gen: SNPs/Indels + CNVs/SVs] 
[Khung đọc mở & Điều hòa phiên mã (Promoter/Intron/Splicing)]
[Cấu trúc bậc 3 Protein & Động học SRS/Nhân Heme]
[Điểm hoạt tính Enzyme (Activity Score: PM / IM / EM / UM)]
[Tốc độ thanh thải thuốc (PK/PD) & Nguy cơ ADRs lâm sàng]

Khung phân tích độc đáo

Luận án thiết lập một khung phân tích tích hợp đa tầng, dung hợp ba lý thuyết nền tảng: Lý thuyết Tiến hóa Phân tử và Mất cân bằng Liên kết (Linkage Disequilibrium - LD), Lý thuyết Cấu trúc Protein Xúc tác, và Lý thuyết Dược động học Quần thể.

                      KHUNG PHÂN TÍCH TÍCH HỢP ĐA TẦNG

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: áp dụng cho quần thể người trưởng thành thuộc tộc người Kinh, không mắc các bệnh lý di truyền đơn gen nghiêm trọng, và phân tích trên mẫu DNA hệ gen từ máu ngoại vi (đại diện cho trạng thái di truyền tế bào mầm - germline, không bao gồm các đột biến xôma trong mô ung thư).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lập trường nhận thức luận thực chứng thực nghiệm (Positivism/Post-positivism), kết hợp thiết kế định lượng đa phương pháp (triangulation methodology) ở cấp độ phân tử. Thiết kế nghiên cứu bao quát từ mức độ phân tích DNA, mô hình hóa tin sinh học đến phân tích dịch tễ học di truyền quần thể.

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 136 cá thể người Kinh khỏe mạnh, không có quan hệ huyết thống ít nhất ba thế hệ, được thu thập ngẫu nhiên tại Việt Nam. Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu (inclusion criteria) bao gồm: là người Kinh thuần chủng, đủ năng lực hành vi dân sự, tự nguyện ký văn bản đồng ý tham gia nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ (exclusion criteria): các cá thể có tiền sử mắc các bệnh lý mạn tính nặng, rối loạn chức năng gan thận, hoặc có quan hệ họ hàng với các cá thể khác trong nhóm nghiên cứu.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình kỹ thuật được thực hiện nghiêm ngặt qua các bước độc lập và kiểm chứng chéo:

1. Tách chiết và kiểm định chất lượng DNA: Tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại vi chống đông bằng EDTA. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được đo quang phổ tại bước sóng 260/280 nm (đạt tỷ lệ chuẩn 1,8–2,0) và kiểm tra độ nguyên vẹn bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2. Thiết kế mồi và PCR đặc hiệu locus: Thiết kế các cặp mồi chuyên biệt khuếch đại toàn bộ vùng promoter (khoảng 1,5 kb ngược chiều), toàn bộ 9 exon cùng các vùng biên intron tiếp giáp của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, và các exon chức năng (*3, *6, *8, *9) của CYP3A5. Hệ thống mồi được tối ưu hóa nghiêm ngặt nhằm triệt tiêu hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu với các gen giả có độ tương đồng cao như CYP2D7 và CYP2D8.
3. Giải trình tự trực tiếp Sanger: Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng enzyme ExoSAP-IT được thực hiện phản ứng giải trình tự chu kỳ với bộ hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Sản phẩm được biến tính và điện di mao quản trên Hệ thống Giải trình tự Tự động ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
4. Phân tích biến thể số bản sao bằng MLPA: Sử dụng bộ kit chuyên dụng SALSA MLPA probemix (MRC-Holland). Phản ứng bao gồm các bước biến tính mẫu DNA, lai với hỗn hợp đầu dò đặc hiệu, ghép nối phụ thuộc phản ứng nối (ligation), và khuếch đại PCR sử dụng mồi đánh dấu huỳnh quang. Dữ liệu thô từ máy ABI 3500 được xử lý và chuẩn hóa bằng phần mềm chuyên dụng Coffalyser.Net để trích xuất tỷ lệ liều lượng gen (Dosage Quotient - DQ). Giá trị DQ từ 0,8–1,2 tương ứng với 2 bản sao bình thường, DQ từ 0,4–0,65 tương ứng mất 1 bản sao (mất đoạn dị hợp tử), và DQ từ 1,3–1,6 tương ứng lặp 1 bản sao (3 bản sao).
5. Kỹ thuật kiểm chứng độc lập: Các mẫu phát hiện bất thường số bản sao hoặc nghi ngờ mang allele CYP2D6*5 (mất toàn bộ gen) được kiểm chứng độc lập bằng Long-Range PCR (LR-PCR) với đoạn khuếch đại kích thước lớn (~12 kb) sử dụng enzyme PrimeSTAR GXL DNA Polymerase. Biến thể mất bản sao của CYP2C9 được kiểm chứng lại bằng Real-time PCR định lượng tương đối qua chu kỳ ngưỡng Ct.

                             SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

Data và phân tích

Dữ liệu điện di mao quản được đọc và căn chỉnh tự động bằng phần mềm Sequencing Analysis, BioEdit và ChromasPro để phát hiện các đột biến điểm, chèn/mất đoạn nhỏ (indels). Trạng thái cân bằng di truyền Hardy-Weinberg (HWE) được đánh giá bằng kiểm định Chi-bình phương ($\chi^2$) với mức ý nghĩa thống kê $p > 0,05$. Phân tích cấu trúc haplotype và độ mất cân bằng liên kết (Linkage Disequilibrium - LD) với các chỉ số $D'$ và $r^2$ được thực hiện trên phần mềm Haploview v4.2.

Đánh giá tác động chức năng của các đột biến mới được tiến hành đồng thời qua các thuật toán tin sinh học in silico độc lập:

• PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping v2): Dự đoán tác động của đột biến sai nghĩa lên cấu trúc và chức năng protein dựa trên đặc điểm cấu trúc vật lý và sự bảo thủ tiến hóa (phân loại thành Benign, Possibly Damaging, Probably Damaging với điểm số từ 0 đến 1).
• PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer): Đánh giá mức độ biến đổi trình tự amino acid thông qua ma trận tương đồng (ngưỡng cắt -2.5, điểm dưới -2.5 được xếp loại Deleterious).
• Human Splicing Finder (HSF v3.1): Đánh giá các biến thể vùng intron và promoter xem có tạo ra hoặc phá vỡ các vị trí nhận biết cắt nối (donor/acceptor splice sites, branch points) hay làm mất vị trí bám của các yếu tố điều hòa phiên mã hay không.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Nghiên cứu mang lại hệ thống dữ liệu đột phá với độ tin cậy thực nghiệm cao:

TỔNG HỢP CÁC BIẾN THỂ VÀ PHÂN BỐ TẦN SỐ ALLELE ĐẶC TRƯNG TẠI QUẦN THỂ NGƯỜI KINH

1. Phát hiện 16 biến thể di truyền mới: Luận án đã định danh thành công 5 biến thể mới trong intron của CYP2C9, 3 biến thể mới trong intron của CYP2C19, 3 biến thể mới trong promoter và 2 biến thể mới trong intron của CYP2D6, cùng với 3 biến thể mới thuộc vùng mã hóa exon của CYP2C9 và CYP2D6. Cụ thể:
   • Biến thể CYP2C9 42627C>A làm biến đổi acid amin Proline 363 (vị trí có tính bảo thủ tiến hóa tuyệt đối qua các loài động vật có vú), được cả PolyPhen-2 và PROVEAN dự đoán là đột biến có hại nghiêm trọng (Probably Damaging/Deleterious) đối với hoạt tính enzyme.
   • Hai biến thể CYP2D6 3157G>T và 2988G>A gây thay đổi acid amin Arginine 329, phá vỡ cấu trúc chuỗi xoắn cục bộ gần trung tâm hoạt động.
2. Lập bản đồ biến thể cấu trúc phức tạp của CYP2D6: Luận án lần đầu tiên định lượng chính xác tỷ lệ các biến thể làm giảm hoặc mất hoạt tính CYP2D6 ở người Kinh: "Các biến thể CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*13 và CYP2D6*36-*10 đã được xác định trên người Kinh ở Việt Nam là những biến thể làm giảm hoặc mất hoạt tính của enzyme đã được xác định với tỉ lệ lần lượt là: 8,09%, 43,75%, 1,547% và 12,13%". Tổng cộng, trên 65% số allele CYP2D6 trong quần thể người Kinh mang các biến thể làm suy giảm hoặc triệt tiêu chức năng enzyme, khiến đa số cá thể người Kinh thuộc kiểu hình chuyển hóa trung bình (IM).
3. Đặc trưng tần số allele CYP3A5 và CYP2C19: Xác định tần số vượt trội của allele CYP3A5*3 (6986A>G), dẫn đến tỷ lệ rất cao các cá thể đồng hợp tử *3/*3 không biểu hiện protein CYP3A5 chức năng trong gan. Đối với CYP2C19, hai allele mất chức năng *2 và *3 chiếm tỷ lệ cao, trong khi allele tăng cường chức năng *17 xuất hiện với tần số thấp (<5%), tương đồng với các quần thể Đông Á nhưng khác biệt sâu sắc với người da trắng và người gốc Phi (~30%).
4. Phát hiện hiện tượng mất số bản sao của CYP2C9: Lần đầu tiên ghi nhận trường hợp mất toàn bộ 1 bản sao của gen CYP2C9 ở người Kinh thông qua phân tích MLPA và được kiểm chứng thành công bằng Real-time PCR.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết và phương pháp: Công trình xác lập quy chuẩn rằng việc phân tích kiểu gen dược học trong các quần thể châu Á bắt buộc phải kết hợp đồng thời giải trình tự Sanger và phân tích MLPA/LR-PCR để phát hiện biến thể cấu trúc lai, loại trừ hoàn toàn các kết quả âm tính giả hoặc phân loại sai kiểu hình.
• Về mặt thực tiễn lâm sàng:
  • Thuốc chống đông Warfarin: Sự hiện diện của CYP2C9*3 kết hợp với hiện tượng mất bản sao đòi hỏi phác đồ khởi đầu liều thấp hơn liều chuẩn của người phương Tây (thay vì 4–5 mg/ngày, cần giảm 30–50%) để tránh biến cố xuất huyết nghiêm trọng trước khi đạt chỉ số INR cân bằng.
  • Thuốc chống kết tập tiểu cầu Clopidogrel: Tỷ lệ cao kiểu hình IM và PM do CYP2C19*2 và *3 làm tăng nguy cơ kháng clopidogrel, tiểu cầu tiếp tục kết tập qua thụ thể P2RY12 gây tắc mạch tái phát. Nghiên cứu cung cấp căn cứ chỉ định các thuốc thay thế không phụ thuộc CYP2C19 như Ticagrelor hoặc Prasugrel.
  • Thuốc hướng thần và giảm đau chuyển hóa qua CYP2D6: Tỷ lệ allele giảm hoạt tính (*10, *36-*10) vượt trội giải thích tại sao người Việt Nam thường gặp tác dụng phụ ngoại tháp khi dùng liều chuẩn các thuốc an thần kinh, đồng thời kém đáp ứng với tiền chất giảm đau Codeine do giảm tốc độ chuyển hóa thành Morphine có hoạt tính.
  • Thuốc ức chế miễn dịch Tacrolimus: Kiểu gen đồng hợp tử CYP3A5*3/*3 chiếm ưu thế chỉ ra rằng đa số bệnh nhân ghép tạng người Việt Nam là nhóm "non-expressors", có tốc độ thanh thải tacrolimus chậm, đòi hỏi liều tích lũy thấp hơn để tránh ngộ độc thận.
• Về mặt chính sách y tế: Cung cấp cơ sở khoa học xác đáng để Bộ Y tế Việt Nam xây dựng danh mục xét nghiệm di truyền dược học bắt buộc trước khi điều trị các thuốc có độc tính cao, hướng tới mục tiêu tối ưu hóa chi phí bảo hiểm y tế và an toàn người bệnh.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những đóng góp học thuật xuất sắc, luận án thẳng thắn thừa nhận các giới hạn nghiên cứu:

1. Giới hạn phạm vi quần thể: Nghiên cứu chỉ tập trung trên nhóm người Kinh, chưa mở rộng khảo sát 53 dân tộc thiểu số khác tại Việt Nam (như Tày, Mường, H'Mông, Khmer), nơi có thể tồn tại các đặc trưng di truyền biệt lập.
2. Cỡ mẫu nghiên cứu: Với $n = 136$ cá thể (272 nhiễm sắc thể), nghiên cứu có đủ độ mạnh thống kê để phát hiện các biến thể phổ biến ($MAF > 5%$) và trung bình ($MAF: 1–5%$), nhưng còn hạn chế trong việc nhận diện các biến thể cực hiếm ($MAF < 0,5%$).
3. Mức độ kiểm chứng chức năng: Tác động của các biến thể mới chủ yếu được đánh giá thông qua các thuật toán mô phỏng in silico (PolyPhen-2, PROVEAN, HSF), chưa thực hiện các thử nghiệm biểu hiện protein tái tổ hợp in vitro (recombinant enzyme kinetics) hoặc đo nồng độ thuốc trực tiếp trên huyết tương người mang đột biến (in vivo pharmacokinetic validation).

Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda) được hoạch định:

• Hướng 1: Mở rộng nghiên cứu đa hình hệ gen dược học trên quy mô quốc gia, bao gồm các nhóm dân tộc thiểu số vùng cao nhằm thiết lập bản đồ dược lý di truyền toàn diện của Việt Nam.
• Hướng 2: Ứng dụng công nghệ giải trình tự chuỗi dài thế hệ mới (Long-read Sequencing như PacBio HiFi hoặc Oxford Nanopore) để giải quyết triệt để cấu trúc haplotype và các điểm đứt gãy phức tạp của các biến thể cấu trúc CYP2D6.
• Hướng 3: Tiến hành các thử nghiệm in vitro biểu hiện protein đột biến mới (CYP2C9 Pro363, CYP2D6 Arg329) trên hệ thống tế bào biểu mô côn trùng (Sf9/baculovirus) để đo lường trực tiếp các thông số động học $K_m$ và $V_{max}$.
• Hướng 4: Triển khai các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng (RCT) ứng dụng xét nghiệm panel gen CYP450 để định liều warfarin và clopidogrel tại các bệnh viện tuyến trung ương tại Việt Nam.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật (Academic Impact): Công trình là tài liệu tham khảo nền tảng trong lĩnh vực công nghệ sinh học y dược và di truyền người tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã đóng góp dữ liệu allele và các biến thể mới vào kho lưu trữ quốc tế (NCBI GenBank, PharmVar), nâng cao vị thế của khoa học hệ gen Việt Nam trên trường quốc tế.
• Tác động ngành công nghiệp dược phẩm (Industry Transformation): Cung cấp hệ thống chỉ thị phân tử (biomarkers) chuẩn xác cho các công ty dược phẩm và công nghệ sinh học trong nước phát triển các bộ sinh phẩm (diagnostic kits) xét nghiệm nhanh đa hình CYP450 dựa trên kỹ thuật Multiplex PCR hoặc Real-time PCR giá thành thấp, phù hợp điều kiện lâm sàng Việt Nam.
• Ảnh hưởng chính sách y tế công cộng (Policy Influence): Là bằng chứng thực tiễn hỗ trợ Hội đồng Dược thư Quốc gia và Bộ Y tế trong việc chuẩn hóa phác đồ sử dụng thuốc cá thể hóa, giảm thiểu tỷ lệ biến chứng nội viện do ADR.
• Lợi ích xã hội (Societal Benefits): Giúp giảm thiểu gánh nặng tài chính điều trị các ca ngộ độc thuốc, rút ngắn thời gian nằm viện của bệnh nhân, và nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh điều trị mạn tính (tim mạch, ung thư, tâm thần).

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học viên sau đại học: Tiếp cận phương pháp luận chuẩn mực về thiết kế nghiên cứu di truyền dược học, quy trình xử lý dữ liệu sequencing, phân tích MLPA và kỹ năng phân tích haplotype/LD.
• Các nhà khoa học và giảng viên chuyên ngành: Sử dụng nguồn dữ liệu hệ gen tin cậy để giảng dạy, phát triển các hướng nghiên cứu chuyên sâu về enzymology và tương tác gen-thuốc.
• Bác sĩ lâm sàng và dược sĩ bệnh viện: Có được bảng tham chiếu tần số kiểu gen người Kinh để giải thích các trường hợp bất thường trong đáp ứng thuốc (như kháng clopidogrel, ngộ độc warfarin, xuất hiện hội chứng ngoại tháp khi dùng thuốc an thần).
• Bộ phận R&D công ty dược phẩm/công nghệ sinh học: Cơ sở thiết kế các nghiên cứu tương đương sinh học (bioequivalence) và thử nghiệm lâm sàng thuốc mới có tính đến yếu tố phân tầng di truyền của người Việt.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào? Luận án đã mở rộng Lý thuyết Vị trí Nhận biết Cơ chất (SRS) của Cytochrome P450 và Lý thuyết Điểm Hoạt tính Dược di truyền thông qua việc chứng minh vị trí Proline 363 trên CYP2C9 và Arginine 329 trên CYP2D6 là các mắt xích cấu trúc bảo thủ trọng yếu. Việc phát hiện các đột biến sai nghĩa mới tại các vị trí này làm biến đổi không gian vị trí gắn cơ chất, bổ sung bằng chứng thực nghiệm cho thấy các mô hình tính điểm hoạt tính toàn cầu cần phải được tinh chỉnh khi áp dụng cho các quần thể Đông Nam Á.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận cốt lõi so với các nghiên cứu trước đây là gì? Khác với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam vốn chỉ sử dụng PCR-RFLP hoặc giải trình tự từng đoạn ngắn khảo sát vài SNP đơn lẻ, luận án đã thiết lập quy trình tích hợp ba cấp độ: (1) Resequencing toàn bộ promoter, 9 exon và vùng biên intron; (2) Sử dụng MLPA kết hợp phần mềm Coffalyser.Net để định lượng tuyệt đối số bản sao; (3) Kiểm chứng chéo các biến thể cấu trúc phức tạp (CYP2D6*5, CYP2D6*36-*10) bằng Long-Range PCR (~12 kb) và Real-time PCR. Cách tiếp cận này loại trừ triệt để hiện tượng phân loại sai kiểu hình do gen lai hoặc mất đoạn.

3. Phát hiện nào gây bất ngờ nhất về mặt dữ liệu thực nghiệm? Phát hiện bất ngờ nhất là tỷ lệ tích lũy của các biến thể làm giảm và mất chức năng của CYP2D6 ở người Kinh lên tới hơn 65% (trong đó CYP2D6*10 chiếm 43,75% và gen lai bất thường CYP2D6*36-*10 chiếm tới 12,13%). Điều này chứng minh rằng trái ngược với sách giáo khoa y khoa kinh điển vốn mặc định đa số người bệnh thuộc kiểu hình chuyển hóa bình thường (EM), đại bộ phận quần thể người Kinh thực tế mang kiểu hình chuyển hóa trung bình (IM), đòi hỏi phải tái định chuẩn liều lượng cho hơn 25% các thuốc chuyển hóa qua CYP2D6 trên lâm sàng.

4. Nghiên cứu có cung cấp giao thức tái lặp (replication protocol) chi tiết không? Có. Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ trình tự các cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho từng exon và vùng promoter của 4 gen, thành phần hóa chất phản ứng PCR, chu trình nhiệt tối ưu, các thông số điện di mao quản trên máy ABI 3500, cũng như thuật toán và ngưỡng giá trị DQ trong phân tích MLPA bằng Coffalyser.Net, cho phép bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học phân tử đạt chuẩn nào cũng có thể tái lặp quy trình.

5. Lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình như thế nào? Lộ trình 10 năm hướng tới: (1) Ứng dụng giải trình tự hệ gen chuỗi dài (Long-read WGS) trên cỡ mẫu 5.000–10.000 cá thể thuộc 54 dân tộc Việt Nam; (2) Thiết lập Biobank và cơ sở dữ liệu quốc gia về Dược di truyền học Việt Nam (VN-PGx); (3) Triển khai thử nghiệm lâm sàng tích hợp chỉ thị CYP450 vào hệ thống Bệnh án Điện tử (EMR) tại các bệnh viện trọng điểm; (4) Sản xuất thương mại chip giải trình tự chẩn đoán nhanh phục vụ chỉ định thuốc cá thể hóa.

Kết luận

1. Xây dựng thành công bộ cơ sở dữ liệu toàn diện về đa hình nucleotide (SNP, Indel), biến thể số bản sao (CNV) và biến thể cấu trúc (SV) của bốn gen chuyển hóa thuốc cốt lõi CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên quần thể người Kinh Việt Nam.
2. Phát hiện và công bố 16 biến thể di truyền mới, trong đó có 3 đột biến sai nghĩa tại các vị trí acid amin bảo thủ trọng yếu (CYP2C9 Pro363, CYP2D6 Arg329) được chứng minh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chức năng xúc tác của protein.
3. Lập bản đồ phân bố allele chính xác, chứng minh tỷ lệ áp đảo của các biến thể giảm/mất hoạt tính: CYP2D6*10 (43,75%), CYP2D6*36-*10 (12,13%), CYP2D6*5 (8,09%), CYP3A5*3 (tần số cao tạo kiểu hình non-expressor), và sự vắng bóng đặc thù của CYP2C9*2, CYP2D6*4.
4. Đột phá phương pháp luận khi kết hợp thành công giải trình tự Sanger chuyên sâu với kỹ thuật MLPA, Long-Range PCR và mô hình hóa in silico, thiết lập quy chuẩn xét nghiệm dược di truyền chuẩn xác cho Việt Nam.
5. Mở ra ba dòng nghiên cứu ứng dụng mới: (i) Dược lý học lâm sàng cá thể hóa liều thuốc chống đông, chống kết tập tiểu cầu và thuốc hướng thần; (ii) Phát triển kít chẩn đoán phân tử phục vụ y tế dự phòng; (iii) Sinh học cấu trúc protein enzyme CYP450 đột biến.
6. Đặt nền móng khoa học vững chắc cho các chính sách y tế công cộng và hướng dẫn quốc gia về điều trị cá thể hóa, đóng góp trực tiếp vào công cuộc nâng cao chất lượng điều trị và an toàn sức khỏe cho người Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan Thuốc là những chế phẩm có chứa dược chất dùng với mục đích phòng-chữa bệnh hay điều trị giảm nhẹ. Enzyme chuyển hóa thuốc được biết đến nhiều nhất là các enzyme CYP450, đây là những enzyme tham gia vào các quá trình oxi hóa khử và thủy phân. Mục tiêu chính của quá trình chuyển hóa thuốc đó là giúp đào thải thuốc ra khỏi cơ thể.

Ví dụ như các tiền chất (không có hoạt tính dược lý) sau khi được hấp thụ vào cơ thể sẽ được chuyển đổi thành thuốc có hoạt tính. Mặt khác đa số các loại thuốc sau khi chuyển hóa sẽ chuyển sang trạng thái kém hoạt động hơn. Quá trình chuyển hóa thuốc xảy ra ở nhiều cơ quan trong cơ thể như gan, thành ruột, phổi, thận và huyết tương. Trong số đó, gan là cơ quan chuyển hóa thuốc đầu tiên, đóng vai trò như vị trí thải độc và loại thải các chất ngoại lai bằng cách biến đổi các hợp chất tan trong lipid trở nên ưa nước hơn, quá trình này có sự tham gia của các enzyme.

Quá trình chuyển hóa thuốc tại gan trải qua 3 giai đoạn: pha I, pha II và pha III. Trong đó pha I có sự tham gia của các enzyme CYP450, pha II được thực hiện bởi các enzyme vận chuyển acid glucuronic của UDP (UDP-glucuronosyltransferase) (chuyển hóa 40-70% các loại thuốc) và trong pha III thì các enzyme vận chuyển thuốc (drug transporter) sẽ giúp đưa sản phẩm chuyển hóa thuốc tới mật. Klingenberg lần đầu tiên phát hiện ra CYP450 vào năm 1954 trong nghiên cứu về chuyển hóa hoocmon steroid, khi ông trích xuất một loại protein mới từ tế bào gan [1]. Gần một thập kỷ sau, chức năng và tầm quan trọng của CYP450 đã được xác định.

Năm 1963, Estabrook và cộng sự đã mô tả vai trò của CYP450 như một chất xúc tác trong quá trình tổng hợp hormone steroid và chuyển hóa thuốc. Cooper và các đồng nghiệp sau đó đã xác nhận CYP450 là một enzyme chủ chốt liên quan đến phản ứng hydroxyl hóa thuốc và steroid [2]. Nhiều protein CYP450 đã được phát hiện rộng khắp cơ thể, chứng tỏ sự tham gia đáng kể vào hoạt hóa hóa học, khử hoạt tính và gây ung thư [3]. Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I là các protein biểu hiện chủ yếu trên mạng lưới nội chất trơn và ti thể của các tế bào gan và biểu mô ruột non (ngoài ra cũng còn ở một số cơ quan khác).

Ở người, có 115 gen CYP450 bao gồm luan an 5 cả các gen giả, được đặt tên bắt đầu từ CYP1A1 và kết thúc bởi CYP51P3. Các protein được mã hóa bởi các CYP450 được phân loại dựa trên mức độ tương đồng về trình tự của các amino acid thành các cấp độ từ họ (ví dụ: họ CYP1, CYP2…), phân họ (ví dụ: phân họ CYP1A, CYP2B…) và từng enzyme riêng lẻ (ví dụ: enzyme CYP1A1, CYP2D6…). Trong số các CYP450 biểu hiện trong gan thì CYP3A4 có mức độ biểu hiện mạnh nhất (chiếm 22,1%), tiếp theo là 2 enzyme CYP2E1 (15,3%) và CYP2C9 (14,6%) tính trên tổng số protein trong gan. Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác cho nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa vòng (nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất không vòng, khử (tách) nhóm N-alkyl, khử (tách) nhóm O-alkyl (alkoxy).

Trong số các phản ứng này, phản ứng oxi hóa là phản ứng giúp thêm một nguyên tử oxy vào phân tử thuốc, được biểu diễn bằng phương trình sau: NADPH + H+ + O2 + RH → NADP+ + H2O + ROH Về mặt cấu trúc, CYP450 là những protein có khoảng 400-500 amino acid và chứa một nhóm heme với nguyên tử Fe ở trung tâm. Tất cả các CYP450 đều có chung cấu trúc bảo thủ được tạo nên bởi bốn vòng xoắn D, L, I và E. Trong đó nhóm heme nằm giữa vòng xoắn I và L. Mặc dù cấu trúc dạng gấp cuộn của CYP450 có tính bảo thủ cao, vẫn có sự đa dạng trong cấu trúc của các họ CYP450 khác nhau từ đó cho phép protein này kết hợp với các cơ chất với kích thước khác nhau và mức độ đặc hiệu khác nhau.

Một số CYP450 có tính đặc hiệu cao trong quá trình oxi hóa cơ chất, trong khi đó CYP3A4 lại tham gia chuyển hóa hơn 50% các loại thuốc trên thị trường hiện nay. Ở mức độ đơn giản nhất về mặt cấu hình nhận biết và kết hợp với cơ chất thì có 6 vị trí nhận biết cơ chất (Substrate recognition site-SRS). Các vị trí này bao gồm vùng xoắn B' (SRS1), một phần của các chuỗi xoắn F và G (SRS2 và SRS3), một phần của chuỗi xoắn I (SRS4), vùng β2 của chuỗi xoắn K (SRS6) và cấu trúc kẹp tóc β4 (SRS5) ở trung tâm hoạt động của CYP450 (Hình 1. Trên thực tế, các SRS định trước tính đặc hiệu cơ chất của các CYP450 và những đột biến điểm xảy ra tại các vị trí này do đó có thể ảnh hưởng đến độ đặc hiệu đối với cơ chất [4].

Các SRS là những vùng cấu trúc linh hoạt, có thể di chuyển khi kết hợp với cơ chất và có khả năng cảm ứng phù hợp với cơ chất, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho mối liên kết enzyme-cơ chất và sau đó là phản ứng xúc tác [5]. luan an 6 Hình 1. Cấu trúc của CYP450 và các vị trí nhận biết cơ chất (SRS) [6]. CYP450 có cấu trúc gấp nếp bảo thủ và được thể hiện bởi các vòng xoắn (đánh dấu bằng các chữ cái in hoa).

Các SRS được tô đậm tối màu. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc. Các gen chuyển hóa là một phần của hệ các gen dược học. Đây là những gen đóng vai trò quan trọng trong biến đổi sinh học của thuốc, những thay đổi trong di truyền của các gen này góp phần tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong đáp ứng thuốc [7].

Các gen liên quan đến chuyển hóa thuốc bao gồm gen mã hóa cho các enzyme tham gia chuyển hóa thuốc pha I và pha II. Các enzyme chuyển hóa thuốc có mức độ đa hình rất cao trong biểu hiện và hoạt tính của chúng. Các CYP450 chính là nguồn gốc chính gây ra sự đa dạng trong dược động học và dược lý học của thuốc. Các protein CYP450 biểu hiện mạnh nhất trong gan bao gồm CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19, CYP2C8, CYP2E1 và CYP1A2.

Trong khi đó các protein CYP2A6, CYP2D6, CYP2B6 và CYP3A5 biểu hiện ít hơn. Các CYP450 khác như CYP2J2, CYP1A1 và CYP1B1 biểu hiện chủ yếu ở ngoài gan. Các kiểu đa luan an 7 hình di truyền khác nhau của các gen CYP450 sẽ quyết định về mặt chức năng và kiểu hình chuyển hóa thuốc (PM, IM, EM và UM). Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất hiện nay là CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A4/5.

Năm gen CYP450 nói trên mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc thường được kê đơn. Trong số các protein thuộc 18 họ CYP450, các protein có tính đa hình cao nhất là CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6 và CYP2C19. Bên cạnh đó có một số protein CYP450 thuộc các phân họ khác có tính đa hình thấp hơn như CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1. Về chức năng chuyển hóa thuốc, CYP3A4/5 tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất, tiếp theo là các enzyme CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 và CYP2E (Hình 1.

Phần tổng quan này trình bày khái quát về đa hình 04 gen mã hóa cho các enzyme CYP450 chính tham gia chuyển hóa thuốc pha I bao gồm: CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5. Đa dạng di truyền các gen CYP450 và vai trò trong chuyển hóa thuốc [8]. (a)Số lượng SNP trong một số gen CYP450. (b) Số lượng thuốc được chuyển hóa bởi các enzyme CYP450.

Các số trong biểu đồ thể hiện số lượng SNP/thuốc được chuyển hóa. Gen CYP2C9 Gen CYP2C9 nằm ở vai dài của nhiễm sắc thể số 10, mã hóa cho protein có 490 amino acid và có khối lượng phân tử là 55,6 kDa. Vùng gen chứa CYP2C9 cũng luan an 8 bao gồm các gen mã hóa cho các enzyme CYP2C8, CYP2C18 và CYP2C19. Trong số 4 gen này, CYP2C9 là gen biểu hiện mạnh nhất và tham gia nhiều nhất vào các quá trình chuyển hóa thuốc.

Trên thực tế, dữ liệu khối phổ cho thấy CYP2C9 chiếm 20% tổng số protein CYP450 trong gan. Ngoài gan, CYP2C9 cũng biểu hiện trong đường tiêu hóa. Sau CYP3A4 và CYP2D6, CYP2C9 là enzym quan trọng nhất thuộc họ cytochrome 450 tham gia vào các phản ứng oxi hóa và chuyển hóa khoảng 15% các loại thuốc lưu hành bao gồm cả một số thuốc có chỉ số trị liệu hẹp [9]. Sự khác biệt giữa các cá thể trong biểu hiện và hoạt tính của enzyme CYP2C9 có thể ảnh hưởng tới hiệu quả sử dụng và sự an toàn khi dùng thuốc.

Các phản ứng tương tác thuốc xảy ra do sự ức chế hay kích hoạt CYP2C9 và đa hình di truyền của gen này là nguyên nhân gây nên sự đa dạng trong hoạt tính của enzyme ở cấp độ in vivo [10, 11]. *Cơ chất đặc hiệu của CYP2C9 CYP2C9 tham gia vào quá trình oxi hóa của nhiều loại thuốc, đồng thời cũng tham gia chuyển hóa nhiều hợp chất nội sinh trong cơ thể như acid linoleic, acid arachidonic và các chất ngoại sinh không phải là thuốc khác (galangin, methiocarb, pyrene, sulprofos). Phần lớn các cơ chất của CYP2C9 là các hợp chất ở dạng acid yếu, tuy nhiên CYP2C9 cũng chuyển hóa dạng N-demethylation một số các loại thuốc như amitriptyline, fluoxetins và zopiclone. S-flurbiprofen, S-wafarin, tolbutamide, phenytoin, losartan và diclofenac đều là các cơ chất của CYP2C9.

Trong đó, Diclofenac và tolbutamide là các cơ chất thường xuyên được sử dụng trong các nghiên cứu đánh giá kiểu hình hoạt tính của enzyme. Nói chung, các loại thuốc là cơ chất chuyển hóa của CYP2C9 có thể phân làm các nhóm như thuốc chống đông máu, thuốc hạ huyết áp, các thuốc kháng viêm không phải steroid và thuốc hạ đường huyết dạng uống. *Đa hình di truyền của CYP2C9 và sự phân bố giữa các quần thể trên thế giới Allele CYP2C9*2 (3608C>T, p.Arg144Cys) và *3 (42614A>C, p.Ile359Leu) là những allele được nghiên cứu nhiều nhất, đồng thời đây cũng là những allele được nghiên cứu rộng rãi nhất tren nhiều quần thể người cho tới nay [12]. Đối với allele CYP2C9*2 và *3, các kết quả nghiên cứu cho thấy những biến thể này làm giảm chuyển hóa S-warfarin và tolbutamide in vitro.

Đồng thời những bệnh nhân có mang luan an 9 các biến thể này có liên quan chặt chẽ đến việc sử dụng warfarin với liều thấp hơn liều thông thường và tăng nguy cơ chảy máu [13].