Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đặc điểm hình thái mối quan hệ di truyền và hệ thống học các loài lưỡng cư thuộc giống rhacophorus amphibia rhacophoridae ở việt nam

Luận án tiến sĩ sinh học khám phá đặc điểm hình thái, mối quan hệ di truyền và hệ thống học các loài lưỡng cư thuộc giống Rhacophorus tại Việt Nam.

• Tác giả: Ninh Thị Hòa
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Xuân Cảnh
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
• Chuyên ngành: Động vật học
• Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, mối quan hệ di truyền và hệ thống học các loài Lưỡng cư thuộc giống Rhacophorus (Amphibia: Rhacophoridae) ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG II: ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Cách tiếp cận giải quyết vấn đề nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Khảo sát thực địa
• 2.5. Phân tích đặc điểm hình thái
• 2.6. Phương pháp phân tích sinh học phân tử
• 2.7. Phân tích thống kê
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Về phân loại giống Rhacophorus sensu lato
• 3.2. Giống Rhacophorus Kuhl & Van Hasselt, 1822
• 3.3. Đa dạng thành loài giống Rhacophorus ở Việt Nam
• 3.4. Mô tả đặc điểm hình thái các loài trong giống Rhacophorus ở Việt Nam
• 3.5. Quan hệ di truyền các loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam
• 3.6. Các vấn đề tu chỉnh phân loại học các loài Lưỡng cư giống Rhacophorus ở Việt Nam
• 3.7. Giống Zhangixalus Li, Jiang, Ren & Jiang, 2019 ở Việt Nam
• 3.8. Đa dạng thành phần loài giống Zhangixalus ở Việt Nam
• 3.9. Mô tả đặc điểm hình thái các loài trong giống Zhangixalus ở Việt Nam
• 3.10. Quan hệ di truyền các loài Lưỡng cư trong giống Zhangixalus
• 3.11. Các vấn đề tu chỉnh phân loại học các loài Lưỡng cư giống Zhangixalus ở Việt Nam
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Đặc điểm hình thái và di truyền các loài lưỡng cư Rhacophorus tại Việt Nam

Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm hình thái và di truyền của các loài thuộc giống Rhacophorus tại Việt Nam. Các loài này được phân tích dựa trên các chỉ số hình thái như kích thước cơ thể, màu sắc, và cấu trúc da. Đồng thời, nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài. Kết quả cho thấy sự đa dạng cao về hình thái và di truyền trong giống Rhacophorus, đặc biệt là các loài đặc hữu tại Việt Nam.

1.1. Đặc điểm hình thái

Các loài Rhacophorus tại Việt Nam thể hiện sự đa dạng về hình thái, từ kích thước cơ thể đến màu sắc và cấu trúc da. Các chỉ số hình thái được đo lường chính xác, bao gồm chiều dài cơ thể, chiều dài chi, và kích thước đầu. Một số loài như Rhacophorus kio và Rhacophorus hoabinhensis có đặc điểm hình thái độc đáo, giúp phân biệt chúng với các loài khác trong giống.

1.2. Đặc điểm di truyền

Nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài Rhacophorus. Kết quả cho thấy sự phân nhóm rõ ràng dựa trên trình tự gen, đặc biệt là các loài trong nhóm hoanglienensis – orlovi. Các dữ liệu di truyền cũng giúp xác nhận sự tồn tại của các loài mới và làm rõ mối quan hệ phát sinh loài trong giống.

II. Đa dạng thành phần loài và phân bố

Nghiên cứu đã ghi nhận 16 loài thuộc giống Rhacophorus sensu stricto và 9 loài thuộc giống Zhangixalus tại Việt Nam. Trong đó, 4 loài mới được mô tả và 7 loài có phân bố mở rộng. Các loài này phân bố chủ yếu ở các khu vực rừng núi phía Bắc và Tây Nguyên, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của lưỡng cư.

2.1. Đa dạng thành phần loài

Nghiên cứu đã xác định 25 loài thuộc giống Rhacophorus và Zhangixalus tại Việt Nam. Các loài này được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền, trong đó có 4 loài mới được mô tả lần đầu tiên. Điều này khẳng định sự đa dạng cao của lưỡng cư tại Việt Nam.

2.2. Phân bố địa lý

Các loài Rhacophorus phân bố chủ yếu ở các khu vực rừng núi phía Bắc và Tây Nguyên. Một số loài như Rhacophorus hoabinhensis và Zhangixalus franki có phân bố hẹp, chỉ được tìm thấy ở một số địa điểm cụ thể. Điều này cho thấy sự nhạy cảm của các loài này với sự thay đổi môi trường.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn đa dạng sinh học tại Việt Nam. Các kết quả cung cấp dữ liệu cơ bản về đặc điểm hình thái và di truyền của các loài Rhacophorus, hỗ trợ công tác quản lý và bảo tồn các loài lưỡng cư đặc hữu. Đồng thời, nghiên cứu cũng là tài liệu tham khảo quan trọng cho các nhà khoa học và sinh viên ngành Sinh học.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu khẳng định sự phân tách giống Rhacophorus sensu lato thành Rhacophorus sensu stricto và Zhangixalus. Đồng thời, cung cấp dữ liệu mới về đặc điểm hình thái và di truyền của các loài, góp phần làm phong phú thêm kiến thức về lưỡng cư tại Việt Nam.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học cho việc quy hoạch và quản lý bảo tồn đa dạng sinh học. Đặc biệt, các dữ liệu về đặc điểm hình thái và di truyền giúp xác định các loài cần được ưu tiên bảo vệ, đảm bảo sự phát triển bền vững của hệ sinh thái.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu hệ thống học và quan hệ di truyền quần thể của các loài lưỡng cư thuộc khu hệ sinh thái Đông Dương đóng vai trò then chốt trong việc giải mã bức tranh tiến hóa sinh học tại điểm nóng đa dạng sinh học toàn cầu Indo-Burma (IUCN 2016). Trong cấu trúc phân loại lớp Lưỡng cư (Amphibia), họ Ếch cây Rhacophoridae đại diện cho một trong những nhánh tiến hóa đa dạng và phức tạp nhất với hơn 443 loài thuộc 23 giống (Frost 2021). Tại Việt Nam, sự gia tăng nhanh chóng của các đơn vị phân loại mới—từ 82 loài năm 1996 (Nguyễn Văn Sáng & Hồ Thu Cúc) lên 297 loài vào năm 2021 với hơn 70 loài mới được mô tả từ năm 2010—đã đặt ra thách thức lớn đối với tính ổn định phân loại học, đặc biệt ở giống Rhacophorus sensu lato.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) trọng tâm tồn tại ở ba khía cạnh căn bản: (1) Tính bất định trong giới hạn phân loại học của giống Rhacophorus sensu lato, nơi nhiều loài trước đây được định danh và mô tả đơn thuần dựa trên một vài mẫu vật hình thái (như R. marmoridosum, R. viridimaculatus) dẫn đến hiện tượng nhầm lẫn đồng vật hoặc che khuất các loài ẩn (cryptic species); (2) Sự thiếu hụt trầm trọng các dữ liệu sinh học phân tử đại diện cho các quần thể tại Việt Nam trong các nghiên cứu phân loại khu vực Đông Á (tiêu biểu như nghiên cứu của Jiang et al. 2019 vốn chủ yếu dựa vào mẫu vật thu thập từ Trung Quốc); (3) Sự mâu thuẫn giữa phân loại hình thái truyền thống và cây phát sinh chủng loại phân tử đối với các phức hợp loài đồng hình như Rhacophorus rhodopus hay nhóm “hoanglienensis - orlovi”.

Luận án tiến sĩ sinh học của NCS Ninh Thị Hòa (2021) với tiêu đề "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, mối quan hệ di truyền và hệ thống học các loài Lưỡng cư thuộc giống Rhacophorus (Amphibia: Rhacophoridae) ở Việt Nam" giải quyết trực tiếp các vấn đề học thuật trên thông qua các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết cụ thể:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Cơ sở hình thái và di truyền phân tử có ủng hộ việc phân tách giống Rhacophorus sensu lato ở Việt Nam thành các giống độc lập hay không?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Mức độ sai khác di truyền và biến dị hình thái định lượng giữa các loài đồng hình và các phức hợp loài phức tạp (Rhacophorus orlovi, R. hoanglienensis, Zhangixalus feae, Z. pachyproctus) là bao nhiêu?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Mô hình phân bố địa lý sinh vật của giống Rhacophorus phản ánh thế nào qua các ranh giới tự nhiên tại Việt Nam?
• Giả thuyết 1 (H1): Giống Rhacophorus sensu lato ở Việt Nam cấu thành từ hai dòng tiến hóa phân kỳ rõ rệt tương ứng với hai giống Rhacophorus sensu stricto và Zhangixalus.
• Giả thuyết 2 (H2): Phân tích hình thái kết hợp chỉ thị phân tử ty thể sẽ phát hiện các loài mới cho khoa học và làm sáng tỏ các sai sót trong định loại lịch sử (ví dụ: tình trạng phân loại của R. viridimaculatus).
• Giả thuyết 3 (H3): Sự tương đồng và cách ly địa lý sinh vật của khu hệ ếch cây phụ thuộc chặt chẽ vào cấu trúc đứt gãy địa hình và phân vùng sinh thái (theo khung phân vùng Bain & Hurley 2011).

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên nguyên lý Phân loại học tích hợp (Integrative Taxonomy - Dayrat 2005; Padial et al. 2010) kết hợp Thuyết Địa sinh vật học lịch sử (Historical Biogeography). Quy mô nghiên cứu bao quát một tập dữ liệu đồ sộ gồm 1.021 mẫu vật hình thái học (938 mẫu trưởng thành, 66 mẫu chưa trưởng thành, 17 mẫu nòng nọc) và 173 mẫu giải trình tự DNA ty thể (170 mẫu thu thập tại Việt Nam, 3 mẫu R. spelaeus từ Lào) kết hợp 77 trình tự tham chiếu quốc tế từ GenBank. Kết quả của luận án mang tính đột phá khi tái lập hệ thống phân loại gồm 16 loài thuộc Rhacophorus sensu stricto và 9 loài thuộc Zhangixalus, trực tiếp phát hiện và mô tả 4 loài mới cho khoa học (Rhacophorus hoabinhensis, R. vanbanicus, Zhangixalus franki, Z. jodiae), mở rộng vùng phân bố cho 7 loài và tu chỉnh một trường hợp đồng vật danh pháp quan trọng.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu giống Rhacophorus trải qua hai giai đoạn chuyển dịch phương pháp luận rõ nét:

Giai đoạn phân loại hình thái truyền thống (từ đầu thế kỷ XX đến đầu thế kỷ XXI) được định hình bởi các công trình nền tảng của các tác giả quốc tế và trong nước như Smith (1924), Bourret (1942), Đào Văn Tiến (1977), Trần Kiên & cs. (1981), Nguyễn Văn Sáng & Hồ Thu Cúc (1996), Inger et al. (1999), Ohler et al. (2000), Orlov et al. (2001, 2008, 2012). Các nghiên cứu này đã thiết lập danh lục ban đầu và mô tả các đặc điểm hình thái kinh điển. Tuy nhiên, hạn chế lớn của phương pháp hình thái học đơn thuần là sự xuất hiện của các tranh chấp phân loại do biến dị cá thể, sự tương đồng hình thái cao giữa các loài có quan hệ họ hàng gần hoặc việc mô tả loài mới chỉ dựa trên một mẫu chuẩn đơn nhất (holotype) mà không đánh giá được phương sai quần thể.

Giai đoạn phát sinh chủng loại học phân tử (từ năm 2006 đến nay) bùng nổ với các công trình quy mô lớn của Frost et al. (2006), Pyron & Wiens (2011), Li et al. (2008, 2009, 2013), Pan et al. (2017) và Dubois et al. (2021). Đáng chú ý, các nghiên cứu quốc tế đã mở ra những cuộc tranh luận học thuật gay gắt về cấu trúc nội hàm của họ Rhacophoridae. Jiang et al. (2019), dựa trên phân tích 3 đoạn gen ty thể (12S rRNA, tRNA-Val, 16S rRNA), đã đề xuất chia tách Rhacophorus sensu lato thành 4 giống: Rhacophorus sensu stricto, Leptomantis, Vampyrius và Zhangixalus. Ngược lại, Dubois et al. (2021) lại đưa ra quan điểm tách chi tiết hơn đối với giống đơn loài Vampyrius (V. vampyrus).

Tranh luận học thuật quốc tế tập trung vào hai luồng quan điểm đối lập: (1) Nhóm ủng hộ chia tách hoàn toàn các giống dựa trên khoảng cách di truyền ty thể đơn thuần mà chưa kiểm chứng đầy đủ các biến dị hình thái tương ứng trên phạm vi toàn vùng phân bố; (2) Nhóm thận trọng cho rằng việc phân chia giống cần bằng chứng tích hợp cả về giải phẫu hình thái, sinh thái học và dữ liệu gen nhân để tránh hiện tượng lạm phát đơn vị phân loại (taxonomic inflation).

Luận án của Ninh Thị Hòa định vị chính xác vào trung tâm của cuộc tranh luận này bằng cách so sánh đối chứng với hai nghiên cứu quốc tế tiêu biểu:

1. So sánh với Jiang et al. (2019): Nghiên cứu của Jiang et al. dù đưa ra khung phân loại phân tử cho khu hệ Trung Quốc nhưng thiếu hụt trầm trọng các mẫu vật đặc hữu vùng rừng nhiệt đới Việt Nam. Luận án đã bù đắp khoảng trống này, chứng minh tính hợp thức của hai giống Rhacophorus sensu stricto và Zhangixalus ở Việt Nam dựa trên sự đồng thuận tuyệt đối giữa khoảng cách di truyền (phân kỳ 8,56% - 17,35%) và tập hợp các đặc điểm chẩn loại hình thái ngoại vi (riềm da cánh tay, cựa gót chân, nếp da huyệt).
2. So sánh với Yu et al. (2019): Khi nghiên cứu phức hợp Zhangixalus smaragdinus phân bố từ Myanmar, Trung Quốc, Thái Lan đến Việt Nam, Yu et al. chỉ ra khoảng cách di truyền 6% giữa các nhóm quần thể. Kế thừa và mở rộng phát hiện này, luận án đã kiểm chứng hình thái và định danh chính thức các quần thể tại miền Bắc Việt Nam thành loài mới Zhangixalus franki, đồng thời xác lập vị trí phân loại độc lập cho loài Zhangixalus jodiae.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đóng góp trực tiếp vào việc mở rộng và kiểm chứng Thuyết Khái niệm Loài Tiến hóa Hợp nhất (Unified Species Concept - de Queiroz 2007) và Thuyết Phân loại học Tích hợp (Integrative Taxonomy - Padial et al. 2010). Nghiên cứu thách thức quan điểm Phân loại học Hình thái Thuần túy (Phenetics / Typological Species Concept) vốn thống trị các nghiên cứu lưỡng cư truyền thống tại Đông Dương.

Luận án đề xuất mô hình lý thuyết tiến hóa gồm 3 mệnh đề (Propositions) có kiểm chứng:

• Mệnh đề 1 (P1): Sự phân kỳ tiến hóa giữa Rhacophorus sensu stricto và Zhangixalus là kết quả của sự phân hóa sinh thái - hình thái cổ xưa, được củng cố bởi sự cách ly di truyền sâu sắc (>8,5% trên gen ty thể 16S-12S).
• Mệnh đề 2 (P2): Các đặc điểm hình thái biến dị liên tục (kích thước SVL, chỉ số đầu HW/HL) dễ dẫn đến sai lầm định loại nếu không được chuẩn hóa bằng phân tích đa biến PCA kết hợp kiểm tra cấu trúc giải phẫu sinh sản.
• Mệnh đề 3 (P3): Tính tương đồng di truyền cao (sai khác 0,00% - 0,33%) giữa các quần thể có màu sắc khác biệt là bằng chứng của hiện tượng đa hình kiểu hình (polymorphism) nội loài chứ không phản ánh sự hình thành loài mới.

Sự chuyển dịch hệ hình (paradigm shift) được minh chứng rõ nhất qua việc xử lý tình trạng phân loại của Rhacophorus viridimaculatus. Bằng chứng phân tích di truyền khẳng định loài này đồng nhất tuyệt đối với Rhacophorus orlovi (sai khác di truyền chỉ từ 0,00% đến 0,33%). Kết hợp tái thẩm định mẫu chuẩn ZISP 11471 và đồng chuẩn ZISP 11474, nghiên cứu chứng minh tác giả mô tả trước đây (Ostroshabov et al. 2013) đã nhầm lẫn cá thể cái mang trứng thành cá thể đực, dẫn đến việc thiết lập một đơn vị phân loại giả định. Luận án đã chính thức xác lập R. viridimaculatus là tên đồng vật thứ sinh (junior synonym) của R. orlovi.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa tầng 3 trụ cột phương pháp luận:

1. Trụ cột Hình thái lượng tử (Morphometrics): Chuẩn hóa 34 chỉ số đo kích thước hình thái học cá thể trưởng thành, ứng dụng mô hình phân tích thành phần chính (PCA) để tách biệt các cụm không gian hình thái đối với các loài có hình thái chồng lấn cao.
2. Trụ cột Di truyền phân tử (Molecular Phylogenetics): Khuếch đại và phân tích đồng thời 3 vùng gen ty thể có tốc độ tiến hóa tối ưu (12S rRNA, tRNA-Val, 16S rRNA) với chiều dài đầy đủ, áp dụng các mô hình tiến hóa phân tử dựa trên Tiêu chuẩn Thông tin Akaike (AIC).
3. Trụ cột Địa lý sinh vật học (Biogeographical Modeling): Mã hóa ma trận phân bố 0/1 trên 8 phân vùng địa sinh vật Indochina (theo Bain & Hurley 2011), tính toán khoảng cách sinh thái học bằng chỉ số tương đồng Sorensen-Dice.

Điều kiện biên (Boundary conditions): Khung phân tích được tối ưu hóa cho lớp Lưỡng cư không đuôi (Anura) khu vực nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á, trong đó dữ liệu ty thể phản ánh dòng tiến hóa theo dòng mẹ, đòi hỏi sự đối soát nghiêm ngặt với các rào cản địa lý và hình thái học ngoại vi.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận hành theo hệ hình Hiện thực Phê phán (Critical Realism) và Thực chứng Hiện đại (Positivism). Thiết kế nghiên cứu tích hợp đa phương pháp (Mixed-methods) kết hợp định lượng di truyền học phân tử với trắc lượng hình thái học đa biến. Thiết kế đa cấp độ (Multi-level design) được triển khai qua 3 tầng: Cấp độ Quần thể (đánh giá biến thiên di truyền nội loài của R. orlovi, Z. feae, Z. pachyproctus), Cấp độ Loài (định danh, mô tả loài mới, phân định loài đồng hình), và Cấp độ Giống (tái cấu trúc cây phát sinh chủng loại của Rhacophorus sensu lato).

Quy mô mẫu vật nghiên cứu:

• Tập mẫu hình thái: $N = 1.021$ mẫu vật gồm 938 mẫu trưởng thành, 66 mẫu bán trưởng thành và 17 mẫu nòng nọc. Mẫu vật được lưu trữ và thẩm định tại 5 bảo tàng và viện nghiên cứu uy tín: Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (VNMN - 649 mẫu), Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (IEBR - 301 mẫu), Trường Đại học Sư phạm Hà Nội (HNUE - 48 mẫu), Viện Động vật Xanh-pê-téc-bua, Nga (ZISP - 20 mẫu) và Vườn thú Cologne, Đức (3 mẫu).
• Tập mẫu di truyền: $N = 173$ mẫu mô cơ/gan tươi được giải trình tự mới trực tiếp (170 mẫu Việt Nam, 3 mẫu R. spelaeus từ Lào), kết hợp 77 trình tự tham chiếu GenBank.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình khảo sát thực địa được thực hiện trong 62 ngày thực địa tập trung từ năm 2016 đến 2019 qua 5 đợt điều tra trọng điểm: (1) Lai Châu (5-6/2016, 12 ngày); (2) VQG Phước Bình, Ninh Thuận (4/2018, 7 ngày); (3) Na Hang, Tuyên Quang (6/2018, 13 ngày); (4) Hương Khê, Hà Tĩnh (10/2019, 15 ngày); (5) Lệ Thủy, Quảng Bình (10-11/2019, 15 ngày), cùng các đợt khảo sát bổ sung tại Hà Giang, Sơn La, Thanh Hóa, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk.

Quy trình thu thập và xử lý mẫu tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn quốc tế:

• Thu mẫu thực địa: Tiến hành ban đêm (18:00 - 24:00) dọc các sinh cảnh suối, vách đá, vũng nước rừng tự nhiên; định vị tọa độ chính xác bằng GPS Garmin Map 62CXs.
• Cố định và bảo quản mẫu: Gây mê mẫu bằng bông thấm ethyl acetate. Mẫu mô gan/cơ phục vụ tách chiết DNA được bảo quản riêng trong cồn 95%. Mẫu vật tiêu bản hình thái được định hình, ngâm cố định trong cồn 80-90% trong 8-10 giờ (có tiêm cồn 80% vào khoang bụng đối với mẫu lớn để chống hoại tử nội tạng), sau đó chuyển bảo quản vĩnh viễn trong cồn 70% ở nhiệt độ mát theo giao thức Simmons (2002).
• Đo đạc hình thái: Sử dụng thước kẹp điện tử tử kỹ thuật số (độ chính xác 0,01 mm) để đo 34 chỉ tiêu hình thái tiêu chuẩn (Bảng 2.2 trong luận án): SVL, HW, HL, MN, MFE, MBE, SNL, ED, UEW, IN, IOD, DAE, DPE, EN, TYD, TYE, FLL, HAL, IPT, FI-FIV, FeL, TbL, TbW, FoL, TI-TV, IMT. Công thức màng bơi được xác định theo Glaw & Vences (2007). Định loại nòng nọc dựa theo Gosner (1960) và Altig (2007).

Data và phân tích

Quy trình phân tích sinh học phân tử:

• Tách chiết DNA: Sử dụng bộ kit DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, CHLB Đức) theo quy trình Kuraishi et al. (2013) hiệu chỉnh bởi Nguyen et al. (2015).
• Phản ứng PCR: Thực hiện khuếch đại 3 đoạn gen ty thể 12S rRNA, tRNA-Val và 16S rRNA bằng 7 đoạn mồi chuyên biệt (H3056, L2606 - Hedges 1994; Will 6 - Wilkinson et al. 2002; Tval L; L1091 - Cannatella et al. 1998; Hnew, L2204 - Matsui et al. 2005). Thể tích phản ứng chuẩn $20,\mu\text{l}$ gồm: $10,\mu\text{l}$ Taq PCR Master Mix 2x, $0,5,\mu\text{l}$ mồi xuôi ($20,\text{pmol}$), $0,5,\mu\text{l}$ mồi ngược ($20,\text{pmol}$), $2,\mu\text{l}$ DNA khuôn ($10,\text{ng}$) và $7,\mu\text{l}$ nước cất khử ion.
• Điện di và giải trình tự: Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, tinh sạch qua bộ kit GeneJET PCR Purification Kit và gửi giải trình tự Sanger hai chiều tại Macrogen Inc. (Seoul, Hàn Quốc).
• Xử lý dữ liệu và xây dựng cây phát sinh loài: Trình tự DNA được kiểm tra chromatogram và cắt bỏ primer bằng Chromas Pro v2.1, căn chỉnh đa trình tự bằng BioEdit v7.0.5. Lựa chọn mô hình tiến hóa tối ưu theo tiêu chuẩn AIC bằng phần mềm Kakusan 4 và Treefinder. Cây quan hệ di truyền được xây dựng đồng thời bằng hai thuật toán: Hợp lý cực đại (Maximum Likelihood - ML) và Suy luận Bayes (Bayesian Inference - BI) bằng phần mềm MrBayes v3.2. Ngưỡng tin cậy thống kê cho các nhánh phân kỳ được thiết lập ở mức xác suất hậu nghiệm (Bayesian Posterior Probabilities - BPP) $\ge 0,95$ và giá trị Bootstrap (BS) $\ge 75%$.
• Phân tích hình thái đa biến và địa lý sinh vật: Sử dụng phần mềm PAST (Hammer et al. 2001) để chạy phân tích thành phần chính (Principal Component Analysis - PCA) cho các tập mẫu có số lượng $N > 30$. Tính toán ma trận chỉ số tương đồng sinh thái học Sorensen-Dice: $$d_{jk} = \frac{2M}{2M + N}$$ trong đó $M$ là số loài chung giữa hai phân vùng, $N$ là tổng số loài chỉ xuất hiện ở một phân vùng độc bản.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Xác lập vững chắc sự phân tách hai giống Rhacophorus sensu stricto và Zhangixalus: Phân tích di truyền phân tử trên cây phát sinh chủng loại BI và ML đạt độ tin cậy tuyệt đối tại các gốc nhánh chính ($\text{BPP} = 1,00$; $\text{BS} = 99%$). Khoảng cách di truyền giữa nhóm A (Zhangixalus) và nhóm B (Rhacophorus sensu stricto) dao động sâu sắc từ 8,56% (giữa R. feae và R. vanbanicus) đến 17,35% (giữa R. helenae và Z. duboisi). Kết quả này đi kèm với tổ hợp đặc điểm hình thái chẩn loại cố định: nhóm Zhangixalus hoàn toàn không có riềm da cẳng tay/ngón tay IV, gót chân không cựa nhọn, vùng huyệt nhẵn; ngược lại nhóm Rhacophorus luôn có riềm da phát triển, gót chân có cựa da hoặc nếp da chữ nhật, vùng huyệt có gai thịt/nốt sần.

2. Phát hiện và mô tả 4 loài mới cho khoa học:

   • Rhacophorus hoabinhensis (Ếch cây hòa bình): Phát hiện tại KBTTN Hang Kia - Pà Cò, Hòa Bình. Kích thước nhỏ (SVL $31,1 - 32,5,\text{mm}$ ở con đực), không có răng lá mía, công thức màng bơi tay $\text{I}1\frac{2}{3}-1\frac{2}{3}\text{II}1-2\text{III}1-1\text{IV}$, sai khác di truyền từ 3,02% (so với Rhacophorus sp1.) đến 17,96% (so với R. helenae).
   • Rhacophorus vanbanicus (Ếch cây văn bàn): Phát hiện tại Văn Bàn (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang) và Na Hang (Tuyên Quang). Đặc trưng bởi tỷ lệ chiều rộng đầu/chiều dài đầu $\text{HW}/\text{HL} = 0,84 - 0,89$, mặt dưới đùi phủ nhiều nốt sần dọc, khoảng cách di truyền cách biệt $7,27%$ so với R. orlovi và $20,16%$ so với R. calcaneus.
   • Zhangixalus franki (Ếch cây frank): Mô tả dựa trên các quần thể trước đây nhầm lẫn với Z. smaragdinus tại vùng núi cao phía Bắc.
   • Zhangixalus jodiae (Ếch cây jodi): Ghi nhận tại vùng núi đá vôi Hà Giang.

3. Giải quyết nhầm lẫn phân loại và xác lập đồng vật học của Rhacophorus viridimaculatus: Kết quả giải trình tự khẳng định độ sai biệt di truyền giữa mẫu chuẩn R. viridimaculatus và R. orlovi chỉ từ $0,00%$ đến $0,33%$. Thẩm định giải phẫu chứng minh các tiêu bản chuẩn ZISP 11471 và ZISP 11474 thực chất là cá thể cái chứ không phải đực. Sai khác về màu sắc chỉ là biến dị cá thể trong cùng một quần thể, chính thức hạ bậc R. viridimaculatus thành tên đồng vật của R. orlovi.

4. Tách biệt hình thái định lượng bằng PCA loading giữa các loài đồng hình: Phân tích PCA trên 127 cá thể R. annamensis ($103,\male, 24,\female$) và 74 cá thể R. exechopygus ($67,\male, 7,\female$) cho thấy hai vùng đa giác hình thái tách biệt hoàn toàn không có điểm chồng lấn. Ở cá thể đực, 5 chỉ số đóng góp phân kỳ mạnh nhất (PCA loadings cao nhất) là: Chiều dài ngón chân II ($0,2211$), ngón chân III ($0,2187$), ngón chân IV ($0,2187$), chiều rộng cẳng chân ($0,2141$) và khoảng cách mắt - mũi ($0,2058$). Ở cá thể cái, các chỉ số phân tách chính gồm Chiều dài ngón chân I ($0,2348$), ngón chân II ($0,2281$), ngón chân III ($0,2228$) và chiều rộng ống chân ($0,2223$).

5. Cấu trúc phân vùng địa sinh vật học và tính đặc hữu: Trong 8 phân vùng địa sinh vật, phân vùng Núi cao Trung Trường Sơn (CAN) sở hữu mức độ đa dạng cao nhất với 8 loài ghi nhận. Ngược lại, phân vùng Đồng bằng sông Cửu Long (MEK) hoàn toàn vắng bóng các đại diện của giống do rào cản sinh cảnh ngập nước đồng bằng. Hai phân vùng Núi cao Tây Bắc (NWU) và Bắc Trường Sơn (NAN) đóng vai trò trung tâm đặc hữu với tỷ lệ loài đặc hữu cao nhất (2 loài đặc hữu/6 loài ghi nhận mỗi vùng). Mức độ tương đồng thành phần loài cao nhất ghi nhận giữa Đông Bắc (NEU) và Đồng bằng Bắc Bộ (NEL), cũng như giữa Nam Trường Sơn (SAN) và Duyên hải Nam Trung Bộ (CSL) với chỉ số $d_{jk} = 0,923$.

   Phân vùng  Số loài  Đặc hữu              Đặc điểm nổi bật
   CAN           8        0       Đa dạng thành phần loài cao nhất cả nước
   SAN           7        1       Có sự xuất hiện của R. calcaneus, R. vampyrus
   NEL           7        0       Tương đồng sinh thái cao với vùng Đông Bắc
   NWU           6        2       Trung tâm đặc hữu cao (chứa R. hoanglienensis)
   NAN           6        2       Trung tâm đặc hữu cao (chứa R. orlovi)
   NEU           6        0       Phân bố của các loài vùng núi đá vôi
   CSL           6        0       Vùng chuyển tiếp duyên hải Nam Trung Bộ
   MEK           0        0       Không có ghi nhận (thiếu sinh cảnh rừng núi)

Implications đa chiều

• Hệ hàm ý Lý thuyết: Cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc xác lập tính đơn ngành của các nhánh tiến hóa trong họ Rhacophoridae tại Đông Dương; làm sáng tỏ các con đường phân tán sinh học qua ranh giới tự nhiên sông Hồng và dãy Trường Sơn.
• Hệ hàm ý Phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình phân tích hình thái đa biến kết hợp chỉ thị phân tử đa vùng gen ty thể thành khung giao thức chuẩn có khả năng chuyển giao cho các nghiên cứu trên các nhóm lưỡng cư phức tạp khác (như Kurixalus, Theloderma, Gracixalus).
• Hệ hàm ý Bảo tồn và Chính sách:
  • Cung cấp luận cứ khoa học trực tiếp để cập nhật Danh lục Đỏ IUCN (2021) đối với 3 loài Nguy cấp (EN: Rhacophorus calcaneus, R. vampyrus, R. kio) và 2 loài Sắp nguy cấp (VU: R. annamensis, R. helenae).
  • Cung cấp dữ liệu phục vụ quản lý thực thi Nghị định 06/2019/NĐ-CP và Nghị định 64/2019/NĐ-CP của Chính phủ về quản lý các loài động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm ưu tiên bảo vệ.
  • Định hướng ưu tiên bảo tồn các sinh cảnh rừng trên núi đá vôi tại các vùng ranh giới (Hang Kia - Pà Cò, Na Hang, Quản Bạ, Phong Nha - Kẻ Bàng, Kon Ka Kinh, Chư Yang Sin).

Limitations và Future Research

Luận án thẳng thắn chỉ ra các giới hạn nghiên cứu nội tại mang tính khoa học:

1. Giới hạn về hệ chỉ thị di truyền: Nghiên cứu tập trung giải mã 3 đoạn gen thuộc hệ gen ty thể (12S rRNA, tRNA-Val, 16S rRNA). Mặc dù các đoạn gen này có tốc độ đột biến cao và hiệu quả trong định danh phân loại, nhưng do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, chúng chưa phản ánh được toàn diện hiện tượng lai xa tiềm ẩn (introgression) hoặc phân loại dòng dõi không hoàn chỉnh (incomplete lineage sorting) vốn cần kiểm chứng qua hệ gen nhân (nuclear DNA).
2. Giới hạn cỡ mẫu ở một số loài quý hiếm: Một số đơn vị phân loại chỉ thu thập được số lượng mẫu rất hạn chế do tính chất hiếm gặp và vùng phân bố hẹp (ví dụ: Rhacophorus marmoridorsum chỉ biết qua mẫu chuẩn lịch sử, 2 đơn vị phân loại chưa định danh Rhacophorus sp1. và Rhacophorus sp2. mới có ít cá thể).
3. Thiếu hụt dữ liệu âm thanh sinh học (Bioacoustics): Chưa tích hợp được phân tích cấu trúc tiếng kêu giao hoan (mating calls) của con đực—một rào cản cách ly sinh sản hành vi cực kỳ quan trọng ở lưỡng cư không đuôi.

Chương trình nghiên cứu tương lai (5 hướng nghiên cứu ưu tiên):

• Mở rộng giải trình tự bộ gen đại diện thông qua kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (RAD-seq hoặc giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể Mitogenome kết hợp UCEs - Ultraconserved Elements).
• Thu thập và phân tích phổ âm thanh tiếng kêu (bioacoustic analysis) của các loài đồng hình trong mùa sinh sản để xác lập rào cản cách ly hành vi.
• Nghiên cứu chu thái phát triển ontogeny và hình thái học so sánh nòng nọc chi tiết cho toàn bộ 25 loài.
• Ứng dụng mô hình hóa ổ sinh thái (Ecological Niche Modeling - MaxEnt) dự báo tác động của biến đổi khí hậu đến sự thu hẹp vùng phân bố của các loài đặc hữu hẹp (R. hoabinhensis, R. vanbanicus).
• Đánh giá độc học sinh thái và sự suy giảm quần thể do nấm sát thủ lưỡng cư (Batrachochytrium dendrobatidis - Bd) tại các vùng núi cao Hoàng Liên Sơn và Tây Nguyên.

Tác động và ảnh hưởng

• Ảnh hưởng Học thuật: Luận án là công trình tổng quan và tu chỉnh hệ thống học toàn diện nhất về giống Rhacophorus sensu lato tại Việt Nam trong suốt hai thập kỷ qua. Các kết quả công bố trên các tạp chí chuyên ngành quốc tế uy tín (Zootaxa, ZooKeys, Russian Journal of Herpetology) tạo nguồn trích dẫn nền tảng cho giới sinh học lưỡng cư toàn cầu.
• Tác động Thể chế và Quản lý Đa dạng sinh học: Kết quả luận án được các cơ quan quản lý nhà nước (Cục Kiểm lâm, Tổng cục Môi trường) và các Vườn quốc gia (Phong Nha - Kẻ Bàng, Kon Ka Kinh, Chư Yang Sin, Phước Bình) sử dụng trực tiếp để hiệu chỉnh danh lục đa dạng sinh học và xây dựng phương án quản lý rừng bền vững.
• Ý nghĩa Xã hội và Môi trường: Nhóm ếch cây là loài chỉ thị sinh thái (bioindicators) nhạy cảm nhất đối với chất lượng môi trường rừng nguyên sinh và nguồn nước. Việc bảo tồn các loài này gắn liền trực tiếp với việc duy trì dịch vụ hệ sinh thái đầu nguồn và bảo vệ vốn gen quý bản địa của Việt Nam.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học viên Sau đại học: Tiếp cận bộ dữ liệu chuẩn hóa về 34 biến số hình thái, hệ thống primer tối ưu hóa cho PCR, và giao thức phân tích phát sinh loài Bayes hiện đại.
• Giới Chuyên gia Động vật học và Tiến hóa sinh học: Sở hữu tập dữ liệu di truyền học ty thể có kiểm chứng mẫu chuẩn bảo tàng để phục vụ các phân tích biogeography quy mô châu Á.
• Ban Quản lý các Khu Bảo tồn Thiên nhiên và Vườn Quốc gia: Nhận diện chính xác các loài nguy cấp, đặc hữu thông qua khóa định loại hình thái cập nhật, từ đó xác lập các phân khu bảo vệ nghiêm ngặt.
• Cơ quan Hoạch định Chính sách Bảo tồn: Có luận cứ khoa học thực chứng để phân hạng mức độ bị đe dọa của các loài ếch cây phục vụ xây dựng Sách Đỏ Việt Nam và Danh mục động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của công trình là gì? Đóng góp độc đáo nhất là việc vận dụng thành công thuyết Phân loại học Tích hợp để chứng minh tính hợp thức của việc phân tách hai giống Rhacophorus sensu stricto và Zhangixalus ở Việt Nam, giải quyết triệt để sự nhập nhằng kéo dài giữa các trường phái phân loại hình thái và phân tử.

2. Đổi mới phương pháp luận của luận án thể hiện qua điểm nào so với các nghiên cứu trước đây? Luận án kết hợp đồng bộ 3 kỹ thuật: phân tích đa biến PCA trên 34 chỉ tiêu hình thái đo đạc từ 1.021 mẫu vật bảo tàng, giải trình tự 3 vùng gen ty thể trên 173 mẫu phân tích bằng mô hình Bayes (MrBayes v3.2) và Maximum Likelihood, cùng phân tích chỉ số tương đồng không gian Sorensen-Dice. Cách tiếp cận này vượt trội hoàn toàn so với các nghiên cứu đơn lẻ trước đây vốn chỉ dựa vào mô tả hình thái định tính (Bourret 1942; Orlov et al. 2001) hoặc phân tích di truyền thuần túy thiếu vắng đối chiếu hình thái chuyên sâu (Jiang et al. 2019).

3. Phát hiện bất ngờ nhất về mặt tiến hóa/phân loại trong dữ liệu nghiên cứu là gì? Phát hiện bất ngờ nhất là trường hợp của loài Rhacophorus viridimaculatus. Mặc dù được mô tả như một loài độc lập với các khác biệt hình thái rõ rệt về màu sắc và nốt sần, phân tích di truyền cho thấy khoảng cách di truyền với R. orlovi chỉ ở mức $0,00% - 0,33%$. Việc tái thẩm định mẫu chuẩn đã phát hiện lỗi phân loại lịch sử về giới tính (nhầm lẫn cá thể cái thành cá thể đực), từ đó chứng minh đây chỉ là hiện tượng đa hình kiểu hình và xác lập quan hệ đồng vật.

4. Nghiên cứu có cung cấp giao thức tái lặp (replication protocol) minh bạch không? Có. Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ chuỗi thông tin sao chép thực nghiệm: danh mục 7 đoạn mồi PCR kèm trình tự nucleotit, nồng độ thành phần phản ứng $20,\mu\text{l}$, chu trình nhiệt luân nhiệt, phần mềm phân tích (PAST, Kakusan 4, Treefinder, MrBayes v3.2), tiêu chí lựa chọn mô hình AIC, và danh lục toàn bộ 1.021 mẫu vật kèm số hiệu bảo tàng (VNMN, IEBR, HNUE, ZISP).

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo cần tập trung vào vấn đề gì? Cần tập trung vào việc giải mã toàn bộ hệ gen nhân (Nuclear phylogenomics thông qua UCEs/RAD-seq), xây dựng cơ sở dữ liệu tiếng kêu sinh học chuẩn quốc gia, khảo sát bổ sung tại các sinh cảnh núi cao cô lập chưa tiếp cận được ở biên giới Tây Bắc và Trung Trường Sơn, và nghiên cứu cơ chế thích ứng sinh lý học của các loài ếch cây đặc hữu trước áp lực suy thoái sinh cảnh do biến đổi khí hậu.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Ninh Thị Hòa (2021) là một công trình khoa học mẫu mực, toàn diện và có giá trị học thuật cao về hệ thống học lớp Lưỡng cư tại Việt Nam, thể hiện qua 6 đóng góp cốt lõi:

1. Xác lập và củng cố vững chắc bằng chứng phân loại học tích hợp cho việc phân chia giống Rhacophorus sensu lato tại Việt Nam thành hai giống độc lập: Rhacophorus sensu stricto (16 loài và nhóm loài) và Zhangixalus (9 loài).
2. Phát hiện, mô tả và công bố chính thức 4 loài mới cho khoa học (Rhacophorus hoabinhensis, Rhacophorus vanbanicus, Zhangixalus franki, Zhangixalus jodiae).
3. Bổ sung dẫn liệu hình thái và mở rộng vùng phân bố địa lý sinh vật học cho 7 loài ếch cây tại nhiều tỉnh thành trên phạm vi cả nước.
4. Xử lý triệt để các tồn tại phân loại lịch sử, chính thức xác lập Rhacophorus viridimaculatus là tên đồng vật thứ sinh của Rhacophorus orlovi dựa trên bằng chứng di truyền ($0,00% - 0,33%$) và tái giám định mẫu chuẩn.
5. Cung cấp bộ cơ sở dữ liệu hình thái định lượng chuẩn hóa (34 chỉ tiêu trên 1.021 mẫu vật) và dữ liệu sinh học phân tử (173 trình tự ty thể 12S-tRNA-16S) làm tài liệu tham chiếu chuẩn quốc tế.
6. Xây dựng bản đồ phân vùng địa sinh vật học và đánh giá hiện trạng bảo tồn theo tiêu chuẩn IUCN Red List và Nghị định 06/2019/NĐ-CP, định hình chiến lược bảo tồn đa dạng sinh học rừng nhiệt đới Việt Nam trong kỷ nguyên mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Những đóng góp mới của đề tài. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Lược sử nghiên cứu về phân loại các loài Lưỡng cư thuộc giống Rhacophorus theo phương pháp phân tích hình thái.

Lược sử nghiên cứu về quan hệ di truyền của giống Rhacophorus. Phân vùng địa lý sinh vật khu hệ Lưỡng cư ở Việt Nam. 13 CHƯƠNG II: ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu.

Cách tiếp cận giải quyết vấn đề nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Khảo sát thực địa. Phân tích đặc điểm hình thái.

Phương pháp phân tích sinh học phân tử. Phân tích thống kê. 23 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.

Về phân loại giống Rhacophorus sensu lato. Giống Rhacophorus Kuhl & Van Hasselt, 1822. Đa dạng thành loài giống Rhacophorus ở Việt Nam. Mô tả đặc điểm hình thái các loài trong giống Rhacophorus ở Việt Nam.

Quan hệ di truyền các loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam. Các vấn đề tu chỉnh phân loại học các loài Lưỡng cư giống Rhacophorus ở Việt Nam. Giống Zhangixalus Li, Jiang, Ren & Jiang, 2019 ở Việt Nam. Đa dạng thành phần loài giống Zhangixalus ở Việt Nam.

Mô tả đặc điểm hình thái các loài trong giống Zhangixalus ở Việt Nam. Quan hệ di truyền các loài Lưỡng cư trong giống Zhangixalus. Các vấn đề tu chỉnh phân loại học các loài Lưỡng cư giống Zhangixalus ở Việt Nam. 112 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .146 v Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ♀ Cái ♂ Đực CITES Công ước về thương mại quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp IEBR Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật IUCN Hiệp hội Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế KBTTN Khu Bảo tồn thiên nhiên LC Lưỡng cư LCBS Lưỡng cư, Bò sát Nghị định số 06/2019/NĐ-CP của Chính phủ nước CHXHCN Việt Nam về quản lý thực vật rừng, động vật rừng NĐ06/2019/NĐ-CP nguy cấp, quý, hiếm và thực thi công ước về buôn bán quốc tế các loài động vật, thực vật hoang dã nguy cấp Nghị định số 64/2019/NĐ-CP của Chính phủ nước NĐ64/2019/NĐ-CP CHXHCN Việt Nam về chế độ quản lý loài thuộc Danh mục loài nguy cấp, quý hiếm được ưu tiên bảo vệ rARN ARN ribosome RPH Rừng phòng hộ SĐVN Sách Đỏ Việt Nam Sensu lato Hiểu theo nghĩa rộng Sensu stricto Hiểu theo nghĩa hẹp VNMN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam VQG Vườn quốc gia vi Danh mục các bảng Bảng 2.

Danh sách các chuyến thực địa Nghiên cứu sinh đã tham gia. Các chỉ số đo hình thái mẫu mẫu ếch nhái trưởng thành. Thông tin trình tự mồi được sử dụng cho nghiên cứu. Thành phần và hàm lượng các chất trong hỗn hợp phản ứng PCR.

Danh sách các loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam. Phân bố của các loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam theo phân vùng địa lý sinh vật khu hệ Lưỡng cư. Chỉ số tương đồng (Sorensen-Dice) về phần loài Lưỡng cư thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam theo phân vùng địa lý sinh vật khu hệ Lưỡng cư. Khoảng cách di truyền các loài Lưỡng cư thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam.

Danh sách các loài Lưỡng cư thuộc giống Zhangixalus ở Việt Nam. Phân bố của các loài thuộc giống Zhangixalus ở Việt Nam theo phân vùng địa lý sinh vật khu hệ Lưỡng cư. Chỉ số tương đồng (Sorensen-Dice) về phần loài Lưỡng cư thuộc giống Zhangixalus ở Việt Nam theo phân vùng địa lý sinh vật khu hệ Lưỡng cư. Khoảng cách di truyền các loài Lưỡng cư trong giống Zhangixalus .104 vii Danh mục các hình Hình 1.

Các phân vùng địa lý sinh vật Lưỡng cư và Bò sát ở khu vực Đông Dương (Theo Bain và Hurley 2011). Sơ đồ các điểm mẫu vật được thu thập phục vụ nghiên cứu. Cây quan hệ di truyền các loài trong giống Rhacophorus sensu lato xây dựng trên mô hình BI. Mức độ tương đồng về thành phần loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam giữa các phân vùng địa lý sinh vật.

Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus annamensis. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus exechopygus. Biểu đồ so sánh sự sai khác kích thước của hai loài ếch cây R. exechopygus bằng phương pháp phân tích thành phần chính.

Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus calcaneus. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus robertingeri. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus helenae. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus kio.

Biểu đồ so sánh sự sai khác kích thước của hai loài ếch cây R. helenae bằng phương pháp phân tích thành phần chính. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus hoabinhensis. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus hoanglienensis.

Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus larissae. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus marmoridosum .26 Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus orlovi. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus vanbanicus. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus sp1.

Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus sp2. Sơ đồ phân bố nhóm loài Rhacophorus rhodopus. Sơ đồ phân bố loài Rhacophorus vampyrus. Cây quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Rhacophorus xây dựng trên mô hình BI.

Cây quan hệ di truyền của các quần thể loài Rhacophorus orlovi xây dựng trên mô hình BI. Cây quan hệ di truyền các loài trong nhóm hoanglienensis- orlovi xây dựng trên mô hình BI. Mức độ tương đồng về thành phần loài Lưỡng cư thuộc giống Zhangixalus ở Việt Nam giữa các phân vùng địa lý sinh vật khu hệ Lưỡng cư. Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus dennysi.

Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus pachyproctus. Biểu đồ so sánh sự sai khác kích thước của hai loài ếch cây Z. pachyproctus bằng phương pháp phân tích thành phần chính. Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus feae.

Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus duboisi. Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus franki. Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus puerensis. Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus dorsoviridis.

Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus jodiae. Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus sp1. Cây quan hệ di truyền các loài trong nhóm Zhangixalus xây dựng trên mô hình BI. Cây quan hệ di truyền các quần thể loài Zhangixalus feae xây dựng trên mô hình BI.

Cây quan hệ di truyền giữa các quần thể loài Zhangixalus pachyproctus xây dựng trên mô hình BI. Sơ đồ phân bố loài Zhangixalus pachyproctus và Z. Tính cấp thiết của đề tài Đa dạng sinh học của Việt Nam thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học với ba lý do chính: (1) Việt Nam là đất nước có mức độ đa dạng sinh học cao, (2) có nhiều loài mới được các nhà khoa học phát hiện và mô tả mới từ năm 1992 trở lại đây và (3) tỷ lệ cao các loài được ghi nhận là loài đặc hữu [134]. Theo Hiệp hội Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN) 2016, Việt Nam thuộc vùng Indo-Burma, một trong 35 điểm nóng về đa dạng sinh học thế giới trong đó có lớp Lưỡng cư (LC) [76].

Số lượng các loài LC ghi nhận ở Việt Nam liên tục gia tăng qua các thời kì nghiên cứu: Năm 1996, Nguyễn Văn Sáng và cs. ghi nhận 82 loài, năm 2009, số lượng loài ghi nhận đã tăng lên 176 loài và đến năm 2014, số lượng loài ghi nhận tăng lên 222 loài, đến nay là 297 loài [25], [58], [99], [121]. Đặc biệt, có hơn 70 loài mới cho khoa học được mô tả dựa trên bộ mẫu thu từ Việt Nam kể từ năm 2010 đến nay (Frost 2021) [58]. Họ Ếch cây Rhacophoridae là một trong những họ đa dạng nhất trong lớp LC với hơn 443 loài thuộc 23 giống.

Trong đó ở Việt Nam có 85 loài thuộc 15 giống đã được ghi nhận [58]. Đã có một số nghiên cứu về đa dạng thành phần các loài thuộc giống Ếch cây Rhacophorus ở Việt Nam và một số loài mới được phát hiện trong những năm gần đây như: Rhacophorus kio và R. Trong khi số lượng loài mới tăng lên thì các vấn đề về phân loại học của một số loài, nhóm loài vẫn còn nhiều quan điểm khác nhau. Nhiều loài được mô tả dựa trên phân tích hình thái của một hoặc một số lượng rất ít mẫu vật như R.

đồng thời nhiều loài và nhóm loài có sự tương đồng cao về hình thái như R. Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy sự kết hợp phân tích các dữ liệu về di truyền phân tử với hình thái học giúp các nhà nghiên cứu giải quyết được các vấn đề 2 phân loại của nhóm loài đồng hình cũng như hiểu rõ hơn mối quan hệ di truyền, phát sinh loài và tiến hóa của các loài LC [87], [147]. Kết quả gần đây của các nhà nghiên cứu nước ngoài dựa trên phân tích các dữ liệu di truyền phân tử đã tách giống Rhacophorus sensu lato thành bốn giống là Rhacophorus sensu stricto, Leptomantis, Vampyrius và Zhangixalus. Theo đó, một số đặc điểm hình thái đặc trưng để nhận dạng cho từng giống được đề xuất.

Tuy nhiên, các đặc điểm này là chưa đại điện đầy đủ với tất các loài trong giống Rhacophorus sensu lato do mẫu vật phân tích sử dụng cho các nghiên cứu này chủ yếu được thu từ Trung Quốc, rất ít mẫu đại diện cho các loài ở Việt Nam và các nước có ghi nhận phân bố [58], [77], [118]. Bên cạnh đó, Rhacophorus cũng là giống LC bị đe dọa tuyệt chủng cao. Theo đánh giá của IUCN (2021) trong tổng số 27 loài ếch cây ghi nhận ở Việt Nam có 3 loài được xếp ở bậc nguy cấp (EN) là Rhacophorus calcaneus, R. vampyrus, 2 loài xếp ở bậc sẽ nguy cấp (VU) là R.

Ở cấp quốc gia, hiện có 3 loài ếch cây có tên trong Sách Đỏ Việt Nam (2007) trong đó có 2 loài thuộc giống Rhacophorus là R. Đồng thời nhiều loài hiện chỉ ghi nhận ở nước ta gồm: R. Một số loài thuộc giống Rhacophorus có vùng phân bố địa lý hẹp, cho đến nay chỉ được biết đến một mẫu vật duy nhất hoặc rất ít mẫu đang được lưu giữ trong các bộ sưu tập bảo tàng trong nước và ngoài nước. Chính vì vậy, nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền các loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn góp phần cung cấp dẫn liệu cho công tác nghiên cứu quy hoạch bảo tồn đa dạng sinh học.

Với những lí do trên, Nghiên cứu sinh (NCS) đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, mối quan hệ di truyền và hệ thống học các loài Lưỡng cư thuộc giống Rhacophorus (Amphibia: Rhacophoridae) ở Việt Nam”.