Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Động vật học (mã số: 9.03) của nghiên cứu sinh Ninh Thị Hòa, được bảo vệ tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội năm 2021 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Lê Xuân Cảnh và PGS. Nguyễn Thiên Tạo, mang tiêu đề: "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, mối quan hệ di truyền và hệ thống học các loài Lưỡng cư thuộc giống Rhacophorus (Amphibia: Rhacophoridae) ở Việt Nam".

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, văn bản luận án chỉ rõ Việt Nam nằm trong khu vực đa dạng sinh học Indo-Burma với số lượng loài lưỡng cư liên tục gia tăng (từ 82 loài năm 1996 lên 297 loài tại thời điểm 2021, trong đó có hơn 70 loài mới được mô tả từ năm 2010). Họ Ếch cây (Rhacophoridae) ghi nhận 85 loài thuộc 15 giống tại Việt Nam, riêng giống Rhacophorus chiếm ưu thế nhưng tồn tại nhiều bất cập phân loại học. Nhiều loài được mô tả chỉ dựa trên một hoặc rất ít mẫu vật (chẳng hạn Rhacophorus marmoridorsum), đồng thời nhiều nhóm loài có mức độ tương đồng cao về hình thái bên ngoài (loài đồng hình, phức hợp loài ẩn). Mặc dù các nghiên cứu quốc tế đã đề xuất phân tách giống Rhacophorus sensu lato thành bốn giống (Rhacophorus sensu stricto, Leptomantis, Vampyrius, Zhangixalus), các kết luận này chủ yếu dựa trên mẫu vật thu tại Trung Quốc, thiếu đại diện mẫu từ Việt Nam và các nước lân cận. Mặt khác, giống Rhacophorus có tỷ lệ bị đe dọa tuyệt chủng cao (nhiều loài có tên trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 và Danh lục Đỏ IUCN 2021) cùng nhiều loài có vùng phân bố địa lý hẹp.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm hai nội dung chính:

  1. Đánh giá được mức độ đa dạng loài và mô tả đặc điểm hình thái của các loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam.
  2. Đánh giá được mối quan hệ di truyền và phân loại các loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam.

Nhiệm vụ nghiên cứu được phân định thành ba nội dung cụ thể:

  • Nội dung 1: Nghiên cứu mức độ đa dạng thành phần loài, mô tả đặc điểm hình thái của một số loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam.
  • Nội dung 2: Nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các quần thể và giữa các loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam.
  • Nội dung 3: Tu chỉnh vị trí phân loại của các loài thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các loài ếch cây thuộc giống Rhacophorus sensu lato (về sau được xác định lại thuộc hai giống Rhacophorus sensu stricto và Zhangixalus).
  • Phạm vi không gian: Toàn lãnh thổ Việt Nam, trong đó nghiên cứu sinh trực tiếp khảo sát thực địa tại 5 tỉnh (Lai Châu, Ninh Thuận, Tuyên Quang, Hà Tĩnh, Quảng Bình), kết hợp nguồn mẫu bổ sung từ Hà Giang, Sơn La, Thanh Hóa, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk và hệ thống tiêu bản lưu trữ tại các bảo tàng trong nước, quốc tế (kèm mẫu đối chiếu từ Lào).
  • Phạm vi thời gian: Khảo sát thực địa và phân tích hình thái, sinh học phân tử được triển khai từ năm 2016 đến năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Văn bản luận án phân tích lịch sử nghiên cứu phân loại hình thái và di truyền phân tử theo tiến trình thời gian và không gian địa lý:

Về nghiên cứu hình thái:

  • Tại các quốc gia lân cận: Ở Trung Quốc, từ các công trình khảo sát mẫu vật bảo tàng của Schmidt (1927), Zhao & Adler (1993), đến Fei và cộng sự (2010), ghi nhận thành phần loài tăng từ 13 loài lên 39 loài thuộc giống Rhacophorus. Tại Campuchia, Ohler (2002), Stuart và cộng sự (2006), Neang và cộng sự (2015) ghi nhận 5 loài thuộc giống Rhacophorus sensu lato. Tại Lào, Stuart và cộng sự (2005) ghi nhận 5 loài; Ohler và cộng sự (2006) mô tả R. kio; Orlov và cộng sự (2010) mô tả R. spelaeus.
  • Tại Việt Nam: Các nghiên cứu hình thái khởi đầu từ thế kỷ XX của Smith (1924), Bourret (1937, 1942). Giai đoạn tiếp theo ghi nhận công trình định loại của Đào Văn Tiến (1977), Trần Kiên và cộng sự (1981), danh lục của Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc (1996) ghi nhận 8 loài Rhacophorus. Từ năm 2000 đến 2014, hàng loạt công bố mô tả loài mới và bổ sung thành phần loài được thực hiện bởi Ohler và cộng sự (2000, 2006), Ziegler và cộng sự (2000), Orlov và cộng sự (2001, 2002, 2008, 2012), Bordoloi và cộng sự (2007), Chou và cộng sự (2007), Ostroshabov và cộng sự (2013), Nguyen và cộng sự (2009, 2010, 2014).

Về nghiên cứu quan hệ di truyền phân tử:

  • Trên thế giới: Các công trình hệ thống học lưỡng cư của Frost và cộng sự (2006) sử dụng tổ hợp gen ty thể (12S rRNA, tRNAval, 16S rRNA) và gen nhân (H3, rhodopsin, tyrosinase, SINA, 28S) ghi nhận 10 giống trong họ Rhacophoridae; Pyron & Wiens (2011) phân chia họ thành hai phân họ Rhacophorinae và Buergeriinae; Dubois và cộng sự đề xuất lập giống Vampyrius cho loài V. vampyrus.
  • Tại khu vực và Việt Nam: Yu và cộng sự (2008, 2010, 2019), Li và cộng sự (2008, 2009, 2013), Pan và cộng sự (2017) phân tích phát sinh loài ếch cây dựa trên gen ty thể kết hợp gen nhân. Jiang và cộng sự (2019) tách Rhacophorus sensu lato thành ba giống dựa trên 3 đoạn gen ty thể. Tại Việt Nam, Wilkinson và cộng sự (2002) phân tích gen 12S rRNA và 16S rRNA chuyển loài Polypedates dennysi sang Rhacophorus; Rowley và cộng sự mô tả R. vampyrus (2010) và R. helenae (2012); Nguyen và cộng sự (2014) phân tích gen 16S rRNA của 18 loài ếch cây chỉ ra các phức hợp loài ẩn chưa được giải quyết như R. rhodopus – bipunctatus.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết: Phần lớn các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam dựa thuần túy vào hình thái học truyền thống, dẫn đến nhầm lẫn định danh (như trường hợp R. reinwardtii, R. calcaneus, R. chuyangsinensis). Trong khi đó, các nghiên cứu sinh học phân tử quốc tế đề xuất tách giống lại thiếu dữ liệu mẫu đại diện của các loài đặc hữu và phân bố hẹp ở Việt Nam. Luận án chọn vị trí tích hợp phân tích hình thái so sánh chi tiết trên tập mẫu lớn với phân tích dữ liệu chuỗi ADN ty thể nhằm thẩm định hệ thống phân loại giống Rhacophorus sensu lato tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng khung tiếp cận hệ thống học tích hợp (integrative taxonomy), kết hợp các tiêu chí hình thái học so sánh, chỉ thị di truyền phân tử ty thể và phân tích phân vùng địa lý sinh vật theo mô hình Bain & Hurley (2011).

Dữ liệu và nguồn mẫu vật

Nghiên cứu sinh thực hiện 5 chuyến khảo sát thực địa trực tiếp với tổng số 62 ngày thực địa tại Lai Châu, Ninh Thuận, Tuyên Quang, Hà Tĩnh, Quảng Bình; đồng thời thu thập mẫu bổ sung từ Hà Giang, Sơn La, Thanh Hóa, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk.

Cơ quan lưu trữ mẫu Số lượng mẫu hình thái
Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (VNMN) 649
Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (IEBR) 301
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 48
Viện Động vật Xanh-pê-téc-bua, Nga (ZISP) 20
Vườn thú Cologne, CHLB Đức 3
Tổng cộng mẫu phân tích hình thái 1.021 (938 trưởng thành, 66 chưa trưởng thành, 17 nòng nọc)
Tổng cộng mẫu giải trình tự ADN 173 (170 mẫu Việt Nam, 3 mẫu R. spelaeus từ Lào) + 77 trình tự GenBank

Phương pháp phân tích hình thái

Tiến hành đo đạc 34 chỉ tiêu kích thước theo tài liệu của Orlov và cộng sự (2012), Nguyen và cộng sự (2014): SVL (chiều dài mút mõm - lỗ huyệt), HW (rộng đầu), HL (dài đầu), MN (khoảng cách góc hàm - mũi), MFE (khoảng cách góc hàm - trước mắt), MBE (khoảng cách góc hàm - sau mắt), SNL (dài mõm), ED (đường kính mắt), UEW (rộng mí mắt trên), IN (khoảng cách gian mũi), IOD (rộng gian ổ mắt), DAE (khoảng cách góc trước hai ổ mắt), DPE (khoảng cách góc sau hai ổ mắt), EN (khoảng cách mắt - mũi), TYD (đường kính màng nhĩ), TYE (khoảng cách mắt - màng nhĩ), FLL (dài cánh tay), HAL (dài bàn tay), IPT (dài củ bàn trong bàn tay), FI-IV (dài các ngón tay I đến IV), FeL (dài đùi), TbL (dài ống chân), TbW (rộng ống chân), FoL (dài bàn chân), TI-V (dài các ngón chân I đến V), IMT (dài củ bàn chân trong).

Công thức màng bơi xác định theo Glaw & Vences (2007). Tiêu bản nòng nọc định loại theo Gosner (1960) và Altig (2007). Đối với các loài đồng hình có cỡ mẫu n > 30, dữ liệu hình thái được xử lý phân tích thành phần chính (PCA) trên phần mềm PAST.

Phương pháp sinh học phân tử

Giải trình tự 3 đoạn gen ty thể: 12S rRNA, tRNAval và 16S rRNA. Tách chiết ADN bằng bộ kít Qiagen theo quy trình Kuraishi và cộng sự (2013) hiệu chỉnh bởi Nguyen và cộng sự (2015).

Tên mồi Trình tự nucleotide (5' - 3') Nguồn tài liệu
H3056 CTCCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGG Hedges (1994)
L2606 CTGACCGTGCAAAGGTAGCGTAATCACT Hedges (1994)
Will 6 CCCTCGTGATGCCGTTGATAC Wilkinson và cộng sự (2002)
Tval L CGTACCTTTTGCATCATGGTC Wilkinson và cộng sự (2002)
L1091 AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT Canatella và cộng sự (1998)
Hnew TACCATGTTACGACTTTCCTCTTCT Matsui và cộng sự (2005)
L2204 GGCCTAAAAGCAGCCACCTGTAAAGACAG Matsui và cộng sự (2005)

Thành phần phản ứng PCR (tổng thể tích 20 µl): Taq PCR Master Mix 2x (10 µl), mồi xuôi 20 pmol (0,5 µl), mồi ngược 20 pmol (0,5 µl), ADN khuôn 10 ng (2 µl), bổ sung nước khử ion. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, tinh sạch bằng kít GeneJETTM, giải trình tự tại Macrogen (Hàn Quốc).

Xử lý dữ liệu: Phần mềm Chromas Pro 2 cắt bỏ đoạn mồi; kiểm tra độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên GenBank; gióng hàng chuỗi bằng BioEdit; lựa chọn mô hình tiến hóa nucleotide bằng tiêu chí thông tin Akaike (AIC) trên phần mềm Kakusan 4; xây dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML) trên Treefinder và Bayesian Inference (BI) trên MrBayes v3. Độ tin cậy nhánh được xác thực khi giá trị bootstrap ML ≥ 75% và xác suất hậu nghiệm BI ≥ 95% (0,95).

Phân tích địa lý sinh vật và thống kê

Đánh giá phân bố theo 8 phân vùng địa lý sinh vật của Bain & Hurley (2011): Tây Bắc (NWU), Đông Bắc (NEU), Đồng bằng Bắc Bộ (NEL), Bắc Trường Sơn (NAN), Trung Trường Sơn (CAN), Nam Trường Sơn (SAN), Đồng bằng Nam Trung Bộ (CSL), Đồng bằng sông Cửu Long (MEK). Tính toán chỉ số tương đồng thành phần loài Sorensen-Dice trên phần mềm PAST theo công thức: $$d_{jk} = \frac{2M}{2M + N}$$ Trong đó $M$ là số loài chung giữa hai vùng, $N$ là tổng số loài chỉ xuất hiện ở một trong hai vùng.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu phân loại hình thái và quan hệ di truyền của giống Rhacophorus trên thế giới, khu vực lân cận (Trung Quốc, Lào, Campuchia) và Việt Nam. Tác giả tổng thuật các hệ thống phân loại từ thời kỳ hình thái học cổ điển đến giai đoạn ứng dụng sinh học phân tử hiện đại. Đồng thời, chương I phân tích cơ sở phân vùng địa lý sinh vật khu hệ lưỡng cư Việt Nam, kế thừa phân chia 7 khu vực của Nguyễn Văn Sáng (1985), Trần Kiên và Hoàng Xuân Quang (1992) và mô hình chi tiết dựa trên địa hình - khí hậu của Bain & Hurley (2011), chỉ ra vùng Tây Bắc (NWU) sở hữu tính đa dạng và tỷ lệ đặc hữu cao nhất do ảnh hưởng của dãy Hoàng Liên Sơn nối liền khối Himalaya.

Chương II: Địa điểm, đối tượng, thời gian và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và thu thập số liệu:

  • Lập danh mục và tọa độ các tuyến khảo sát thực địa trong 62 ngày điều tra trực tiếp; ghi nhận thông tin sinh cảnh, tầng cây, độ cao, thời gian bắt mẫu ban đêm (18:00 - 24:00).
  • Trình bày bộ dữ liệu 1.021 mẫu vật phân tích hình thái từ 5 bảo tàng, viện nghiên cứu lớn; quy cách xử lý mẫu mô học ngâm cồn 95%, cố định tiêu bản cồn 80-90% và bảo quản cồn 70% theo Simmons (2002).
  • Chuẩn hóa hệ thống đo đạc 34 chỉ tiêu kích thước hình thái và phương pháp phân tích thành phần chính (PCA) trên phần mềm PAST.
  • Chi tiết hóa điều kiện thực nghiệm sinh học phân tử: các cặp mồi khuếch đại gen ty thể (12S rRNA, tRNAval, 16S rRNA), chu trình nhiệt, quy trình tinh sạch sản phẩm PCR và các thuật toán tái dựng cây chủng loại phát sinh loài (ML và BI).
  • Định lượng hóa mức độ chia sẻ thành phần loài giữa 8 phân vùng địa lý bằng chỉ số Sorensen-Dice.

Chương III: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

1. Phân loại giống Rhacophorus sensu lato

Qua đối chiếu hình thái 1.021 mẫu và phân tích chuỗi gen ty thể của 173 mẫu, luận án xác nhận quần thể Rhacophorus sensu lato tại Việt Nam phân tách thành hai nhánh độc lập với độ hỗ trợ thống kê tuyệt đối (xác suất hậu nghiệm BI đạt 0,99 - 1,00; khoảng cách di truyền giữa hai nhóm dao động từ 8,56% đến 17,35%):

  • Nhóm A (tương ứng giống Zhangixalus Li et al., 2019): Gồm 9 đơn vị phân loại (8 loài đã định danh: Z. dennysi, Z. duboisi, Z. feae, Z. franki, Z. jodiae, Z. pachyproctus, Z. puerensis, Z. dorsoviridis và 1 loài chưa định danh Zhangixalus sp1). Nhóm này có đặc trưng: mép ngoài cánh tay và ngón tay IV không có riềm da, gót chân không có cựa da nhọn hoặc nếp da, vùng lỗ huyệt nhẵn. Sai khác di truyền nội bộ nhóm từ 0,37% đến 13,2%.
  • Nhóm B (tương ứng giống Rhacophorus sensu stricto Kuhl & Van Hasselt, 1822): Gồm 16 đơn vị phân loại (13 loài đã định danh: R. annamensis, R. calcaneus, R. exechopygus, R. helenae, R. hoabinhensis, R. hoanglienensis, R. kio, R. larissae, R. marmoridorsum, R. orlovi, R. robertingeri, R. vampyrus, R. vanbanicus; 2 loài chưa định danh Rhacophorus sp1, Rhacophorus sp2; 1 nhóm loài Rhacophorus rhodopus). Nhóm này có đặc trưng: mép ngoài cánh tay và ngón chân IV có riềm da, gót chân có cựa da nhọn hoặc nếp da hình chữ nhật, vùng lỗ huyệt có riềm da, nốt sần hoặc gai thịt. Sai khác di truyền nội bộ nhóm từ 1,99% đến 21,32% (loài R. vampyrus có khoảng cách di truyền sai khác xa nhất, từ 14,61% đến 21,32%).

2. Kết quả nghiên cứu giống Rhacophorus sensu stricto

Phát hiện và mô tả loài mới cho khoa học:

  • Rhacophorus hoabinhensis Nguyen et al., 2017: Mô tả từ 2 mẫu đực thu tại KBTTN Hang Kia - Pà Cò (Hòa Bình). Kích thước cơ thể SVL 31,1 - 32,5 mm, không có răng lá mía; công thức màng bơi tay I1⅔-1⅔II1-2III1-1IV và chân I¾-1II½-1III½-1IV1-½V. Khoảng cách di truyền sai khác từ 3,02% (so với Rhacophorus sp1) đến 17,96% (so với R. vampyrus).
  • Rhacophorus vanbanicus Kropachev et al., 2019: Mô tả từ 1 mẫu đực tại Văn Bàn (Lào Cai) và các mẫu bổ sung tại Quản Bạ (Hà Giang), Na Hang (Tuyên Quang). Tỷ lệ HW/HL đạt 0,84 - 0,89 (ở R. orlovi là 0,90 - 0,99 ở con đực và 1,00 - 1,04 ở con cái); mặt dưới đùi có nốt sần chạy dọc. Khoảng cách di truyền sai khác từ 7,27% (so với R. orlovi) đến 20,16% (so với R. helenae).

Tu chỉnh phân loại: Xác định Rhacophorus viridimaculatus Ostroshabov et al., 2013 là tên đồng vật (junior synonym) của Rhacophorus orlovi Ziegler & Köhler, 2001. Dữ liệu gen ty thể cho thấy khoảng cách di truyền giữa các quần thể chỉ từ 0,00% đến 0,33%. Kiểm tra lại mẫu chuẩn ZISP 11471 và đồng chuẩn ZISP 11474 của R. viridimaculatus phát hiện nghiên cứu trước nhầm lẫn về giới tính (các mẫu này là cá thể cái chứ không phải cá thể đực).

Ghi nhận mở rộng phân bố: Bổ sung vùng phân bố mới của R. annamensis tại VQG Bù Gia Mập (Bình Phước) và VQG Phước Bình (Ninh Thuận); R. helenae tại KBTTN Nam Kar (Đắk Lắk); R. kio tại Mường Tè, Phong Thổ (Lai Châu) và Tràng Định (Lạng Sơn); R. orlovi tại Quản Bạ (Hà Giang).

Phân tích hình thái đa biến (PCA): Phân tích 127 mẫu R. annamensis (103 đực, 24 cái) và 74 mẫu R. exechopygus (67 đực, 7 cái) cho thấy hai vùng biểu diễn hình thái phân tách hoàn toàn không chồng lấp. Các chỉ số tải (PCA Loading) phân hóa mạnh nhất ở con đực là chiều dài ngón chân II (0,2211), ngón chân III (0,2187), ngón chân IV (0,2187), rộng cẳng chân (0,2141), khoảng cách mắt - mũi (0,2058).

Tên loài thuộc giống Rhacophorus NWU NEU NEL NAN CAN SAN CSL MEK
Rhacophorus annamensis x x x x
Rhacophorus calcaneus x x
Rhacophorus exechopygus x x
Rhacophorus helenae x x
Rhacophorus hoabinhensis x
Rhacophorus hoanglienensis x x
Rhacophorus kio x x x x x x
Rhacophorus larissae x
Rhacophorus marmoridorsum x
Rhacophorus orlovi x x x x x
Rhacophorus robertingeri x x x x
Rhacophorus vampyrus x x
Rhacophorus vanbanicus x x
Rhacophorus sp1 x
Rhacophorus sp2 x
Nhóm Rhacophorus rhodopus x x x x x x x
Tổng số loài ghi nhận 6 6 7 6 8 7 6 0

Phân vùng núi cao Trung Trường Sơn (CAN) có số loài cao nhất (8 loài). Về mức độ tương đồng thành phần loài (chỉ số Sorensen-Dice), giá trị cao nhất đạt 0,923 giữa hai cặp phân vùng: Đông Bắc (NEU) – Đồng bằng Bắc Bộ (NEL) và Nam Trường Sơn (SAN) – Đồng bằng Nam Trung Bộ (CSL); tiếp đến là Bắc Trường Sơn (NAN) – Trung Trường Sơn (CAN) đạt 0,858.

Phân vùng NWU NEU NEL NAN CAN SAN CSL
NWU 1
NEU 0,667 1
NEL 0,615 0,923 1
NAN 0,500 0,500 0,462 1
CAN 0,429 0,429 0,400 0,858 1
SAN 0,462 0,462 0,429 0,769 0,667 1
CSL 0,500 0,500 0,462 0,833 0,714 0,923 1

3. Kết quả nghiên cứu giống Zhangixalus ở Việt Nam

Luận án ghi nhận 9 loài thuộc giống Zhangixalus tại Việt Nam: Z. dennysi, Z. pachyproctus, Z. feae, Z. duboisi, Z. franki, Z. puerensis, Z. dorsoviridis, Z. jodiae và Zhangixalus sp1. Hai loài mới cho khoa học được nghiên cứu sinh và cộng sự công bố trong khuôn khổ đề tài là Zhangixalus franki và Zhangixalus jodiae. Cây phát sinh chủng loại BI và ML xác nhận tính đơn ngành của giống và phân lập các nhóm loài kích thước lớn (Z. dennysi, Z. pachyproctus, Z. feae), nhóm đốm màu (Z. duboisi, Z. franki, Z. puerensis) và nhóm kích thước nhỏ (Z. dorsoviridis, Z. jodiae).

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

  • Cung cấp cơ sở hình thái học và di truyền học phân tử ty thể để thẩm định hệ thống phân loại giống Rhacophorus sensu lato tại Việt Nam, chứng minh sự tồn tại của hai giống riêng biệt gồm Rhacophorus sensu stricto và Zhangixalus.
  • Giải quyết tranh chấp phân loại và khẳng định Rhacophorus viridimaculatus là tên đồng vật của Rhacophorus orlovi, làm rõ sai sót xác định nhầm giới tính mẫu vật chuẩn trong công bố quốc tế năm 2013.
  • Giữ quan điểm duy trì loài Rhacophorus vampyrus trong giống Rhacophorus, chưa tách sang giống riêng Vampyrius do chưa có đầy đủ dẫn liệu hình thái học đặc trưng để chẩn loại ở cấp giống.
  • Lần đầu tiên cung cấp dẫn liệu chuỗi trình tự ADN ty thể cho các loài Rhacophorus hoanglienensis, R. larissae, R. vanbanicus và Zhangixalus duboisi.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và bảo tồn

  • Phát hiện và mô tả 4 loài mới cho khoa học: Rhacophorus hoabinhensis, Rhacophorus vanbanicus, Zhangixalus franki và Zhangixalus jodiae.
  • Bổ sung ghi nhận mở rộng vùng phân bố địa lý của 7 loài thuộc giống Rhacophorus sensu lato tại các tỉnh phía Bắc và miền Trung - Tây Nguyên.
  • Xây dựng bộ dẫn liệu hình thái chuẩn hóa gồm 34 chỉ tiêu kích thước cho 25 loài thuộc hai giống Rhacophorus và Zhangixalus dựa trên 1.021 mẫu vật thực tế.
  • Đánh giá hiện trạng bảo tồn theo tiêu chuẩn Sách Đỏ Việt Nam (2007) ghi nhận 01 loài ở cấp Nguy cấp (EN) là Rhacophorus kio; theo Danh lục Đỏ IUCN (2021) ghi nhận 03 loài Nguy cấp (EN) gồm Rhacophorus calcaneus, R. marmoridorsum, R. vampyrus và 01 loài Sắp nguy cấp (VU) là Rhacophorus helenae; đối chiếu khung pháp lý quản lý tại Nghị định 06/2019/NĐ-CP và Nghị định 64/2019/NĐ-CP.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Đưa kết quả dẫn liệu phân bố và hiện trạng đe dọa của các loài ếch cây vào chương trình quy hoạch, phân hạng bảo tồn tại các khu rừng đặc dụng (như KBTTN Hang Kia - Pà Cò, VQG Phước Bình, KBTTN Nam Kar).
  • Tiếp tục mở rộng nghiên cứu phân loại đối với các đơn vị phân loại chưa định danh (Rhacophorus sp1, Rhacophorus sp2, Zhangixalus sp1) và phức hợp loài ẩn Rhacophorus rhodopus.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và các nội dung thảo luận trong văn bản luận án, các hạn chế và định hướng tiếp theo bao gồm:

  • Hạn chế về nguồn mẫu: Một số loài có số lượng mẫu thu thập còn rất hạn chế do tính chất hiếm gặp và vùng phân bố hẹp. Điển hình là loài Rhacophorus marmoridorsum chỉ thu thập được mẫu chuẩn tại KBTTN Kon Chư Răng (Gia Lai) và chưa từng được thu thập lại; loài Rhacophorus hoabinhensis chỉ mô tả dựa trên 2 mẫu đực; loài Rhacophorus vanbanicus ban đầu chỉ dựa trên 1 mẫu đực duy nhất.
  • Hạn chế về chỉ thị di truyền: Luận án mới chỉ khai thác các đoạn gen thuộc hệ gen ty thể (12S rRNA, tRNAval, 16S rRNA) với đặc tính di truyền theo dòng mẹ, chưa đối chiếu với hệ gen nhân để kiểm tra các hiện tượng lai tự nhiên hoặc dòng chảy gen.
  • Hạn chế về phân loại phức hợp: Chưa định danh dứt điểm tới cấp loài đối với ba nhóm mẫu vật (Rhacophorus sp1, Rhacophorus sp2, Zhangixalus sp1) và chưa giải quyết trọn vẹn ranh giới loài trong nhóm phức hợp Rhacophorus rhodopus.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Cần thu thập thêm mẫu vật tại các vùng giáp ranh địa lý; bổ sung các chỉ thị phân tử gen nhân (chẳng hạn BDNF, POMC, RAG-1, TYR); kết hợp nghiên cứu đặc điểm tiếng kêu sinh học (bioacoustics), tập tính sinh sản và đặc điểm hình thái giải phẫu của nòng nọc.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Động vật học, Sinh học tiến hóa, Sinh thái học: Luận án là tài liệu tham khảo về phương pháp luận phân loại học tích hợp (kết hợp đo đạc 34 chỉ tiêu hình thái, phân tích đa biến PCA và phân tích phát sinh loài phân tử sử dụng MrBayes và Treefinder). Phần phụ lục đo đếm mẫu vật và bảng trình tự mồi PCR (Bảng 2.3) có thể tái sử dụng trực tiếp trong các nghiên cứu khu hệ lưỡng cư.
  • Đối với các nhà nghiên cứu bảo tồn và quản lý rừng đặc dụng: Dữ liệu phân bố chi tiết theo tọa độ và sinh cảnh tại Chương III cung cấp căn cứ thực địa để giám sát các loài quý hiếm, đặc hữu có nguy cơ tuyệt chủng (R. kio, R. calcaneus, R. vampyrus, R. helenae).
  • Đối với cơ quan hoạch định chính sách bảo tồn đa dạng sinh học: Cung cấp bằng chứng khoa học phục vụ việc cập nhật danh mục loài nguy cấp, quý, hiếm được ưu tiên bảo vệ theo Nghị định 64/2019/NĐ-CP và Sách Đỏ Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Dựa trên những cơ sở nào luận án khẳng định việc phân chia giống Rhacophorus sensu lato tại Việt Nam thành hai giống riêng biệt?

Luận án dựa trên hai hệ thống chứng cứ độc lập có độ tương đồng cao:

  • Về hình thái: Nhóm Zhangixalus không có riềm da ở mép ngoài cánh tay và ngón tay IV, gót chân không có cựa da nhọn hoặc nếp da, vùng lỗ huyệt nhẵn. Ngược lại, nhóm Rhacophorus sensu stricto có riềm da ở cánh tay và ngón chân IV, gót chân có cựa da nhọn hoặc nếp da chữ nhật, vùng lỗ huyệt có riềm da hoặc gai thịt.
  • Về di truyền phân tử: Chuỗi gen ty thể (12S rRNA, tRNAval, 16S rRNA) phân lập hai nhánh tách biệt với xác suất hậu nghiệm BI đạt 0,99 - 1,00, khoảng cách di truyền giữa hai giống dao động từ 8,56% đến 17,35%.

2. Những loài mới nào cho khoa học đã được tác giả và nhóm nghiên cứu mô tả trong luận án?

Luận án ghi nhận 4 loài mới cho khoa học do nghiên cứu sinh và cộng sự phát hiện, mô tả:

  • Rhacophorus hoabinhensis Nguyen et al., 2017 (thu tại Hòa Bình).
  • Rhacophorus vanbanicus Kropachev et al., 2019 (thu tại Lào Cai, Hà Giang, Tuyên Quang).
  • Zhangixalus franki Ninh et al., 2020.
  • Zhangixalus jodiae Nguyen et al., 2020.

3. Vì sao luận án kết luận Rhacophorus viridimaculatus là tên đồng vật của Rhacophorus orlovi?

Qua phân tích di truyền phân tử, khoảng cách di truyền giữa các quần thể của R. viridimaculatus và R. orlovi chỉ từ 0,00% đến 0,33%, nằm trong biến thiên nội loài. Về hình thái, khi nghiên cứu sinh kiểm tra trực tiếp mẫu chuẩn (ZISP 11471) và đồng chuẩn (ZISP 11474) của R. viridimaculatus, tác giả phát hiện hai mẫu này là cá thể cái chứ không phải cá thể đực như công bố gốc của Ostroshabov và cộng sự (2013). Các sai khác về kích thước và màu sắc trước đây thực chất chỉ là sai khác do dị hình giới tính và biến thiên cá thể của loài Rhacophorus orlovi.

4. Phân vùng địa lý sinh vật nào ở Việt Nam có số lượng loài giống Rhacophorus sensu stricto cao nhất và mức độ tương đồng giữa các vùng ra sao?

Phân vùng núi cao Trung Trường Sơn (CAN) có mức độ đa dạng cao nhất với 8 loài ghi nhận trong tổng số 16 loài và nhóm loài. Phân vùng đồng bằng sông Cửu Long (MEK) không ghi nhận loài nào. Mức độ tương đồng thành phần loài (chỉ số Sorensen-Dice) cao nhất đạt 0,923 giữa hai cặp phân vùng: Đông Bắc (NEU) – Đồng bằng Bắc Bộ (NEL) và Nam Trường Sơn (SAN) – Đồng bằng Nam Trung Bộ (CSL).

5. Dữ liệu thực nghiệm của luận án được xây dựng từ quy mô mẫu vật và những chỉ thị phân tử nào?

Luận án đã phân tích hình thái trên 1.021 mẫu vật (938 mẫu trưởng thành, 66 mẫu chưa trưởng thành, 17 mẫu nòng nọc) thu thập từ 5 bảo tàng và các đợt thực địa. Về di truyền học, luận án tiến hành giải trình tự ADN của 173 mẫu vật (170 mẫu thu tại Việt Nam, 3 mẫu R. spelaeus từ Lào) kết hợp 77 trình tự tham chiếu trên GenBank, tập trung vào 3 đoạn gen ty thể gồm 12S rRNA, tRNAval và 16S rRNA.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Ninh Thị Hòa là công trình nghiên cứu hệ thống học toàn diện về giống Rhacophorus sensu lato ở Việt Nam thông qua tiếp cận phân loại học tích hợp. Dựa trên 1.021 mẫu vật hình thái và 173 trình tự gen ty thể, luận án đã xác nhận việc phân chia giống thành Rhacophorus sensu stricto (16 đơn vị loài) và Zhangixalus (9 loài), đồng thời mô tả 4 loài mới cho khoa học và ghi nhận phân bố mới cho 7 loài. Công trình đã tu chỉnh thành công tên đồng vật của Rhacophorus viridimaculatus vào Rhacophorus orlovi, cung cấp bộ số liệu đo đạc 34 chỉ tiêu hình thái và bản đồ phân bố theo 8 phân vùng địa lý sinh vật. Kết quả đạt được là cơ sở khoa học phục vụ công tác quy hoạch, đánh giá hiện trạng và bảo tồn các loài lưỡng cư nguy cấp, đặc hữu tại Việt Nam.