Luận văn tốt nghiệp: Đột biến gen fat1 và phơi nhiễm dioxin ở người tại Thái Nguyên

Nghiên cứu đột biến gen fat1 ở người phơi nhiễm dioxin tại Sông Công, Thái Nguyên, góp phần hiểu rõ tác động của dioxin đến sức khỏe.

• Tác giả: Trần Thị Thu Trang
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đột Biến Gen FAT1 Ở Người Phơi Nhiễm Dioxin Tại Thái Nguyên
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
• 1.2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Dioxin và các chất tương tự dioxin
• 2.2. Lịch sử ô nhiễm dioxin ở Việt Nam
• 2.3. Tác hại của dioxin đối với con người
• 2.4. Các bệnh gây ra bởi dioxin
• 2.4.1. Bệnh thiểu năng trí tuệ (Intellectual Disability - ID)
• 2.4.2. Mối liên hệ giữa dioxin và bệnh thiểu năng trí tuệ
• 2.5. Tác động của dioxin đối với DNA người
• 2.6. Thụ thể Aryl Hydrocarbon Receptor
• 2.6.1. Cơ chế tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR
• 2.6.2. Cơ chế tác động của dioxin không thông qua thụ thể AhR
• 2.7. Dioxin có thể gây đột biến trên hệ gen, biến đổi vật chất di truyền
• 2.8. Tổng quan về gen FAT1 ở người
• 2.8.1. Đặc điểm gen FAT ở người
• 2.9. Đột biến gen FAT1 liên quan thiểu năng trí tuệ và các bệnh ID ở người
• 2.10. Tình hình nghiên cứu các nạn nhân bị phơi nhiễm dioxin và gen FAT1 trong nước và trên thế giới
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
• 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2.2. Dụng cụ thí nghiệm
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu máu
• 3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA
• 3.5.3. Phương pháp PCR
• 3.5.4. Giải trình tự Sanger
• 3.5.5. Phương pháp phân tích trình tự DNA in silico
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Kết quả thu thập mẫu sinh phẩm của người có liên quan tới phơi nhiễm dioxin
• 4.2. Kết quả tách chiết DNA
• 4.3. Kết quả PCR khuyếch đại gen FAT1
• 4.4. Kết quả giải trình tự và phân tích đột biến gen FAT1
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định đột biến gen FAT1 ở những người có liên quan đến phơi nhiễm dioxin tại Thái Nguyên. Gen FAT1 được biết đến với vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự phát triển và chức năng của tế bào. Việc nghiên cứu đột biến gen này có thể giúp hiểu rõ hơn về mối liên hệ giữa dioxin và các bệnh lý liên quan đến sức khỏe con người. Dioxin, một chất độc hại, đã được chứng minh là có khả năng gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, bao gồm cả bệnh tật và sức khỏe con người. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc hỗ trợ các nạn nhân bị ảnh hưởng bởi dioxin.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định biến thể tại exon 10 của gen FAT1 (A được thay thế bằng C ở vị trí 8798 trong cDNA), dẫn đến thay đổi trên protein FAT1. Việc xác định đột biến gen này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về mối liên hệ giữa phơi nhiễm dioxin và các rối loạn di truyền. Nghiên cứu này cũng nhằm bổ sung dữ liệu về người mắc chứng thiểu năng trí tuệ có liên quan tới phơi nhiễm dioxin qua các thế hệ, từ đó mở rộng hiểu biết về tác động của dioxin đối với sức khỏe con người.

II. Tổng quan về dioxin

Dioxin là một nhóm các hợp chất hóa học độc hại, tồn tại bền vững trong môi trường và có khả năng gây ra nhiều tác hại nghiêm trọng cho sức khỏe con người. Dioxin được phân loại thành ba nhóm chính: polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs), polychlorinated dibenzofurans (PCDFs) và polychlorinated biphenyls (PCBs). Trong đó, TCDD (2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin) được coi là đồng phân độc hại nhất. Dioxin có khả năng tích tụ trong cơ thể và gây ra các bệnh lý nghiêm trọng như ung thư, dị tật bẩm sinh và các rối loạn thần kinh. Việc nghiên cứu về dioxin không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tác động của nó đối với sức khỏe mà còn cung cấp cơ sở cho các chính sách hỗ trợ nạn nhân.

2.1. Tác động của dioxin đối với sức khỏe

Khi xâm nhập vào cơ thể, dioxin gây ra nhiều phản ứng sinh học có hại. Nó có thể làm tăng lipit trong máu, gây rối loạn trao đổi chất và dẫn đến các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng. Nghiên cứu cho thấy rằng dioxin không chỉ ảnh hưởng đến người bị phơi nhiễm mà còn có thể gây ra các dị tật bẩm sinh ở thế hệ tiếp theo. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc nghiên cứu đột biến gen liên quan đến dioxin để hiểu rõ hơn về các cơ chế di truyền và tác động lâu dài của nó.

III. Phân tích gen FAT1

Gen FAT1 đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự phát triển và chức năng của tế bào. Nghiên cứu về đột biến gen FAT1 có thể giúp xác định mối liên hệ giữa phơi nhiễm dioxin và các rối loạn di truyền. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng đột biến gen này có thể liên quan đến các bệnh lý như thiểu năng trí tuệ. Việc phân tích gen FAT1 sẽ cung cấp thông tin quý giá về cách mà dioxin có thể gây ra các thay đổi di truyền và ảnh hưởng đến sức khỏe con người.

3.1. Tình hình nghiên cứu gen FAT1

Hiện nay, có rất ít nghiên cứu về đột biến gen FAT1 ở những người bị phơi nhiễm dioxin. Một nghiên cứu gần đây đã xác định được đột biến gen này ở một cá thể duy nhất, tuy nhiên, cần có thêm dữ liệu từ nhiều cá nhân khác để khẳng định mối liên hệ giữa dioxin và gen FAT1. Nghiên cứu này sẽ góp phần làm rõ hơn về tình trạng sức khỏe con người và các yếu tố nguy cơ liên quan đến phơi nhiễm dioxin.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu đột biến gen FAT1 ở người có liên quan tới phơi nhiễm dioxin tại thành phố Sông Công, tỉnh Thái Nguyên" do sinh viên Trần Thị Thu Trang thực hiện thuộc ngành Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên (2021). Đề tài xuất phát từ các cơ sở thực tiễn và khoa học sau:

Dioxin là nhóm hợp chất hóa học clo hữu cơ độc hại, khó phân hủy và tích lũy sinh học bền vững trong cơ thể người cũng như môi trường (gồm PCDDs, PCDFs và DL-PCBs, trong đó đồng phân 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin - TCDD có độc tính cao nhất). Trong cuộc chiến tranh tại miền Nam Việt Nam (giai đoạn 1961–1971), quân đội Hoa Kỳ đã rải khoảng 77–80 triệu lít chất diệt cỏ (chủ yếu là chất da cam gồm 2,4-D và 2,4,5-T nhiễm tạp TCDD) xuống khoảng 1/5 diện tích đất, ảnh hưởng trực tiếp đến 3.181 ấp và khoảng 3 đến 7 triệu người. Dioxin tích lũy trong mô mỡ người với thời gian bán hủy từ 11 đến 20 năm (thậm chí lên đến 30 năm), gây tổn thương vật chất di truyền, phá hủy hệ miễn dịch, gây rối loạn nội tiết, dị tật bẩm sinh, ung thư và các rối loạn phát triển thần kinh qua nhiều thế hệ.

Trước đó, một công trình của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự đã công bố phát hiện đột biến thay thế dị hợp tử Q2933P (Gln2933Pro) trên exon 10 của gen FAT1 (thay thế nucleotide A bằng C ở vị trí 8798 trên cDNA) ở một bệnh nhân thiểu năng trí tuệ (Intellectual Disability - ID) được di truyền từ người cha có nồng độ dioxin trong máu cao. Tuy nhiên, dữ liệu này mới chỉ ghi nhận trên một cá thể đơn lẻ. Vì vậy, việc thực hiện nghiên cứu này là cần thiết nhằm mở rộng tập mẫu khảo sát trên các gia đình cựu chiến binh phơi nhiễm dioxin qua 3 thế hệ để xác định sự xuất hiện và tính di truyền của biến thể gen FAT1.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu được văn bản xác định cụ thể:

1. Mục tiêu ban đầu: Xác định biến thể tại exon 10 của gen FAT1 (nucleotide A thay thế bằng C ở vị trí 8798 trong cDNA), dẫn đến biến đổi acid amin trên protein FAT1 ở bệnh nhân thiểu năng trí tuệ có liên quan tới phơi nhiễm dioxin.
2. Mục tiêu mở rộng (do điều kiện thu mẫu thực tế): Khảo sát tính chất gây đột biến DNA trên người bị phơi nhiễm dioxin và đánh giá sự di truyền của các biến đổi vật chất di truyền qua 3 thế hệ gia đình cựu chiến binh.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu máu toàn phần thu thập từ 8 gia đình cựu chiến binh phơi nhiễm dioxin tại chiến trường (được các cấp có thẩm quyền xác nhận theo quy định). Mỗi gia đình gồm 3 thế hệ: cựu chiến binh (thế hệ thứ nhất - F1), con của cựu chiến binh (thế hệ thứ hai - F2), và cháu có biểu hiện dị tật, dị dạng hoặc bất thường phát triển (thế hệ thứ ba - F3), tổng cộng 24 mẫu máu.
• Phạm vi không gian: Thu thập mẫu tại các phường Châu Sơn, Bình Sơn, Bá Xuyên và xã Bách Quang, thành phố Sông Công, tỉnh Thái Nguyên (được sự cho phép của Ủy ban nhân dân tỉnh Thái Nguyên, có sự hỗ trợ của Hội nạn nhân chất độc da cam tỉnh Thái Nguyên và chi nhánh thành phố Sông Công).
• Địa điểm và thời gian thực nghiệm: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên, từ tháng 12/2020 đến tháng 7/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận sử dụng các nền tảng lý thuyết sinh học phân tử, độc học di truyền và các kỹ thuật thực nghiệm chuẩn hóa:

Khung lý thuyết và khái niệm chuyên ngành:

• Độc tính của dioxin và thụ thể AhR: Dioxin (TCDD) xâm nhập tế bào qua màng lipid, liên kết đặc hiệu với thụ thể nội bào Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) có cấu trúc bHLH/PAS. Phức hợp TCDD-AhR giải phóng các protein chaperone (HSP90, AIP/XAP2, p23), chuyển vị vào nhân và dị hóa (dimer hóa) với ARNT (AhR Nuclear Translocator). Phức hợp AhR/ARNT liên kết vào trình tự DRE (Dioxin Response Element) trên DNA để kích hoạt phiên mã các gen đích. Ngoài ra, dioxin gây độc gián tiếp thông qua cơ chế cảm ứng enzym CYP1A1, làm tăng stress oxy hóa (gốc tự do ROS), phá hủy lipid màng tế bào và gây sai hỏng, đứt gãy DNA.
• Đặc điểm gen và protein FAT1: Gen FAT1 ở người định vị tại nhiễm sắc thể 4q34–q35, gồm 27 exon với kích thước khoảng 15 kb, mã hóa protein cadherin xuyên màng loại I gồm 34 đoạn lặp cadherin, 5 vùng giống EGF và miền laminin-G. Protein FAT1 tham gia cấu trúc tiếp xúc liên kết tế bào, định cực tế bào phẳng (PCP) và điều hòa các con đường tín hiệu nội bào quan trọng: Wnt/β-catenin, Hippo và MAPK/ERK. Trong hệ thần kinh, FAT1 đóng vai trò điều hòa sự di chuyển và biệt hóa tế bào tiền thân thần kinh; các bất thường trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 4 và biến thể gen FAT1 có liên quan trực tiếp đến chứng tự kỷ, rối loạn lưỡng cực và thiểu năng trí tuệ (IQ < 70).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Phương pháp thu thập và xử lý sinh phẩm: Máu tĩnh mạch được lấy trực tiếp bởi cán bộ y tế tại gia đình các đối tượng nghiên cứu, chứa trong ống chống đông EDTA, lắc đều và bảo quản ở 4°C trước khi tách chiết.
• Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Tách chiết DNA từ 200 µL máu toàn phần bằng bộ kit Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit (FavorPrep, FavorGen) dựa trên nguyên lý màng cột silica. Sử dụng Proteinase K phân giải protein và RNase A loại bỏ RNA; rửa giải và thu nhận DNA trong dung dịch Elution Buffer, bảo quản ở -20°C.
• Phương pháp điện di kiểm tra DNA và sản phẩm PCR: Điện di trên gel agarose 0,8% pha trong đệm TAE 1X, sử dụng thuốc nhuộm Midori Green Direct, chạy ở điện thế 110V trong 30 phút, soi bản gel và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại trên máy soi gel UV transilluminator, so sánh kích thước với thang chuẩn DNA ladder (Gene Ladder của FastGene / Thermo Scientific 1kb).
• Phương pháp PCR khuếch đại exon 10 gen FAT1: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu FAT1-F và FAT1-R được kế thừa từ nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự, do hãng Phusa Biochem tổng hợp. Tác giả tiến hành tối ưu hóa nồng độ khuôn DNA (nguyên bản hoặc pha loãng 10 lần), thời gian kéo dài chuỗi (45 giây) và dải nhiệt độ gắn mồi qua thực nghiệm.

Tên mồi	Trình tự nucleotide (5' - 3')	Nhiệt độ nóng chảy (Tm)	Kích thước sản phẩm khuếch đại
FAT1-F	5'-CGTGCCTATTGGAACAGAGATAG-3'	55,3°C	696 bp
FAT1-R	5'-GAATCAGCATCCGTGGTACTT-3'	52,4°C	696 bp

• Phương pháp giải trình tự Sanger và phân tích tin sinh học in silico: Sản phẩm khuếch đại PCR đặc hiệu được giải trình tự theo phương pháp Sanger kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide (ddNTPs) gắn huỳnh quang. Tín hiệu sắc ký đồ giải trình tự được kiểm tra chất lượng bằng phần mềm Sequence Scanner v1.0. Trình tự nucleotide thu được được đối chiếu và gióng hàng với các trình tự tham chiếu chuẩn của gen FAT1 trên ngân hàng gen quốc tế NCBI bằng công cụ BLAST.

Nội dung chính theo từng chương

Khóa luận được kết cấu thành 5 phần chính, thể hiện tuần tự từ bối cảnh đến kết quả thực nghiệm chuyên sâu:

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tổng quan về hiểm họa dioxin trong chiến tranh tại Việt Nam, đặc tính tích lũy lâu dài của TCDD trong mô mỡ người và môi trường. Tác giả chỉ ra lỗ hổng nghiên cứu: các công trình đánh giá tác động của dioxin lên hệ gen người tại Việt Nam còn rất ít do trở ngại thời gian và tính nhạy cảm khi thu thập mẫu người; dữ liệu về đột biến gen FAT1 liên quan đến phơi nhiễm dioxin mới dừng lại ở một ca bệnh đơn lẻ. Phần này xác định rõ mục tiêu khoa học, đối tượng 8 gia đình 3 thế hệ, ý nghĩa khoa học trong việc bổ sung cơ sở dữ liệu di truyền học và ý nghĩa thực tiễn hỗ trợ đánh giá chính sách cho nạn nhân chất độc da cam.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học liên quan:

• Lịch sử phun rải chất diệt cỏ (chiến dịch Ranch Hand, Pacer Ivy), độc tính của đồng phân TCDD và hệ số đương lượng độc tính (TEF).
• Tác hại của dioxin: phân loại ung thư nhóm I theo IARC, cơ chế suy giảm tế bào lympho B, T CD4, tăng T CD8; rối loạn hormon tuyến giáp (tăng TSH, giảm T4 tự do), tiểu đường type 2; cơ chế phân tử qua thụ thể AhR/ARNT tương tác trình tự DRE và cơ chế stress oxy hóa độc lập với AhR.
• Khái niệm, tiêu chuẩn chẩn đoán thiểu năng trí tuệ (IQ < 70, khởi phát trước 18 tuổi) và vai trò của 818 gen liên quan ID (dự án Human Phenotype Ontology).
• Cấu trúc, đặc tính sinh học của họ cadherin FAT (FAT1 đến FAT4) và phân tích sâu cấu trúc gen FAT1 (4q34-35, 27 exon), sự tương tác của nó với các trục tín hiệu Wnt/β-catenin, Hippo và MAPK/ERK; mô hình cấu trúc không gian 3D của đột biến Gln2933Pro làm phát sinh liên kết hydro mới với acid amin Asp2931.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết 24 mẫu máu thu thập từ 8 gia đình cựu chiến binh qua 3 thế hệ tại thành phố Sông Công. Liệt kê danh mục hóa chất (Proteinase K, RNase A, Dream Taq DNA Polymerase 10X, dNTP Mix 10 mM, đệm TAE 1X, Midori Green Direct) và hệ thống máy móc (máy PCR Thermocycler, máy ly tâm lạnh Mikro 220R Hettich, bộ điện di Scie-Plas, máy đo quang phổ Thermo Scientific). Trình bày chi tiết quy trình 14 bước tách chiết DNA bằng kit màng silica, quy trình điện di gel 0,8%, thực nghiệm tối ưu hóa phản ứng PCR (nhiệt độ gắn mồi tối ưu ở 55°C trong 45 giây, 35 chu kỳ) và các bước xử lý dữ liệu giải trình tự Sanger trên phần mềm Sequence Scanner v1.0 và BLAST NCBI.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu

Ghi nhận toàn bộ số liệu và hình ảnh thực nghiệm thu được:

• Thu thập và phân loại kiểu hình dị tật ở thế hệ F3 của 8 gia đình cựu chiến binh.
• Kết quả tách chiết DNA: điện di kiểm tra 24 mẫu máu toàn phần trên gel agarose 0,8% cho thấy các vạch DNA tổng số có kích thước phân tử lớn, băng sáng rõ, ít bị đứt gãy, đạt độ tinh sạch và nồng độ yêu cầu cho phản ứng PCR.
• Kết quả khuếch đại PCR: tối ưu hóa thành công chu trình nhiệt, sản phẩm khuếch đại xuất hiện đơn băng, sắc nét, đúng kích thước lý thuyết 696 bp tương ứng đoạn exon 10 của gen FAT1.
• Kết quả giải trình tự và phân tích di truyền: phân tích sắc ký đồ giải trình tự Sanger của các mẫu đại diện, kết quả gióng hàng BLAST với 5 trình tự gen FAT1 chuẩn trên GenBank, phân tích đối chiếu đột biến trên cả sợi xuôi (F) và sợi ngược (R) của các cá thể thuộc gia đình A và gia đình D.

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra các kết luận thực nghiệm về việc thu thập mẫu, chất lượng DNA tách chiết, khả năng khuếch đại ổn định đoạn exon 10 gen FAT1, kết quả giải trình tự nucleotide và nêu các đề xuất cụ thể để tiếp tục hoàn thiện nghiên cứu.

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm chính kèm số liệu thực tế:

• Thu thập thành công sinh phẩm máu ngoại vi của 24 cá thể thuộc 8 gia đình cựu chiến binh phơi nhiễm dioxin qua 3 thế hệ tại thành phố Sông Công, tỉnh Thái Nguyên. Toàn bộ thông tin kiểu hình dị dạng, dị tật của thế hệ thứ ba (F3) được ghi nhận chi tiết:

Gia đình	Thế hệ F1 (Cựu chiến binh)	Thế hệ F2 (Con)	Thế hệ F3 (Cháu)	Năm sinh F3	Tình trạng biểu hiện dị tật ở thế hệ F3
Gia đình A	A3	A2	A1	10/05/2002	Không có bàn tay trái
Gia đình B	B3	B2	B1	-	Lép, không có ngực
Gia đình C	C3	C2	C1	26/12/2007	Dị tật thừa ngón (6 ngón)
Gia đình D	D3	D2	D1	12/10/2008	Bại liệt, không phát triển (thiểu năng trí tuệ)
Gia đình E	E3	E2	E1	24/07/1997	Điếc bẩm sinh
Gia đình G	G3	G2	G1	09/06/2010	Nhiễm khuẩn máu
Gia đình H	E2 (theo mã bảng)	H2	H1	22/11/2011	Dị tật bẩm sinh
Gia đình M	M3	M2	M1	23/01/2007	Cận thị nặng, ngứa toàn thân

• Đánh giá chất lượng DNA tách chiết: 24/24 mẫu máu toàn phần sau khi tách chiết bằng kit Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit đều cho vạch DNA tổng số nguyên vẹn trên gel agarose 0,8%, băng DNA đồng đều, không bị thoái hóa hay phân mảnh nghiêm trọng, đáp ứng tiêu chuẩn làm khuôn cho phản ứng nhân gen.
• Tối ưu hóa điều kiện PCR: Xác lập chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR nhân đoạn exon 10 kích thước 696 bp của gen FAT1: biến tính ban đầu 95°C trong 3 phút; 35 chu kỳ gồm biến tính 95°C trong 30 giây, gắn mồi ở 55°C trong 45 giây, kéo dài ở 72°C trong 45 giây; kéo dài cuối cùng 72°C trong 5 phút. Bản điện di sản phẩm PCR cho thấy băng DNA đặc hiệu, sáng rõ tại vị trí ~700 bp, không có vạch phụ hoặc hiện tượng dimer mồi.
• Dữ liệu giải trình tự Sanger: Đọc và phân tích thành công tín hiệu sắc ký đồ giải trình tự đoạn gen exon 10 từ các mẫu đại diện (đặc biệt là gia đình A và gia đình D), so sánh tương đồng trên BLAST với các bản ghi chuẩn trên GenBank, xác định đặc điểm nucleotide trên cả sợi F và sợi R của bệnh nhân và các thành viên liên quan.

Đóng góp khoa học và giải pháp do tác giả nêu:

• Khóa luận đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình thực nghiệm hoàn chỉnh từ khâu thu thập máu ngoại vi, bảo quản, tách chiết DNA nồng độ cao, đến kỹ thuật PCR khuếch đại đặc hiệu exon 10 của gen FAT1 ở người.
• Đóng góp thêm bộ dữ liệu thực nghiệm về các biến dị hình thái và chỉ số di truyền phân tử trên 8 gia đình có nạn nhân chất độc da cam qua 3 thế hệ tại khu vực Thái Nguyên, mở rộng cơ sở dữ liệu vốn rất hạn chế về hệ gen của các đối tượng phơi nhiễm dioxin tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu (được tác giả chỉ rõ trong văn bản):

• Dung lượng mẫu còn nhỏ (8 gia đình với 24 cá thể) do việc tiếp cận các đối tượng cựu chiến binh gặp nhiều khó khăn, các cựu chiến binh thế hệ đầu tiên hầu hết tuổi đã cao hoặc đã qua đời.
• Cơ cấu bệnh lý ở thế hệ F3 phân tán: Trong số 8 gia đình tình nguyện tham gia, chỉ có duy nhất một gia đình (gia đình D) có cháu (D1) mắc chứng thiểu năng trí tuệ kèm bại liệt; 7 gia đình còn lại mang các dạng dị tật hình thái hoặc bệnh lý khác (cụt bàn tay, 6 ngón, lép ngực, điếc, nhiễm khuẩn máu). Do đó, việc xác minh mối liên hệ trực tiếp giữa biến thể exon 10 gen FAT1 với chứng thiểu năng trí tuệ chưa đạt được cỡ mẫu như kỳ vọng ban đầu.
• Thiếu mẫu đối chứng âm tính: Nghiên cứu chưa thu thập được mẫu máu đối chứng từ người bà (vợ của cựu chiến binh) và người mẹ (không có tiền sử phơi nhiễm dioxin) trong cùng gia đình do các nguyên nhân khách quan trong tiếp cận thực địa, dẫn đến hạn chế nhất định trong việc phân tích nguồn gốc di truyền ngoại lai của các biến thể.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tiếp tục mở rộng quy mô thu thập mẫu máu trên các gia đình cựu chiến binh và nạn nhân chất độc da cam tại các địa phương khác, chú trọng thu thập đầy đủ mẫu đối chứng của các thành viên nữ (bà, mẹ) trong gia đình.
• Mở rộng phạm vi phân tích phân tử sang các exon khác của gen FAT1 hoặc áp dụng phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (Whole Exome Sequencing - WES) để phát hiện toàn diện các đột biến mới trên toàn bộ hệ gen liên quan đến tác động lâu dài của dioxin.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị thực tiễn và học thuật cho các nhóm đối tượng sau:

• Sinh viên, học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học, Y sinh học: Khóa luận là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật sinh học phân tử trên mẫu máu người, từ cách thức bảo quản mẫu bằng ống EDTA, kỹ thuật tách chiết DNA bằng cột silica, đến các bước tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi ($T_a$) và thời gian kéo dài cho phản ứng PCR khuếch đại gen người kích thước lớn.
• Các nhà nghiên cứu về hậu quả chất độc hóa học/dioxin: Cung cấp tài liệu tổng quan có hệ thống về cơ chế tác động của dioxin qua thụ thể AhR và các thụ thể độc lập, đồng thời cung cấp bảng dữ liệu thực địa về kiểu hình dị tật qua 3 thế hệ tại Thái Nguyên.
• Phần đáng tham khảo nhất: Quy trình thực nghiệm tối ưu hóa PCR tại mục 3.5.3 (cách tính toán thời gian kéo dài theo kích thước đoạn mồi, giải pháp xử lý mẫu DNA bị suy thoái do rã đông bằng cách hiệu chỉnh nồng độ khuôn) và quy trình phân tích in silico bằng Sequence Scanner kết hợp BLAST NCBI tại mục 3.5.5.

Câu hỏi thường gặp

Đột biến mục tiêu trên gen FAT1 mà đề tài tập trung hướng tới là gì?

Đề tài hướng tới việc xác minh biến thể nucleotide tại exon 10 của gen FAT1, cụ thể là đột biến thay thế base A bằng C ở vị trí 8798 trong cDNA. Đột biến này làm biến đổi bộ ba mã hóa, dẫn đến sự thay thế acid amin Glutamine bằng Proline tại vị trí 2933 (đột biến dị hợp tử Gln2933Pro hay Q2933P) trên chuỗi polypeptid của protein FAT1, làm xuất hiện liên kết hydro mới với acid amin Asp2931 trong mô hình cấu trúc không gian 3D.

Trình tự cặp mồi và điều kiện chu trình nhiệt PCR tối ưu được xác lập trong khóa luận là gì?

Tác giả sử dụng cặp mồi đặc hiệu: FAT1-F (5'-CGTGCCTATTGGAACAGAGATAG-3') và FAT1-R (5'-GAATCAGCATCCGTGGTACTT-3') để nhân đoạn gen kích thước 696 bp. Chu trình nhiệt tối ưu hóa gồm: biến tính ban đầu ở 95°C trong 3 phút; 35 chu kỳ lặp lại gồm biến tính 95°C (30 giây), gắn mồi ở 55°C (45 giây), kéo dài ở 72°C (45 giây); và kéo dài kết thúc ở 72°C trong 5 phút.

Trong 8 gia đình khảo sát, những dạng dị tật nào đã được ghi nhận ở thế hệ F3?

Thế hệ cháu (F3) của 8 gia đình cựu chiến binh ghi nhận các dạng dị tật đa dạng: A1 (không có bàn tay trái), B1 (lép, không phát triển ngực), C1 (dị tật thừa ngón - 6 ngón tay), D1 (bại liệt, không phát triển thể chất và thiểu năng trí tuệ), E1 (điếc bẩm sinh), G1 (nhiễm khuẩn máu), H1 (dị tật bẩm sinh) và M1 (cận thị nặng, ngứa toàn thân).

Tại sao tác giả phải mở rộng mục tiêu nghiên cứu trong quá trình thực hiện?

Ban đầu đề tài dự định tập trung phân tích đột biến gen FAT1 trên các bệnh nhân thiểu năng trí tuệ. Tuy nhiên, việc thu thập mẫu từ các gia đình nạn nhân chất độc da cam rất khó khăn; trong 8 gia đình tình nguyện tham gia chỉ có duy nhất 1 gia đình (mã D) có cháu D1 mắc chứng thiểu năng trí tuệ kèm bại liệt. Do đó, tác giả đã mở rộng thêm mục tiêu thứ hai là khảo sát tính chất gây biến đổi DNA tổng quát và sự di truyền qua 3 thế hệ ở các gia đình cựu chiến binh có cháu bị dị tật.

Hạn chế lớn nhất trong khâu thu thập mẫu đối chứng của khóa luận là gì?

Khóa luận chưa tiếp cận và thu thập được mẫu máu đối chứng âm tính từ người bà (vợ cựu chiến binh) và người mẹ (không phơi nhiễm dioxin) trong các gia đình nghiên cứu. Việc thiếu các mẫu đối chứng này gây khó khăn cho việc loại trừ hoàn toàn các yếu tố di truyền từ dòng mẹ khi phân tích sự di truyền của các biến dị trên hệ gen thế hệ con cháu.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Thị Thu Trang đã chuẩn hóa thành công quy trình tách chiết DNA chất lượng cao từ 24 mẫu máu toàn phần của 8 gia đình cựu chiến binh phơi nhiễm dioxin 3 thế hệ tại thành phố Sông Công, tỉnh Thái Nguyên. Nghiên cứu đã tối ưu hóa phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu đoạn exon 10 gen FAT1 kích thước 696 bp ở nhiệt độ gắn mồi 55°C và phân tích trình tự Sanger đối chiếu với ngân hàng gen quốc tế NCBI. Kết quả cung cấp dẫn liệu thực nghiệm có giá trị về mặt di truyền học phân tử, tạo cơ sở phương pháp luận cho các nghiên cứu tiếp theo về mối liên hệ giữa phơi nhiễm dioxin và các rối loạn phát triển ở người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Dioxin là tên gọi chung của một nhóm các chất hoá học độc hại, tồn tại bền vững trong tự nhiên trong cơ thể người và các sinh vật khác. Nhóm hợp chất này được phân loại chia thành 3 họ có liên quan chặt chẽ với nhau bao gồm: polychlorinated dibenzo- p -dioxin (PCDDs), polychlorinated dibenzofurans (PCDFs) và polychlorinated bip henyls (DL-PCBs). Chúng là sản phẩm phụ không mong muốn của quá trình sản xuất các chất hữu cơ chứa clo [1]. Do tính chất bền vững, dioxin có khả năng chống lại sự phân hủy của môi trường.

Chúng lắng đọng trọng đất và xâm nhập vào chuỗi thức ăn của con người. Khi đi vào trong cơ thể, chúng được tích trữ trong các tế bào mỡ và được đào thải rất chậm [1]. Dioxin được cho là một trong các chất độc hại nhất được biết đến hiện nay và dường như không có một mức độ phơi nhiễm dioxin nào là an toàn. Nhờ các thụ thể trung gian dioxin tác động lên hệ gen, gây rối loạn phá huỷ hệ thống miễn dịch của cơ thể làm đột biến DNA từ đó gây nên các bệnh lý nguy hiểm và phức tạp trong đó có ung thư các bệnh về thần kinh, dị dạng dị tật bẩm sinh ở thế hệ tiếp theo của người bị phơi nhiễm.

Dioxin không chỉ gây tổn hại đến sức khỏe của người bị phơi nhiễm mà còn gây ảnh hưởng tới nghiêm trọng đến con cái của họ ở những thế hệ kế tiếp [1]. Trong cuộc chiến tranh Miền Nam từ năm 1962 đến năm 1970, quân đội mỹ đã rải một lượng lớn chất diệt cỏ trong đó có tạp nhiễm dioxin xuống nhiều vùng tại Việt Nam. Dioxin sau khi được trộn lẫn với dầu hỏa hoặc dầu diesel nhằm làm tăng độ bám dính vào cây cỏ, chúng được đựng vào các thùng chứa và được phun xuống từ những giàn phun sương đặt trên máy bay với mục đích làm rụng lá cây, phá huỷ nơi ẩn nấp của lực lượng vũ trang Quân giải phóng miền Nam Việt Nam. Việt Nam là quốc gia gặp phải “thảm họa dioxin” nặng nề nhất trên thế giới.

Việc nghiên cứu đánh giá về ảnh hưởng của phơi nhiễm dioxin với sức khỏe con người là rất cần thiết. Tuy nhiên, do sự việc đã xảy ra từ những năm 60-70 của thế kỷ trước nên công tác thu thập mẫu nghiên cứu gặp trở ngại lớn. Hơn nữa việc nghiên Luan van 2 cứu trên người là rất nhạy cảm. Vì vậy, số lượng các nghiên cứu về dioxin trên người Việt Nam còn vô cùng hạn chế.

Một nghiên cứu hiếm hoi gần đây có tiêu đề “Xác định đột biến Q2933P trên gen FAT1 ở bệnh nhân bị thiểu năng trí tuệ trong một gia đình có nạn nhân chất độc dioxin ở Việt Nam”. Trong đó, các tác giả đã sử dụng phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện và xác định được biến dị di truyền liên quan đến bệnh thiểu năng trí tuệ trong gia đình có nạn nhân bị phơi nhiễm dioxin. Kết quả thu được một đột biến thay thế dạng dị hợp tử Gln2933Pro trên gen FAT1 của bệnh nhân được di truyền từ cha có nồng độ dioxin trong máu cao, cũng như thay đổi về cấu trúc protein này. Tuy nhiên, nghiên cứu nói trên mới chỉ thực hiện được ở trên một cá thể duy nhất.

Vì vậy, chúng tôi đề xuất ý tưởng này với mục tiêu nghiên cứu thêm một số gia đình cựu chiến binh nhiễm dioxin khác để bổ sung thêm dữ liệu về đột biến gen FAT1 liên quan tới người bị phơi nhiễm dioxin ở Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu Xác định biến thể tại exon 10 của gene FAT1 (A được thay thế bằng C ở vị trí 8798 trong cDNA), dẫn đến thay đổi trên protein FAT1.Ý nghĩa của đề tài 1.