Nghiên cứu những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phân lập vi khuẩn kị khí và đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng phân lập được tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức (2015 – 2021)

Luận án tiến sĩ: Phân lập vi khuẩn kị khí và kháng kháng sinh tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức (2015-2021)

• Tác giả: Nguyễn Thị Vân
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thái Sơn
• Trường học: Học viện Quân y
• Chuyên ngành: Khoa học y sinh
• Đề tài: Nghiên cứu những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phân lập vi khuẩn kị khí và đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng phân lập được tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức (2015 – 2021)
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về vi khuẩn kị khí và thực trạng phân lập lâm sàng

Vi khuẩn kị khí là nhóm vi sinh vật chỉ sinh trưởng trong điều kiện không có oxy. Chúng tồn tại tự nhiên trong hệ vi sinh đường tiêu hóa, hô hấp và niêm mạc sinh dục người. Khi hàng rào giải phẫu tổn thương, chúng xâm nhập các mô sâu. Quá trình này gây nhiễm trùng hoại tử, áp xe nội tạng và nhiễm khuẩn huyết đe dọa tính mạng. Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức tiếp nhận nhiều ca bệnh ngoại khoa phức tạp và chấn thương nặng. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn kị khí tại đây chiếm tỷ trọng đáng kể trong các ca nhiễm trùng ổ bụng và vết thương hở. Việc phân lập nhóm căn nguyên này đòi hỏi quy trình nghiêm ngặt từ khâu thu thập mẫu đến nuôi cấy. Môi trường hiếu khí thông thường sẽ tiêu diệt vi khuẩn kị khí trong thời gian ngắn. Nhiều cơ sở y tế gặp khó khăn trong việc duy trì chuỗi kiểm soát kị khí liên tục. Vì vậy, việc thiết lập dữ liệu nghiên cứu về căn nguyên kị khí đóng vai trò thiết yếu. Dữ liệu này giúp chuyên gia hiểu rõ mô hình bệnh tật và cải thiện tỷ lệ điều trị thành công.

1.1. Đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của vi khuẩn kị khí

Vi khuẩn kị khí thiếu enzym catalase và superoxide dismutase hoàn chỉnh. Do đó, chúng không thể chuyển hóa các gốc tự do của oxy sinh ra trong quá trình trao đổi chất. Tiếp xúc với không khí làm tế bào vi khuẩn bị phá hủy nhanh chóng. Nhóm vi khuẩn này tiết ra nhiều độc tố tế bào, enzym phân giải collagen và hemolysin. Những yếu tố độc lực này phá vỡ cấu trúc mô mềm và cản trở tưới máu tại chỗ. Tình trạng hoại tử lan rộng nhanh chóng tạo điều kiện lý tưởng cho vi khuẩn nhân lên. Nhiễm trùng kị khí thường phối hợp nhiều chủng vi khuẩn hiếu khí và kị khí khác nhau. Sự tương tác này làm gia tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh cảnh lâm sàng.

1.2. Các loài vi khuẩn kị khí thường gặp trong ngoại khoa

Nghiên cứu lâm sàng ghi nhận nhiều loài vi khuẩn kị khí gây bệnh phổ biến. Trực khuẩn Gram âm kị khí nhóm Bacteroides fragilis chiếm vị trí hàng đầu trong nhiễm trùng ổ bụng. Loài này có vỏ polysaccharide dày giúp ức chế bạch cầu thực bào. Trực khuẩn Prevotella và Porphyromonas thường xuất hiện tại các ổ nhiễm trùng vùng đầu mặt cổ và đường hô hấp. Fusobacterium necrophorum gây hội chứng Lemierre đặc trưng bởi huyết khối tĩnh mạch nhiễm khuẩn và áp xe phổi thứ phát. Bên cạnh đó, các trực khuẩn Gram dương kị khí như Clostridium perfringens gây hoại thư sinh hơi nguy hiểm. Cầu khuẩn Gram dương Peptostreptococcus cũng thường xuyên hiện diện trong các vết thương hở sâu.

II. Thách thức phân lập vi khuẩn kị khí và nguy cơ kháng kháng sinh

Việc chẩn đoán nhiễm trùng kị khí gặp nhiều trở ngại kỹ thuật phức tạp. Vi khuẩn kị khí rất nhạy cảm với oxy tự do trong không khí. Quá trình lấy mẫu sai kỹ thuật làm vi khuẩn chết trước khi đến phòng xét nghiệm. Thời gian vận chuyển kéo dài khiến tỷ lệ nuôi cấy dương tính giảm sút nghiêm trọng. Dụng cụ thu thập không đạt chuẩn kị khí làm sai lệch kết quả vi sinh. Song song với thách thức nuôi cấy, tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn kị khí gia tăng rõ rệt. Nhóm Bacteroides fragilis bộc lộ khả năng đề kháng mạnh với nhiều nhóm thuốc phổ biến. Sự gia tăng tỷ lệ sinh beta-lactamase làm mất tác dụng của các penicillin tự nhiên. Một số chủng vi khuẩn kị khí thậm chí giảm nhạy cảm với carbapenem và metronidazol. Hiện tượng đa kháng thuốc hạn chế nghiêm trọng các lựa chọn điều trị ngoại khoa. Bác sĩ lâm sàng thường phải điều trị theo kinh nghiệm ban đầu mà không có kháng sinh đồ hỗ trợ. Thói quen sử dụng kháng sinh phổ rộng kéo dài càng đẩy nhanh áp lực chọn lọc kháng thuốc.

2.1. Yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ phân lập vi khuẩn kị khí

Ba yếu tố then chốt quyết định tỷ lệ phân lập thành công gồm lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển. Mẫu bệnh phẩm phải được hút trực tiếp từ ổ mủ sâu bằng bơm tiêm vô trùng. Việc dùng tăm bông quệt bề mặt làm mẫu nhiễm tạp khuẩn hiếu khí và tiếp xúc oxy. Mẫu cần được bơm ngay vào lọ vận chuyển yếm khí chuyên dụng. Thời gian chuyển giao bệnh phẩm về phòng xét nghiệm tối ưu là dưới hai giờ. Sự chậm trễ làm giảm mạnh khả năng sống sót của các chủng kị khí nghiêm ngặt. Ngoài ra, việc người bệnh đã dùng kháng sinh trước khi lấy mẫu cũng gây ức chế vi khuẩn mọc.

2.2. Cơ chế và diễn biến kháng kháng sinh của vi khuẩn kị khí

Vi khuẩn kị khí phát triển đa dạng cơ chế kháng thuốc sinh học. Cơ chế phổ biến nhất là sản sinh enzym beta-lactamase phá hủy vòng beta-lactam. Gen cepA và cfxA mã hóa cephalosporinase xuất hiện rộng rãi ở các chủng Bacteroides. Đối với nhóm carbapenem, sự xuất hiện của gen cfiA thủy phân metallo-beta-lactamase tạo nên mối đe dọa lâm sàng lớn. Kháng lincosamid như clindamycin liên quan đến đột biến gen erm làm thay đổi thụ thể ribosom 23S. Kháng metronidazol xuất hiện thông qua đột biến các gen nim làm suy giảm khả năng khử hoạt tính thuốc. Đáng lưu ý, các plasmid kháng thuốc có thể truyền ngang giữa các chủng vi khuẩn kị khí trong quần thể.

III. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí và kỹ thuật kháng sinh đồ

Nâng cao tỷ lệ phân lập vi khuẩn kị khí đòi hỏi chuẩn hóa đồng bộ quy trình xét nghiệm. Môi trường nuôi cấy chuyên biệt đóng vai trò sống còn. Thạch Schaedler, thạch Brucella bổ sung hemin và vitamin K1 cung cấp đầy đủ dưỡng chất cho khuẩn mọc. Kỹ thuật tạo khí trường kị khí cần được lựa chọn dựa trên điều kiện thực tế phòng xét nghiệm. Bốn phương pháp thông dụng gồm bình yếm khí dùng gói sinh khí, túi ủ cá nhân, tủ nuôi cấy yếm khí và hệ thống hút chân không thay thế khí. Việc so sánh đánh giá hiệu quả giữa các phương pháp giúp tối ưu hóa chi phí và hiệu suất. Sau khi phân lập, kỹ thuật định danh loài hiện đại bằng khối phổ MALDI-TOF rút ngắn thời gian trả kết quả xuống chỉ vài phút. Thử nghiệm kháng sinh đồ phải tuân thủ nghiêm ngặt chuẩn mực CLSI hoặc EUCAST. Phương pháp pha loãng trong thạch hoặc dải thử nghiệm gradient E-test cho giá trị MIC chính xác. Quy trình chuẩn hóa này hỗ trợ bác sĩ lâm sàng lựa chọn phác đồ đích kịp thời.

3.1. Các kỹ thuật tạo khí trường kị khí trong phòng xét nghiệm

Hệ thống khí trường kị khí loại bỏ oxy và duy trì nồng độ CO2 từ 5 đến 10 phần trăm. Phương pháp sử dụng bình kị khí kết hợp gói hóa chất tạo khí được ứng dụng phổ biến nhờ tính tiện lợi. Gói hóa chất hấp thụ oxy và giải phóng hydro cùng carbon dioxide nhanh chóng. Tủ cấy yếm khí kín dạng găng tay là giải pháp toàn diện cho các đơn vị xét nghiệm chuyên sâu. Kỹ thuật viên thao tác mẫu trực tiếp trong môi trường không oxy từ đầu đến cuối. Phương pháp hút chân không và bơm bù khí hỗn hợp cung cấp giải pháp tiết kiệm cho khối lượng mẫu lớn. Mỗi phương pháp có ưu thế riêng về chi phí, tốc độ và độ ổn định.

3.2. Tiêu chuẩn thực hiện kháng sinh đồ vi khuẩn kị khí

Kháng sinh đồ cho vi khuẩn kị khí yêu cầu tuân thủ nghiêm ngặt các khuyến nghị quốc tế. Phương pháp khuếch tán đĩa giấy không được khuyến cáo do kết quả thiếu tin cậy và khó lặp lại. Kỹ thuật pha loãng trong thạch Brucella bổ sung máu cừu được coi là tiêu chuẩn vàng tham chiếu. Kỹ thuật E-test cung cấp giải pháp thay thế tin cậy và thuận tiện cho thực hành thường quy. Dải E-test chứa gradient nồng độ kháng sinh xác định trực tiếp nồng độ ức chế tối thiểu MIC. Các kháng sinh cần thử nghiệm ưu tiên bao gồm metronidazol, piperacillin-tazobactam, meropenem và clindamycin. Kết quả thử nghiệm giúp điều chỉnh phác đồ kháng sinh từ phổ rộng sang điều trị đích chính xác.

IV. Ý nghĩa lâm sàng từ phân lập vi khuẩn kị khí tại Việt Đức

Kết quả nghiên cứu giai đoạn 2015-2021 tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức mang giá trị thực tiễn to lớn. Dữ liệu dịch tễ học làm sáng tỏ cơ cấu loài và mô hình kháng thuốc của vi khuẩn kị khí ngoại khoa. Thông tin này hỗ trợ hội đồng thuốc bệnh viện xây dựng hướng dẫn sử dụng kháng sinh sát với thực tế. Bác sĩ lâm sàng chủ động hơn trong phối hợp phác đồ điều trị ban đầu cho các ca nhiễm trùng ổ bụng và chấn thương mô mềm. Việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn kị khí đa kháng giúp kiểm soát nguy cơ nhiễm khuẩn chéo trong bệnh viện. Đồng thời, nghiên cứu đề xuất các điều kiện tối thiểu để triển khai nuôi cấy kị khí thường quy tại các phòng xét nghiệm tuyến tỉnh. Chuẩn hóa quy trình vận chuyển bệnh phẩm và kiểm soát chất lượng khí trường mở ra hướng đi mới. Các cơ sở y tế có thể học hỏi mô hình để nâng cao năng lực chẩn đoán vi sinh lâm sàng. Việc này góp phần giảm thiểu tỷ lệ thất bại điều trị và giảm gánh nặng chi phí y tế cho cộng đồng.

4.1. Ứng dụng kết quả trong quản lý kháng sinh bệnh viện

Dữ liệu giám sát vi sinh là căn cứ trực tiếp để thiết lập chương trình quản lý kháng sinh. Việc xác định tỷ lệ kháng của Bacteroides fragilis với clindamycin và cephalosporin giúp giới hạn việc lạm dụng các nhóm này. Bác sĩ lâm sàng ưu tiên lựa chọn carbapenem hoặc kháng sinh kết hợp chất ức chế beta-lactamase cho các ca nhiễm trùng kị khí nặng. Quy trình này nâng cao hiệu quả điều trị trúng đích ngay từ giai đoạn đầu. Phác đồ hợp lý giúp rút ngắn thời gian nằm viện của bệnh nhân phẫu thuật. Quản lý kháng sinh khoa học cũng giảm thiểu chi phí điều trị và hạn chế phát sinh biến chủng kháng thuốc nguy hiểm.

4.2. Khuyến cáo triển khai kỹ thuật tại các phòng xét nghiệm

Nghiên cứu đưa ra giải pháp từng bước để triển khai nuôi cấy kị khí tại các cơ sở xét nghiệm. Trước hết, nhân viên y tế cần được tập huấn kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển không oxy. Các bệnh viện nên đầu tư bộ dụng cụ vận chuyển kị khí đạt tiêu chuẩn. Trong điều kiện nguồn lực hạn chế, hệ thống bình kị khí kết hợp gói sinh khí là lựa chọn khả thi nhất. Phòng xét nghiệm cần xây dựng quy trình kiểm chuẩn khí trường định kỳ bằng chỉ thị màu hóa học. Việc hợp tác với các bệnh viện tuyến trên giúp đào tạo kỹ năng đọc hình thái khuẩn lạc kị khí. Từng bước hoàn thiện kỹ thuật sẽ giúp giảm thiểu tình trạng bỏ sót căn nguyên kị khí trên lâm sàng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phân lập vi khuẩn kị khí và đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng phân lập được tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức (2015 – 2021)" do nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Vân thực hiện, chuyên ngành Khoa học y sinh (mã số: 9720101) tại Học viện Quân y, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Thái Sơn và cố PGS. Kiều Chí Thành, bảo vệ năm 2023.

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, tác giả chỉ ra rằng vi khuẩn kị khí là một trong những căn nguyên gây nhiễm khuẩn quan trọng ở nhiều cơ quan trên cơ thể người như áp xe não, gan, phổi, lách, thận, cơ quan sinh dục, mô mềm và nhiễm khuẩn huyết. Trên lâm sàng, nhiễm trùng do vi khuẩn kị khí hiếm khi xảy ra đơn độc mà thường ở dạng nhiễm khuẩn hỗn hợp với vi khuẩn ái khí. Vi khuẩn kị khí chiếm ưu thế nổi bật trong hệ vi khuẩn chí bình thường (đặc biệt tại khoang miệng và đại tràng, với tỉ lệ vi khuẩn kị khí trên vi khuẩn ái khí tại đại tràng lên tới 1000/1). Trong chẩn đoán, nuôi cấy vi khuẩn kị khí vẫn là tiêu chuẩn vàng. Tuy nhiên, kỹ thuật này phức tạp, tốn kém, đòi hỏi trang thiết bị chuyên biệt và kinh nghiệm thực hành. Tại Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy, phân lập, định danh và thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn kị khí chưa trở thành quy trình thường quy tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng, dẫn đến nguy cơ bỏ sót căn nguyên bệnh. Trước nghiên cứu này, y văn trong nước và quốc tế chưa có công trình nào đánh giá toàn diện các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phân lập vi khuẩn kị khí đồng thời so sánh hiệu quả của 4 phương pháp tạo khí trường kị khí hiện có tại Việt Nam.

Luận án xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phân lập vi khuẩn kị khí tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức (2015-2021).
2. Xác định đặc điểm phân bố và mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn kị khí phân lập được tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức (2015-2021).

Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm các mẫu bệnh phẩm mủ và dịch được thu thập trong phẫu thuật hoặc thủ thuật từ các vị trí nhiễm trùng ở bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức, cùng 167 chủng vi khuẩn kị khí phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm này.

Phạm vi nghiên cứu được xác định cụ thể:

• Phạm vi không gian: Khoa Vi sinh phối hợp cùng các khoa lâm sàng tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức.
• Phạm vi thời gian: Thu thập dữ liệu thực nghiệm và phân lập vi khuẩn liên tục trong giai đoạn từ năm 2015 đến năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong chương tổng quan tài liệu, tác giả đã điểm lại hệ thống nghiên cứu quốc tế và trong nước về dịch tễ, sinh bệnh học và vi sinh học kị khí:

Về tỉ lệ nhiễm khuẩn và phân bố bệnh sinh, tác giả dẫn số liệu của Sutter V. (1980) cho thấy vi khuẩn kị khí hiện diện với tỉ lệ cao ở nhiều dạng nhiễm trùng: áp xe não (89%), nhiễm trùng vùng cổ (100%), nhiễm trùng răng miệng (86-100%), dịch ổ bụng (81-94%), viêm ruột thừa (92%), nhiễm trùng bàn chân đái tháo đường (95%), áp xe túi mật (88%) và áp xe âm đạo (75%). Tỉ lệ vi khuẩn kị khí trong hệ vi sinh cơ thể người được trích dẫn theo John E., thể hiện sự chênh lệch lớn giữa các cơ quan:

Vị trí cơ thể	Số lượng vi khuẩn kị khí trong 01 mg chất tiết	Tỉ lệ vi khuẩn kị khí / vi khuẩn ái khí
Mũi (nước rửa mũi)	10^3 - 10^4	3 - 5 / 1
Nước bọt	10^8 - 10^9	1 / 1
Nếp lợi răng	10^11 - 10^12	1000 / 1
Mặt răng	10^8 - 10^9	1 / 1
Dạ dày	10^2 - 10^5	1 / 1
Ruột non	10^2 - 10^4	1 / 1
Đại tràng	10^11 - 10^12	1000 / 1
Cổ tử cung	10^8 - 10^9	1 / 1
Âm đạo	10^8 - 10^10	3 - 5 / 1

Về yếu tố độc lực, tác giả điểm lại công trình của Yi-Wei T. và cộng sự (2015) về vai trò của vỏ polysaccharide (Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogenica), fimbriae, lipopolysaccharide (Fusobacterium spp.), enzyme succinic acid, hyaluronidase và collagenase trong bám dính, ức chế thực bào và hủy hoại mô; cùng cảnh báo của Mehrdad M. về liên quan giữa độc tố vi khuẩn kị khí và ung thư đại trực tràng.

Về dịch tễ nhiễm trùng theo vùng giải phẫu: Saied A. và cộng sự ghi nhận 17% vi khuẩn kị khí ở vết thương; Lê Thị Thiều Hoa công bố tỉ lệ nhiễm trùng cơ xương và mô mềm do vi khuẩn kị khí là 26,7%; Seneviratne R. và cộng sự phân lập được 23,0% vi khuẩn kị khí từ 41 bệnh nhân áp xe não; Cobo F. trên 300 bệnh nhân áp xe não ghi nhận 12,9% nhiễm kị khí đơn độc và 51,65% nhiễm hỗn hợp; Tabata M. phát hiện 20,7% mẫu nhiễm kị khí ở sỏi mật; nghiên cứu tại Cao Hùng (Đài Loan) ghi nhận 44,4% mẫu nhiễm trùng đường mật dương tính kị khí (Bacteroides spp. và Clostridium spp. chiếm ưu thế). Tác giả cũng tổng hợp báo cáo về nhiễm khuẩn huyết giai đoạn 1993–2004 cho thấy số ca nhiễm kị khí tăng 74%.

Về tình hình kháng kháng sinh: Công trình điểm lại các khảo sát tại Hoa Kỳ, Canada, Argentina, Kuwait, Đài Loan và châu Âu. Finegold và cộng sự (2009) đánh giá hiệu lực của ampicillin/sulbactam và nitazoxanide trên Clostridium. Nina H. và cộng sự ghi nhận Bacteroides spp. kháng penicillin tới 99,2% và kháng clindamycin 18%. Hammond J. M. báo cáo tỉ lệ kháng của vi khuẩn kị khí với penicillin là 21%, metronidazole là 12%, clindamycin là 5%. Kirtilaxmi K. nghiên cứu về khả năng nhận gen sinh beta-lactamase của B. fragilis. Melo J. và cộng sự (1980) cùng Suata K. (1993) ghi nhận tỉ lệ đề kháng metronidazole của nhóm B. fragilis ở mức rất thấp (<= 0,6%). Goldstein và cộng sự (2008) chỉ ra thực trạng tại Hoa Kỳ khi chỉ có 21% phòng xét nghiệm bệnh viện thực hiện kháng sinh đồ kị khí và 60% hoàn toàn không thực hiện.

Về quy trình và kỹ thuật: Tác giả điểm lại nghiên cứu của Watt B. (1972), Dowell (1974), Wren M., Demuyser T. (2018), Daichi F. về thời gian ủ sơ cấp kéo dài và dụng cụ vận chuyển; Vũ Thị Thu Hường và Đặng Thị Thùy Dương sử dụng túi Genbag cấy Clostridium; Jean C. và cộng sự đánh giá tủ nuôi cấy kị khí là phương pháp tối ưu so với các phương pháp khác.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: Thiếu hụt bằng chứng thực nghiệm so sánh trực diện 4 phương pháp tạo khí trường kị khí trong cùng điều kiện lâm sàng; chưa có đánh giá đa yếu tố (loại bệnh phẩm, thể tích, khối lượng, môi trường vận chuyển, thời gian vận chuyển, thời gian ủ) ảnh hưởng đến tỉ lệ phân lập; và thiếu dữ liệu vi pha loãng xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn kị khí tại bệnh viện ngoại khoa ở Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên đặc tính sinh lý học của vi khuẩn kị khí. Vi khuẩn kị khí được chia thành 3 nhóm dựa trên mức độ nhạy cảm với oxy:

• Vi khuẩn kị khí tuyệt đối (obligate anaerobes): không sử dụng oxy cho sinh trưởng, năng lượng thu từ phản ứng khử nitrat hoặc sulfat; không mọc trên thạch nếu nồng độ oxy > 0,5% và chết sau 10 phút tiếp xúc không khí. Nhóm này thiếu hệ thống cytochrome chuyển hóa oxy, có hàm lượng superoxide dismutase (SOD) rất thấp và thiếu enzyme catalase. Hai enzyme này xúc tác phản ứng giải độc gốc oxy tự do: $$2\text{O}_2^- + 2\text{H}^+ \xrightarrow{\text{SOD}} \text{H}_2\text{O}_2 + \text{O}_2$$ $$2\text{H}_2\text{O}_2 \xrightarrow{\text{Catalase}} 2\text{H}_2\text{O} + \text{O}_2$$
• Vi khuẩn kị khí chịu oxy (aerotolerant): phát triển được trong khí trường có 5% oxy, tồn tại ở nồng độ oxy từ 2-8% (Actinomyces spp., Bifidobacterium spp.).
• Vi khuẩn hiếu kị khí tùy ngộ (facultative): phát triển cả trong điều kiện ái khí và kị khí (Enterobacteriaceae, Streptococcus spp.).

Cơ chế bệnh sinh gắn liền với hiệu thế oxy hóa khử (Eh). Tổ chức lành ở người có Eh khoảng +120 mV. Khi xảy ra ứ trệ tuần hoàn, thiếu máu hoặc hoại tử mô, Eh và phân áp oxy suy giảm, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn kị khí phát triển và tiết độc lực gây hoại tử, áp xe.

Yếu tố độc lực	Vi khuẩn kị khí mang yếu tố	Hoạt tính bệnh sinh
Capsular polysaccharide	Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogenica	Bám dính tế bào, hình thành ổ áp xe, ức chế thực bào
Fimbriae	Bacteroides fragilis, Porphyromonas gingivalis	Bám dính tế bào và niêm mạc
Lipopolysaccharide	Bacteroides spp., Fusobacterium spp.	Độc lực yếu (Bacteroides), nội độc tố tiềm tàng (Fusobacterium)
Succinic acid enzymes	Nhiều chi vi khuẩn kị khí	Ức chế thực bào và tiêu diệt nội bào
Hyaluronidase	Bacteroides spp.	Lan truyền trong tổ chức mô
Collagenase	Bacteroides spp., Prevotella melaninogenica	Gây tổn thương mô và màng tế bào

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng:

• Tiêu chuẩn thu thập: Mẫu mủ và dịch được hút bằng bơm kim tiêm vô trùng trong phẫu thuật hoặc thủ thuật; tổ chức mô hoại tử và mảnh sinh thiết.
• Khối lượng và thể tích: Ghi nhận thể tích mẫu dịch, khối lượng mô và phân loại vận chuyển qua môi trường chuyên biệt hoặc không có môi trường.
• Thời gian vận chuyển: Phân loại theo các mốc thời gian (<30 phút, 2 giờ, đến 24 giờ).
• Đánh giá 4 phương pháp tạo khí trường kị khí:
  1. Phương pháp 1 (Phản ứng hóa học): Tạo khí H2 bằng H2SO4 phản ứng với kẽm, khí CO2 từ bicarbonat và nước trong bình Jar kín, xúc tác chuyển hóa O2 tồn dư; thành phần khí đạt 5-10% CO2, 5-10% H2, 80% N2, kiểm tra bằng chỉ thị màu xanh methylene chuyển sang trắng.
  2. Phương pháp 2 (Túi Genbag): Sử dụng túi plastic kín kết hợp gói hóa chất đóng sẵn tự giải phóng 5-10% H2, 5-10% CO2, 80% N2 không cần thêm nước.
  3. Phương pháp 3 (Hệ thống ANOXOMAT): Bình Jar có van một chiều kết nối hệ thống máy ANOXOMAT, vận hành chu trình tự động rút không khí và bù hỗn hợp khí trộn gồm 10% H2, 10% CO2, 80% N2.
  4. Phương pháp 4 (Tủ Whitley anaerobic Workstations): Tủ ấm thao tác kín tích hợp găng tay và buồng chuyển mẫu, kiểm soát nồng độ khí 10% H2, 10% CO2, 80% N2 bằng cảm biến điện tử và bổ sung xúc tác định kỳ hàng tuần.
• Phân lập và định danh: Đĩa thạch Columbia bổ sung máu cừu, hemin và vitamin K; ủ ấm ở 37°C. Sau 48 giờ, kiểm tra hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram và cấy song song đĩa thạch máu trong điều kiện ái khí (có CO2) và đĩa Columbia kị khí để phân biệt vi khuẩn kị khí tuyệt đối với vi khuẩn hiếu kị khí tùy ngộ. Nếu chưa mọc, tiếp tục ủ và theo dõi ở 4 ngày, 6 ngày hoặc 5-7 ngày trước khi kết luận âm tính. Định danh bằng bộ kít sinh hóa ID 32A kết hợp khoanh giấy kháng sinh Vancomycin (VA) và Colistin (CT).
• Kỹ thuật kháng sinh đồ: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng kỹ thuật vi pha loãng (khay MICRONAUT-Wilkins-Chalgren chứa kháng sinh đông khô 8 dải nồng độ) và đối chiếu với phương pháp Etest trên 8 kháng sinh: amoxicillin/clavulanate, piperacillin/tazobactam (hoặc piperacillin đối với Clostridium spp.), metronidazole, imipenem, meropenem, ertapenem, moxifloxacin, clindamycin theo chuẩn CLSI.
• Xử lý số liệu: Sử dụng các chỉ số tần số (P), tỉ suất chênh (Odds Ratio - OR), khoảng tin cậy 95% (95% CI) và kiểm định thống kê p-value. Nghiên cứu tuân thủ đầy đủ các nguyên tắc đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết cơ sở lý thuyết về phân loại vi khuẩn kị khí theo mức độ nhạy cảm oxy, cơ chế phân giải độc tính oxy qua enzyme SOD và catalase, cùng nguyên lý thế oxy hóa khử Eh (+120 mV). Tác giả mô tả chi tiết các nhóm vi khuẩn kị khí gây bệnh thường gặp:

• Trực khuẩn Gram dương sinh nha bào: Chi Clostridium (>200 loài), nhấn mạnh các loài C. tetani (uốn ván, độc tố thần kinh), C. botulinum (ngộ độc thức ăn, 7 type độc tố A-G), Clostridioides difficile (viêm đại tràng màng giả, enterotoxin A và cytotoxin B), C. perfringens (hoại thư sinh hơi, vòng tan huyết kép, 5 type độc tố A-E), C. novyi, C. septicum (liên quan hoại tử mô ở bệnh nhân ung thư) và C. histolyticum.
• Trực khuẩn Gram âm không sinh nha bào (Bacteroidaceae chiếm 40-50% căn nguyên kị khí): Chi Bacteroides (nhóm B. fragilis chiếm 70%, kháng mật 10-20% và aminoglycoside; nhóm B. asaccharolyticus gồm B. pneumosintes, B. ureolyticus, B. putredinis); Chi Prevotella (loài sinh sắc tố đen như P. melaninogenica, P. corcopis và loài không sinh sắc tố như P. bivia, P. disiens, P. buccae); Chi Porphyromonas (P. gingivalis, P. endodontalis, P. asaccharolytica); Chi Fusobacterium (F. necrophorum gây hội chứng Lemierre, F. nucleatum); Chi Mobiluncus.
• Cầu khuẩn kị khí: Họ Veillonellaceae (Gram âm: Veillonella, Acidaminococcus, Megasphaera); Họ Peptococcaceae (Gram dương: Peptococcus niger sinh sắc tố đen, Peptostreptococcus magnus, Peptostreptococcus micros).
• Trực khuẩn Gram dương không sinh nha bào: Actinomyces (A. israelii, A. gerencseriae), Propionibacterium acnes, Lactobacillus.

Chương 1 cũng phân tích các yếu tố kỹ thuật tác động đến quy trình nuôi cấy gồm kỹ thuật thu thập, thời gian vận chuyển (tối ưu trong 30 phút, trì hoãn tối đa 2 giờ đối với bệnh phẩm lớn hoặc 24 giờ khi có môi trường chuyên biệt), nguyên lý của 4 phương pháp tạo khí trường (hóa học, Genbag, ANOXOMAT, tủ Whitley), vai trò của môi trường bổ sung hemin và vitamin K, thời gian ủ 48 giờ đến 5-7 ngày; đồng thời tổng quan tình hình kháng thuốc và hai kỹ thuật thử nghiệm kháng sinh đồ (Etest và vi pha loãng).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này xác lập quy trình thực nghiệm tại Khoa Vi sinh Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức từ 2015 đến 2021:

• Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh phẩm mủ và dịch thu thập trong phẫu thuật hoặc thủ thuật của các bệnh lý nhiễm trùng (áp xe não, áp xe gan, nhiễm khuẩn đường mật, viêm phúc mạc, áp xe phần mềm...). Mẫu được lấy bằng bơm tiêm hoặc chuyển vào lọ vô trùng chuyên dụng.
• Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh phẩm lấy bằng tăm bông không đúng quy cách, bệnh phẩm để hở ngoài không khí quá thời gian quy định, hoặc mẫu nhiễm tạp chất.
• Thiết kế thực nghiệm: Thực hiện nuôi cấy song song các mẫu bệnh phẩm trên 4 hệ thống tạo khí trường kị khí (Phương pháp 1: Phản ứng hóa học; Phương pháp 2: Túi Genbag; Phương pháp 3: ANOXOMAT; Phương pháp 4: Tủ Whitley anaerobic Workstations).
• Quy trình phân lập và định danh: Đĩa thạch Columbia bổ sung máu cừu, hemin và vitamin K được theo dõi ở các mốc 48 giờ, 4 ngày, 6 ngày. Kiểm định tính kị khí tuyệt đối qua cấy chuyển song song trên đĩa thạch máu ái khí (có CO2) và đĩa Columbia kị khí. Định danh loài dựa trên hình thái nhuộm Gram, thử nghiệm tính nhạy cảm với khoanh giấy kháng sinh VA, CT và kít định danh ID 32A.
• Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh: Kỹ thuật vi pha loãng trên khay MICRONAUT-Wilkins-Chalgren và Etest xác định MIC của 8 loại kháng sinh trên 167 chủng phân lập được, phiên giải kết quả theo tiêu chuẩn CLSI. Phân tích số liệu thống kê y sinh học sử dụng tần số, tỉ lệ %, tỉ suất chênh OR, khoảng tin cậy 95% CI và kiểm định ý nghĩa thống kê p.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm qua 55 bảng và 9 biểu đồ:

• Đặc điểm người bệnh: Phân bố nhóm tuổi (Bảng 3.7) và giới tính (Biểu đồ 3.1) của bệnh nhân được thu thập bệnh phẩm.
• Tỉ lệ phân lập và các yếu tố ảnh hưởng:
  • Tỉ lệ mẫu dương tính kị khí và ái khí (Bảng 3.9; Biểu đồ 3.2, 3.3).
  • Tỉ lệ phân bố mẫu dương tính theo từng loại bệnh phẩm lâm sàng (Bảng 3.8, 3.10) và phân tích ảnh hưởng của loại bệnh phẩm đến khả năng dương tính (Bảng 3.11).
  • Ảnh hưởng của thể tích mẫu bệnh phẩm dịch/mủ đến khả năng phát hiện vi khuẩn kị khí (Bảng 3.12).
  • Ảnh hưởng kết hợp giữa môi trường vận chuyển và khối lượng mẫu bệnh phẩm (Bảng 3.13).
  • Tác động của thời gian vận chuyển mẫu từ lúc thu thập đến phòng xét nghiệm đối với tỉ lệ mọc vi khuẩn (Bảng 3.14, 3.15).
  • Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu (48 giờ, 4 ngày, 6 ngày) đến khả năng phát hiện vi khuẩn kị khí qua từng phương pháp tạo khí (Bảng 3.16).
• So sánh đối đầu 4 phương pháp tạo khí trường kị khí:
  • Tỉ lệ mẫu dương tính thu được từ 4 phương pháp (Bảng 3.17).
  • Sự phân bố các loại bệnh phẩm dương tính theo từng phương pháp tạo khí (Bảng 3.18, 3.19).
  • Số lượng bệnh phẩm dương tính với 1 chủng, 2 chủng hoặc 3 chủng vi khuẩn kị khí (Bảng 3.20).
  • Các bảng so sánh bắt cặp trực tiếp: Phương pháp 1 so với Phương pháp 2 (Bảng 3.21); Phương pháp 1 so với Phương pháp 3 (Bảng 3.22); Phương pháp 1 so với Phương pháp 4 (Bảng 3.23); Phương pháp 2 so với Phương pháp 3 (Bảng 3.24); Phương pháp 2 so với Phương pháp 4 (Bảng 3.25); Phương pháp 3 so với Phương pháp 4 (Bảng 3.26).
  • Số lượng loài vi khuẩn kị khí phân lập được từ mẫu bệnh phẩm bởi 4 phương pháp tạo khí (Bảng 3.27, Biểu đồ 3.4).
• Đặc điểm đề kháng kháng sinh của các chủng phân lập:
  • Mức độ đề kháng chung của 167 chủng vi khuẩn kị khí với 8 loại kháng sinh thử nghiệm (Bảng 3.28, Biểu đồ 3.5).
  • Mức độ đa đề kháng và phân bố nồng độ MIC chi tiết của 46 chủng thuộc chi Bacteroides spp. với amoxicillin/clavulanate, piperacillin/tazobactam, metronidazole, imipenem, meropenem, ertapenem, moxifloxacin và clindamycin (Bảng 3.29, Bảng 3.32 – 3.39; Biểu đồ 3.6).
  • Mức độ đa đề kháng và nồng độ MIC chi tiết của 48 chủng thuộc chi Prevotella spp. với 8 loại kháng sinh tương ứng (Bảng 3.30, Bảng 3.40 – 3.47; Biểu đồ 3.7).
  • Mức độ đa đề kháng và nồng độ MIC chi tiết của 19 chủng thuộc chi Clostridium spp. với amoxicillin/clavulanate, piperacillin, metronidazole, imipenem, meropenem, ertapenem, moxifloxacin và clindamycin (Bảng 3.31, Bảng 3.48 – 3.55; Biểu đồ 3.8).
  • Tỉ lệ kháng kháng sinh của chủng cầu khuẩn kị khí Micromonas micros (Biểu đồ 3.9).

Chương 4: Bàn luận

Tác giả đi sâu phân tích và bàn luận về các phát hiện thực nghiệm:

• Bàn luận về các yếu tố ảnh hưởng trước xét nghiệm: Tác động của vị trí giải phẫu và loại mẫu bệnh phẩm (dịch mủ ổ bụng, áp xe gan, nhiễm trùng vết mổ) đến khả năng sống sót của vi khuẩn kị khí; phân tích vai trò bảo vệ của khối lượng mẫu lớn và môi trường vận chuyển chuyên biệt đối với việc duy trì thế oxy hóa khử Eh trong mẫu bệnh phẩm; khẳng định sự suy giảm rõ rệt tỉ lệ phân lập khi thời gian vận chuyển kéo dài quá các ngưỡng quy định.
• Bàn luận về yếu tố kỹ thuật nuôi cấy và ủ mẫu: Sự cần thiết của việc duy trì thời gian ủ sơ cấp kéo dài đến 4 ngày, 6 ngày để tránh bỏ sót các loài vi khuẩn kị khí phát triển chậm (Actinomyces, Porphyromonas, Prevotella sinh sắc tố đen).
• Bàn luận so sánh 4 phương pháp tạo khí trường: Đánh giá cơ chế hoạt động, độ ổn định khí trường và tính tiện ích thực tế giữa phản ứng hóa học bình Jar, túi Genbag, hệ thống ANOXOMAT và tủ thao tác Whitley anaerobic Workstations; chỉ rõ sự khác biệt về năng lực phát hiện các mẫu đa khuẩn (2-3 chủng) và các chủng vi khuẩn kị khí khó tính.
• Bàn luận về dịch tễ vi sinh và tình hình kháng kháng sinh: Phân tích cơ cấu loài phân lập được với sự chiếm ưu thế của Bacteroides spp., Prevotella spp. và Clostridium spp.; so sánh mức độ đề kháng kháng sinh và giá trị MIC của 167 chủng với các nghiên cứu trong nước và quốc tế; cảnh báo tình trạng kháng clindamycin, moxifloxacin và sự xuất hiện các chủng giảm nhạy cảm hoặc kháng beta-lactam kết hợp chất ức chế beta-lactamase, trong khi nhóm carbapenem và metronidazole vẫn duy trì hiệu lực kháng khuẩn cao.

Kết quả và những đóng góp mới

Dựa trên các nội dung được xác định trong luận án, các kết quả và đóng góp mới bao gồm:

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học:

• Cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm toàn diện về mức độ tác động của các yếu tố giai đoạn trước xét nghiệm (loại bệnh phẩm, thể tích, khối lượng mẫu, môi trường vận chuyển, thời gian vận chuyển) và trong xét nghiệm (thời gian ủ, phương pháp tạo khí trường) đến khả năng sống sót và phát triển của vi khuẩn kị khí.
• Xác lập bằng chứng thực nghiệm so sánh đối đầu trực tiếp giữa 4 phương pháp tạo khí trường kị khí (bình Jar phản ứng hóa học, túi Genbag, ANOXOMAT và tủ Whitley anaerobic Workstations), làm rõ sự khác biệt về hiệu quả thu hồi đơn khuẩn, đa khuẩn và tính đa dạng thành phần loài vi khuẩn kị khí.

Đóng góp về mặt thực tiễn và ứng dụng lâm sàng:

• Chuẩn hóa các yêu cầu kỹ thuật trong thu thập và vận chuyển bệnh phẩm ngoại khoa nghi ngờ nhiễm vi khuẩn kị khí tại bệnh viện tuyến cuối: ưu tiên thu thập mủ/dịch bằng bơm kim tiêm kín, đảm bảo thể tích và khối lượng mẫu đủ lớn, sử dụng môi trường vận chuyển chuyên biệt nếu phải trì hoãn thời gian cấy, và bắt buộc vận chuyển đến phòng xét nghiệm vi sinh càng sớm càng tốt.
• Xác định quy trình nuôi cấy kị khí tối ưu: duy trì ủ ấm và theo dõi đĩa thạch Columbia bổ sung hemin và vitamin K tối thiểu qua các mốc 48 giờ, 4 ngày và 6 ngày trước khi kết luận âm tính nhằm tránh bỏ sót các chủng mọc chậm.
• Thiết lập bộ dữ liệu thực nghiệm về đặc điểm phân bố loài và mức độ kháng kháng sinh kèm phân bố nồng độ MIC chi tiết của 167 chủng vi khuẩn kị khí lâm sàng (Bacteroides spp., Prevotella spp., Clostridium spp., Micromonas micros) đối với 8 loại kháng sinh thông dụng tại Việt Nam.

Nhóm vi khuẩn kị khí phân lập	Số lượng chủng	Kháng sinh thử nghiệm nồng độ MIC	Kỹ thuật kháng sinh đồ áp dụng
Bacteroides spp.	46 chủng	Amoxicillin/clavulanate, piperacillin/tazobactam, metronidazole, imipenem, meropenem, ertapenem, moxifloxacin, clindamycin	Vi pha loãng (khay MICRONAUT-Wilkins-Chalgren) và Etest
Prevotella spp.	48 chủng	Amoxicillin/clavulanate, piperacillin/tazobactam, metronidazole, imipenem, meropenem, ertapenem, moxifloxacin, clindamycin	Vi pha loãng (khay MICRONAUT-Wilkins-Chalgren) và Etest
Clostridium spp.	19 chủng	Amoxicillin/clavulanate, piperacillin, metronidazole, imipenem, meropenem, ertapenem, moxifloxacin, clindamycin	Vi pha loãng (khay MICRONAUT-Wilkins-Chalgren) và Etest
Toàn bộ chủng vi khuẩn kị khí	167 chủng	8 loại kháng sinh chủ lực nêu trên	Vi pha loãng (khay MICRONAUT-Wilkins-Chalgren) và Etest

Kiến nghị và giải pháp đề xuất từ luận án:

• Các bệnh viện cần xây dựng và ban hành quy trình phối hợp lâm sàng - vi sinh chuẩn mực trong lấy mẫu, chỉ định và vận chuyển bệnh phẩm nuôi cấy kị khí.
• Căn cứ vào điều kiện trang thiết bị và kinh phí, các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng có thể lựa chọn phương pháp tạo khí trường kị khí phù hợp (túi Genbag cho quy mô nhỏ/linh hoạt, hệ thống ANOXOMAT hoặc tủ thao tác chuyên dụng cho đơn vị thực hiện thường quy số lượng mẫu lớn).
• Khuyến nghị đưa kỹ thuật thử nghiệm kháng sinh đồ kị khí (bằng phương pháp vi pha loãng) vào thường quy nhằm giám sát dịch tễ kháng thuốc và cung cấp dữ liệu MIC chính xác hỗ trợ bác sĩ lâm sàng tối ưu hóa phác đồ điều trị.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về hạn chế của nghiên cứu:

• Phạm vi nghiên cứu được thực hiện tại một trung tâm phẫu thuật ngoại khoa tuyến cuối (Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức), đối tượng bệnh phẩm chủ yếu tập trung vào các loại dịch và mủ thu thập qua phẫu thuật hoặc thủ thuật ở các vị trí nhiễm trùng ngoại khoa sâu (áp xe não, gan, ổ bụng, vết mổ hoại tử), chưa bao quát toàn bộ các hình thái nhiễm khuẩn nội khoa khác trong cộng đồng.
• Thử nghiệm kháng sinh đồ chỉ tập trung vào 8 loại kháng sinh chủ lực với 167 chủng phân lập được bằng kỹ thuật vi pha loãng và Etest, chưa thực hiện phân tích sâu về cơ chế phân tử mã hóa gen đề kháng kháng sinh cho toàn bộ các chủng này.

Về hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng nghiên cứu đa trung tâm trên nhiều nhóm bệnh phẩm và cơ sở y tế khác nhau để có bức tranh dịch tễ học kị khí toàn diện hơn.
• Kết hợp kỹ thuật vi sinh truyền thống với các kỹ thuật sinh học phân tử chuyên sâu (như PCR phát hiện gen kháng thuốc, giải trình tự gen) và hệ thống khối phổ định danh vi sinh vật tự động để rút ngắn thời gian chẩn đoán căn nguyên kị khí.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Bác sĩ và kỹ thuật viên vi sinh lâm sàng: Tham khảo chi tiết quy trình kỹ thuật nuôi cấy phân lập, quy trình ủ kiểm tra aerotolerance song song, quy trình vận hành so sánh 4 hệ thống tạo khí trường kị khí, cùng phương pháp thực hiện kháng sinh đồ vi pha loãng bằng khay MICRONAUT-Wilkins-Chalgren và Etest.
• Bác sĩ phẫu thuật ngoại khoa và bác sĩ hồi sức cấp cứu: Nắm bắt các nguyên tắc kỹ thuật trong thu thập bệnh phẩm mủ/dịch bảo đảm không làm chết vi khuẩn kị khí, đồng thời tham khảo dữ liệu phân bố loài và mức độ nhạy cảm/kháng thuốc (đặc biệt là nồng độ MIC của 8 loại kháng sinh) để định hướng lựa chọn phác đồ điều trị kháng sinh kinh nghiệm hoặc theo đích.
• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên sau đại học ngành Khoa học y sinh, Vi sinh y học, Ngoại khoa và Truyền nhiễm: Sử dụng làm tài liệu học tập, tham khảo hệ thống bảng số liệu dịch tễ vi sinh kị khí, phương pháp luận thực nghiệm so sánh các kỹ thuật tạo khí trường và phương pháp phân tích thống kê y học.

Câu hỏi thường gặp

1. Bốn phương pháp tạo khí trường nuôi cấy vi khuẩn kị khí được luận án so sánh gồm những phương pháp nào? Luận án đánh giá và so sánh 4 phương pháp gồm: (1) Phương pháp tạo phản ứng hóa học (dùng acid sulfuric phản ứng với kẽm tạo H2 và bicarbonat với nước tạo CO2 trong bình Jar kín); (2) Phương pháp túi Genbag (sử dụng túi plastic trong suốt với gói hóa chất tạo khí đóng sẵn); (3) Phương pháp hệ thống ANOXOMAT (chu trình tự động hút chân không và thay thế bằng bình khí trộn 10% H2, 10% CO2, 80% N2 kết nối bình Jar); (4) Phương pháp hệ thống tủ Whitley anaerobic Workstations (tủ ấm tích hợp thao tác kín qua găng tay với hệ thống điện tử kiểm soát khí tự động).

2. Vì sao vi khuẩn kị khí tuyệt đối không thể tồn tại và phát triển trong môi trường có oxy? Vi khuẩn kị khí tuyệt đối không có hệ thống cytochrome để chuyển hóa oxy. Đồng thời, chúng có hàm lượng enzyme Superoxide dismutase (SOD) rất thấp và thường thiếu enzyme catalase. Khi tiếp xúc với oxy, các phân tử oxy và gốc tự do sinh ra gây độc tế bào mà không bị các enzyme trên phân giải, khiến vi khuẩn kị khí tuyệt đối bị tiêu diệt nhanh chóng (chết chỉ sau 10 phút tiếp xúc với không khí).

3. Quy trình xác nhận một

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về các vi khuẩn kị khí 1. Đặc điểm chung của vi khuẩn kị khí A. Khái niệm về vi khuẩn kị khí Vi khuẩn kị khí là các loại vi khuẩn tồn tại, phát triển và sinh sản trong điều kiện không có O2, một số loài có thể tồn tại nhưng không phát triển trong điều kiện có nồng độ O2 từ 2-8% [4].

Phân loại vi khuẩn kị khí theo mức độ nhạy cảm với O2 Các loài vi khuẩn kị khí khác nhau có khả năng chịu tác động của O2 khác nhau. Dựa vào đó vi khuẩn kị khí được phân thành các nhóm sau. Vi khuẩn kị khí tuyệt đối (Obligate anaerobe) Vi khuẩn kị khí tuyệt đối không sử dụng O2 cho quá trình sinh trưởng và chuyển hóa. Những vi khuẩn này thu năng lượng từ các phản ứng khử nitrat, sulfat.

Vi khuẩn kị khí yêu cầu nồng độ khí O2 rất thấp hoặc không có O2 để tồn tại, sinh trưởng và phát triển. Vi khuẩn thuộc nhóm này không mọc được trên đĩa thạch nếu nồng độ O2 của khí trường nuôi cấy > 0,5%. Chúng sẽ chết sau khi tiếp xúc với không khí chỉ 10 phút. Ví dụ như: Bacteroides spp, Clostridium spp, Eubacterium spp, Fusobacterium spp, Peptostreptococcus spp, Porphyromona spp,.

Vi khuẩn kị khí chịu O2 (Aerotolerant organisms) Là những loài sinh trưởng, phát triển tốt trong điều kiện kị khí và trong điều kiện có nồng độ 5% khí O2 như: Actinomyces spp, Bifidobacterium spp … Một số loài có thể tồn tại nhưng không sinh trưởng, phát triển trong điều kiện có nồng độ O2 từ 2-8% như: Streptococci spp, Propionibacterium spp, Lactobacillus spp [5], [7]. Vi khuẩn hiếu kị khí tùy ngộ (Falcultative organisms) Vi khuẩn hiếu kị khí tùy ngộ là những loài vi khuẩn có thể phát triển cả trong môi trường ái khí và kị khí (gọi chung là vi khuẩn ái khí). Trong khí trường ái khí, vi khuẩn sử dụng O2 như chất nhận điện tử cuối cùng, còn trong khí trường kị khí vi khuẩn sử dụng phản ứng lên men để tạo ra năng lượng, thường gặp là nhóm: Streptococcus spp và Enterobacteriaceae [7]. Cơ chế nhạy cảm O2 của vi khuẩn kị khí tuyệt đối Trong khí trường có sự hiện diện của O2, vi khuẩn kị khí không sinh trưởng và phát triển được.

O2 và các gốc tự do của O2 gây độc và làm chết các vi khuẩn kị khí. Vi khuẩn ái khí và vi khuẩn hiếu kị khí tùy ngộ thường có hệ thống chuyển hóa mà vi khuẩn kị khí không có. Đó là:  Hệ thống Cytochrome chuyển hóa O2.  Enzym Superoxide dismutase (SOD), phân hủy các chất theo phản ứng sau: O2- + O2- + 2H+ → H2O2 + O2  Enzym catalase, phân hủy các chất theo phản ứng sau: H2O2  H2O + O2 Vi khuẩn kị khí không có hệ thống cytochrome để chuyển hóa O2.

Vi khuẩn kị khí tuyệt đối có hàm lượng enzym SOD (superoxide dismutase) thấp và có thể không có enzym catalase. Đa số vi khuẩn thuộc nhóm B. fragilis có một lượng nhỏ enzym SOD và enzym catalase. Độc tính của O2 đối với vi khuẩn kị khí gây ra bởi nhiều cơ chế.

Nếu vi khuẩn có enzym SOD hoặc enzym catalase (hoặc cả hai) thì có thể làm mất đi độc tính của phân tử O2 tự do và hydrogen peroxide, từ đó vi khuẩn kị khí có thể tồn tại trong môi trường có O2. Vi khuẩn kị khí tuyệt đối thường thiếu enzym SOD và enzym catalase, do đó dễ nhạy cảm với tác động gây chết của O2 [4], [5], [8]. 5 Chất nhận điện tử trong quá trình lên men hoặc hô hấp kị khí là các ion như: SO4-, HCO3-, NO3-… nên sản phẩm cuối cùng là H2S, NH3, hoặc methan. những chất có khả năng thăng hoa và dễ nhận biết qua mùi (hôi, thối) của chúng [9].