Luận văn thạc sĩ hus phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bifidobacteria ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotics

Luận văn thạc sĩ phân tích hus phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bifidobacteria ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotics, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Nguyễn Hoàng Tuấn
• Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Lương
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – Đại Học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bifidobacteria ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotics
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Định nghĩa probiotic
• 1.2. Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic
• 1.3. Lợi ích của probiotic
• 1.4. Sinh học phân tử
• 1.5. Môi trường sống
• 1.6. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
• 1.7. Sự trao đổi carbohydrate
• 1.8. Nhiệt độ và pH sinh trưởng tối ưu
• 1.9. Độ nhạy cảm oxy
• 1.10. Bifidobacteria mang đặc tính probiotic
• 1.11. Giảm tiêu chảy
• 1.12. Làm giảm sự không dung nạp lactose
• 1.13. Ức chế Helicobacter pylori
• 1.14. Phòng ngừa bệnh viêm ruột
• 1.15. Phòng ung thư đại trực tràng
• 1.16. Một số loài bifidobacteria đã được thương mại hóa
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Chủng vi khuẩn
• 2.2. Môi trường
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phân loại bằng sinh học phân tử
• 2.5. Nghiên cứu đặc tính probiotic và tuyển chọn chủng
• 2.6. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 2.7. Khả năng sinh trưởng
• 2.8. Khả năng sinh axít hữu cơ
• 2.9. Khả năng chịu muối mật
• 2.10. Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột
• 2.11. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột mô phỏng
• 2.12. Khả năng chịu kháng sinh
• 2.13. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng Bifidobacterium
• 2.14. Lựa chọn môi trường nuôi thích hợp
• 2.15. Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp
• 2.16. Lựa chọn pH nuôi thích hợp
• 2.17. Lựa chọn nguồn cacbon nuôi thích hợp
• 2.18. Lựa chọn nguồn Nitơ nuôi thích hợp
• 2.19. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp
• 2.20. Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium trên thiết bị lên men 5 lít
• 2.21. Chế độ khuấy đảo
• 2.22. Tỷ lệ giống cấy
• 2.23. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp
• 2.24. Bước đầu nghiên cứu một số loại chất mang thích hợp cho quá trình đông khô các chủng Bifidobacterium
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập và phân loại
• 3.2. Phân lập và quan sát hình thái
• 3.3. Tách DNA genome và xác định gen F-6-PPK
• 3.4. Phân loại dựa vào trình tự rDNA 16S
• 3.5. Nghiên cứu các đặc tính probiotic và lựa chọn chủng Bifidobacterium
• 3.6. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 3.7. Khả năng sinh trưởng và sinh axít hữu cơ
• 3.8. Khả năng chịu muối mật
• 3.9. Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột
• 3.10. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột
• 3.11. Khả năng chịu kháng sinh
• 3.12. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng của hai chủng Bifidobacterium
• 3.13. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
• 3.14. Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp
• 3.15. Lựa chọn pH nuôi thích hợp
• 3.16. Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp
• 3.17. Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp
• 3.18. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp
• 3.19. Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium trên thiết bị lên men 5 lít
• 3.20. Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp
• 3.21. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp
• 3.22. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp
• 3.23. Lựa chọn chất mang thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bifidobacteria

Vi khuẩn Bifidobacteria là một trong những nhóm vi sinh vật có lợi quan trọng trong hệ vi sinh vật đường ruột. Chúng đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì sức khỏe đường tiêu hóa và hỗ trợ hệ miễn dịch. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bifidobacteria có đặc tính probiotic tốt là một nhiệm vụ quan trọng trong nghiên cứu và sản xuất chế phẩm probiotics. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Bifidobacteria có khả năng cải thiện sức khỏe đường ruột, giảm triệu chứng rối loạn tiêu hóa và phòng ngừa một số bệnh lý nghiêm trọng.

1.1. Định nghĩa và vai trò của Bifidobacteria trong sức khỏe

Bifidobacteria là vi khuẩn Gram dương, sống kỵ khí, có mặt chủ yếu trong đường ruột của con người và động vật. Chúng có khả năng sản xuất các chất kháng khuẩn, giúp ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu cho thấy Bifidobacteria có thể giảm nguy cơ mắc các bệnh tiêu chảy, viêm ruột và ung thư đại trực tràng.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng chế phẩm probiotics chứa Bifidobacteria

Chế phẩm probiotics chứa Bifidobacteria mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, bao gồm cải thiện tiêu hóa, tăng cường hệ miễn dịch và giảm triệu chứng không dung nạp lactose. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng việc bổ sung Bifidobacteria có thể giúp giảm tỷ lệ nhiễm trùng đường hô hấp và cải thiện sức khỏe tổng thể.

II. Thách thức trong việc phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bifidobacteria

Mặc dù Bifidobacteria có nhiều lợi ích, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn này gặp phải nhiều thách thức. Các yếu tố như môi trường nuôi cấy, điều kiện sinh trưởng và khả năng kháng thuốc đều ảnh hưởng đến quá trình này. Việc lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sống sót và phát triển trong điều kiện đường tiêu hóa là rất quan trọng.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân lập Bifidobacteria

Môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng như pH, nhiệt độ và nguồn dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến khả năng phân lập Bifidobacteria. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là cần thiết để đạt được hiệu quả cao nhất trong việc phân lập các chủng vi khuẩn có lợi.

2.2. Khó khăn trong việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic

Việc tuyển chọn các chủng Bifidobacteria có đặc tính probiotic tốt không chỉ dựa vào khả năng sinh trưởng mà còn phải xem xét đến khả năng kháng lại các vi khuẩn gây bệnh và khả năng sản xuất các chất có lợi cho sức khỏe. Điều này đòi hỏi các phương pháp phân tích chính xác và hiệu quả.

III. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bifidobacteria hiệu quả

Để phân lập và tuyển chọn Bifidobacteria, nhiều phương pháp đã được áp dụng, bao gồm phương pháp nuôi cấy chọn lọc và phân tích sinh học phân tử. Các phương pháp này giúp xác định và phân loại các chủng vi khuẩn một cách chính xác, từ đó lựa chọn được những chủng có đặc tính probiotic tốt nhất.

3.1. Phương pháp nuôi cấy chọn lọc cho Bifidobacteria

Phương pháp nuôi cấy chọn lọc sử dụng các môi trường đặc biệt giúp tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng cho Bifidobacteria. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và nguồn dinh dưỡng được điều chỉnh để tạo ra môi trường lý tưởng cho sự phát triển của vi khuẩn.

3.2. Phân tích sinh học phân tử trong tuyển chọn vi khuẩn

Phân tích sinh học phân tử, đặc biệt là sử dụng gen 16S rRNA, giúp xác định chính xác các loài Bifidobacteria. Phương pháp này cho phép phân loại và xác định các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic tốt, từ đó hỗ trợ trong việc phát triển các chế phẩm probiotics.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vi khuẩn Bifidobacteria trong chế phẩm probiotics

Vi khuẩn Bifidobacteria đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các chế phẩm probiotics. Các sản phẩm này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe đường ruột mà còn hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý khác nhau. Việc phát triển các chế phẩm này từ các chủng Bifidobacteria nội địa sẽ giúp tăng cường giá trị dinh dưỡng và an toàn cho người tiêu dùng.

4.1. Các sản phẩm probiotics chứa Bifidobacteria trên thị trường

Hiện nay, nhiều sản phẩm probiotics chứa Bifidobacteria đã có mặt trên thị trường, từ sữa chua đến thực phẩm chức năng. Những sản phẩm này được sản xuất với công nghệ tiên tiến, đảm bảo chất lượng và hiệu quả cho người tiêu dùng.

4.2. Nghiên cứu và phát triển chế phẩm probiotics từ Bifidobacteria

Nghiên cứu và phát triển các chế phẩm probiotics từ Bifidobacteria đang được chú trọng. Các nghiên cứu này không chỉ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất mà còn tìm kiếm các chủng vi khuẩn mới có đặc tính probiotic tốt hơn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của vi khuẩn Bifidobacteria

Vi khuẩn Bifidobacteria có vai trò quan trọng trong sức khỏe con người và động vật. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn này không chỉ giúp phát triển các chế phẩm probiotics hiệu quả mà còn mở ra nhiều cơ hội nghiên cứu mới trong lĩnh vực vi sinh vật học. Tương lai của Bifidobacteria hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương lai của nghiên cứu Bifidobacteria

Nghiên cứu về Bifidobacteria sẽ tiếp tục phát triển, với nhiều ứng dụng mới trong y học và dinh dưỡng. Các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động và lợi ích của Bifidobacteria sẽ giúp tối ưu hóa việc sử dụng chúng trong các sản phẩm sức khỏe.

5.2. Tầm quan trọng của Bifidobacteria trong chế phẩm probiotics

Bifidobacteria sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm probiotics, giúp cải thiện sức khỏe đường ruột và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý. Việc phát triển các sản phẩm này từ nguồn vi khuẩn nội địa sẽ góp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng và an toàn cho người tiêu dùng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột của con người chứa khoảng 100 nghìn tỷ tế bào vi khuẩn (mật độ đạt từ 10^13 đến 10^14 CFU), gấp 10 đến 20 lần tổng số tế bào trong cơ thể. Trong đó, chi vi khuẩn Bifidobacterium giữ vai trò then chốt khi chiếm tới 80% tổng lượng vi sinh vật đường ruột ở trẻ sơ sinh bú mẹ và khoảng 25% ở người trưởng thành. Hiện nay, chi này bao gồm khoảng 42 loài đã được công nhận đạt chứng chỉ an toàn sinh học GRAS do Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ cấp. Mặc dù các chế phẩm probiotics chứa Bifidobacterium mang lại lợi ích vượt trội trong việc cải thiện tiêu hóa, ức chế vi khuẩn gây bệnh và phòng chống ung thư đại trực tràng, thị trường Việt Nam vẫn phụ thuộc phần lớn vào các dòng vi khuẩn ngoại nhập hoặc nguyên liệu đóng gói từ nước ngoài.

Vấn đề đặt ra là việc thiếu hụt các nghiên cứu toàn diện về nguồn giống vi khuẩn Bifidobacterium bản địa có khả năng thích nghi cao với điều kiện sinh lý của người Việt Nam. Đề tài luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành Vi sinh vật học thực hiện năm 2017 tại Đại học Quốc gia Hà Nội tập trung giải quyết mục tiêu: phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng Bifidobacterium có hoạt tính probiotic vượt trội từ 15 nguồn mẫu thực tế; đồng thời tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sinh khối trên hệ thống lên men 5 lít và khảo sát chất mang đông khô. Kết quả nghiên cứu không chỉ làm phong phú nguồn gen vi sinh vật quốc gia tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam (VTCC) mà còn cung cấp cơ sở khoa học then chốt để tự chủ công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ sức khỏe con người và chăn nuôi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên tiêu chuẩn đánh giá probiotic quốc tế của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc phối hợp với Tổ chức Y tế Thế giới (FAO/WHO) cùng định nghĩa chuẩn hóa của Fuller (năm 1992). Tiêu chuẩn này đòi hỏi chủng vi sinh vật phải đảm bảo an toàn tuyệt đối, có khả năng sống sót qua hàng rào dịch vị dạ dày, chịu được nồng độ muối mật ở ruột non và có hoạt tính đối kháng tác nhân gây bệnh.

Về mặt sinh hóa, nghiên cứu áp dụng mô hình chuyển hóa đường đặc trưng Fructose-6-Phosphate (con đường "Bifid Shunt") theo công trình kinh điển của Scardovi và cộng sự. Quá trình trao đổi chất này sử dụng enzyme định danh then chốt Fructose-6-Phosphate Phosphoketolase (F-6-PPK) được mã hóa bởi gen xfp, tạo ra tỷ lệ phân giải lý thuyết 3 phân tử Acetate và 2 phân tử Lactate trên mỗi 2 phân tử Glucose mà không sinh khí CO2. Khung lý thuyết cũng tích hợp các khái niệm học thuật then chốt bao gồm: chứng chỉ an toàn vi sinh GRAS, cơ chế đối kháng cạnh tranh vị trí bám dính niêm mạc ruột, và khả năng sinh enzyme ngoại bào chuyển hóa chất dinh dưỡng phức tạp.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành thu thập 15 mẫu thực tế tại Việt Nam theo phương pháp lấy mẫu có chủ đích, bao gồm 5 mẫu phân trẻ sơ sinh bú mẹ hoàn toàn, 3 mẫu phân người lớn khỏe mạnh, 3 mẫu phân gà con, 2 mẫu phân lợn con, 1 mẫu sữa chua lên men và 1 mẫu nước thải. Mẫu được làm giàu và phân lập kỵ khí trên môi trường chuyên dụng De Man Rogosa Sharpe bổ sung 0,05% L-cysteine (MRSc) ở nhiệt độ 37°C trong thời gian 48 giờ.

Quy trình phân loại và kiểm định sinh học phân tử bao gồm: tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu xfp kích thước 591 bp bằng cặp mồi U1R và U2L để xác định chi Bifidobacterium, sau đó giải trình tự gen 16S rDNA với cặp mồi chuẩn 27F và 1525R. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo thuật toán Kimura 2-parameter kết hợp phương pháp Neighbor-Joining với 1000 lần lặp bootstrap để đảm bảo độ tin cậy thống kê trên 50%.

Đặc tính probiotic được đánh giá qua: khả năng sinh enzyme ngoại bào trên thạch cơ chất, khả năng chịu muối mật ở các dải nồng độ 0,3%, 0,5% và 1,0%, khả năng sống sót trong dịch dạ dày nhân tạo (chứa 3 g/l pepsin, pH 3,0 trong 4 giờ) và dịch ruột nhân tạo (chứa 1 g/l pancreatin, 5 g/l muối mật, pH 8,0 trong 16 giờ). Hoạt tính kháng khuẩn đối kháng với 4 chủng vi sinh vật chỉ thị (Escherichia coli VTCC-B-0482, Salmonella enterica VTCC-B-0480, Staphylococcus aureus VTCC-B-0658, Micrococcus luteus VTCC-B-0644) được định lượng bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Động học tiêu thụ glucose được xác định qua phản ứng so màu quang phổ với thuốc thử DNS ở bước sóng 575 nm. Toàn bộ timeline nghiên cứu và thử nghiệm lên men 5 lít được thực hiện liên tục trong giai đoạn từ năm 2016 đến cuối năm 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 15 mẫu ban đầu, nghiên cứu đã phân lập được 50 chủng vi sinh vật kỵ khí, trong đó sàng lọc được 20 chủng có hình thái tế bào que phân nhánh, hình chữ Y hoặc chữ V bắt màu Gram dương đặc trưng. Phân tích phản ứng PCR khẳng định 15 trên 20 chủng mang đoạn gen xfp kích thước 591 bp của enzyme F-6-PPK. Giải trình tự 16S rDNA và đối chiếu trên GenBank cho thấy 15 chủng này chia thành 3 phân nhóm chính: 7 chủng đồng nhất với loài Bifidobacterium animalis subsp. lactis, 4 chủng thuộc loài Bifidobacterium longum, và 4 chủng thuộc loài Bifidobacterium bifidum.

Đánh giá đặc tính probiotic ghi nhận các chủng tuyển chọn có khả năng sinh trưởng bền vững trong môi trường chứa tới 1,0% muối mật. Trong thử nghiệm mô phỏng đường tiêu hóa, các chủng ưu tú duy trì mật độ sống sót cao sau 4 giờ tiếp xúc với dịch vị pH 3,0 và tiếp tục ổn định sau 16 giờ trong dịch tá tràng pH 8,0, mật độ tế bào đạt trên 10^7 đến 10^8 CFU/ml (tỷ lệ sống sót đạt khoảng 75% đến 90%). Dịch lọc nuôi cấy thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với đường kính vòng vô khuẩn dao động từ 12 mm đến 24 mm đối với cả 4 chủng vi khuẩn kiểm định.

Trong thử nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, môi trường MRSc bổ sung glucose và cao men là nguồn dinh dưỡng tối ưu nhất ở nhiệt độ 37°C và pH 6,5. Khi nâng quy mô lên thiết bị lên men 5 lít, các thông số kỹ thuật tối ưu được xác lập gồm: tốc độ khuấy 20 đến 30 vòng/phút, tỷ lệ tiếp giống khởi động từ 5% đến 10%, và thời gian thu hoạch sinh khối cực đại sau 24 đến 36 giờ nuôi cấy. Trong thử nghiệm bảo quản, chất mang sữa gầy (skim milk) kết hợp phụ gia bảo vệ monosodium glutamate và L-cysteine giúp duy trì tỷ lệ sống sót cao nhất sau 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ 4°C.

Thảo luận kết quả

Khả năng sống sót vượt trội của các chủng Bifidobacterium phân lập trong điều kiện pH 3,0 và muối mật 1,0% có thể được biểu diễn trực quan qua biểu đồ cột so sánh mật độ quang OD600 và số lượng khuẩn lạc CFU/ml giữa các mốc thời gian tiêu hóa mô phỏng. Sự bền vững này xuất phát từ cấu trúc vách tế bào murein dày đặc trưng của vi khuẩn Gram dương và cơ chế duy trì gradient pH nội bào thông qua bơm proton ATPase màng tế bào. Hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột được giải thích là do sự tích lũy của axit axetic và axit lactic làm giảm mạnh độ pH môi trường, kết hợp với sự tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên như bacteriocin.

Động học lên men trên nồi 5 lít có thể được mô tả bằng đồ thị đường biểu diễn mối tương quan nghịch biến giữa tốc độ tiêu thụ đường glucose (xác định qua phương pháp DNS) và đường cong sinh trưởng tích lũy sinh khối tế bào. So sánh với các nghiên cứu công bố quốc tế của Jamaly và cộng sự hay Van der Meulen, các chủng bản địa phân lập tại Việt Nam cho thấy tốc độ nhân đôi tương đương nhưng thể hiện khả năng thích ứng cao hơn với các cơ chất dinh dưỡng sẵn có tại địa phương. Đây là tiền đề kỹ thuật then chốt giúp hạ giá thành sản xuất men vi sinh công nghiệp.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất công nghiệp, đề tài đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể:

• Mở rộng quy mô lên men pilot từ 50 lít đến 100 lít: Tiến hành tối ưu hóa hệ số chuyển khối oxy và chế độ kiểm soát pH tự động trong giai đoạn từ 6 đến 12 tháng tới. Đơn vị thực hiện là Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học phối hợp với các nhà máy sản xuất men vi sinh, hướng tới mục tiêu đạt mật độ sinh khối từ 10^9 đến 10^10 CFU/ml.
• Chuẩn hóa quy trình vi bao bảo vệ và sấy đông khô: Nghiên cứu công nghệ vi bao màng kép polymer sinh học kết hợp chất mang skim milk nhằm nâng tỷ lệ tế bào sống sót lên trên 85% sau 12 đến 18 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng 25°C. Đơn vị chủ trì là các doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng trong lộ trình từ 12 đến 18 tháng.
• Thực hiện thử nghiệm tiền lâm sàng và đánh giá chức năng: Đánh giá hiệu quả lâm sàng của chế phẩm probiotic phối hợp ba chủng B. lactis, B. longum, B. bifidum trên mô hình chuột bị viêm đại tràng hoặc tiêu chảy nhiễm khuẩn, đo lường mức giảm 50% các chỉ số viêm ruột (IBD) trong thời gian từ 18 đến 24 tháng dưới sự phối hợp của các trường đại học y dược.
• Đăng ký bảo tồn và khai thác nguồn gen an toàn: Hoàn thiện hồ sơ lưu trữ chính thức toàn bộ 15 chủng vi khuẩn phân lập vào ngân hàng gen Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam (VTCC) trong vòng 3 đến 6 tháng để bảo vệ bản quyền công nghệ sinh học quốc gia.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình luận văn này mang lại giá trị học thuật và thực tiễn phong phú cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Các nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Tài liệu cung cấp quy trình chi tiết từ phân lập vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt, thiết kế mồi PCR đặc hiệu gen xfp đến xây dựng cây phát sinh loài 16S rDNA bằng phần mềm ClustalW.
• Kỹ sư nghiên cứu và phát triển sản phẩm (R&D) tại các doanh nghiệp dược phẩm, chế biến sữa: Cung cấp đầy đủ thông số động học lên men trên nồi 5 lít, thành phần môi trường MRSc cải tiến và công thức phối trộn chất mang sấy đông khô để ứng dụng trực tiếp vào dây chuyền sản xuất men tiêu hóa.
• Bác sĩ chuyên khoa tiêu hóa, dược sĩ lâm sàng và chuyên gia dinh dưỡng: Tài liệu cung cấp cơ sở chứng cứ khoa học vững chắc về cơ chế tác động của từng loài Bifidobacterium trong việc cân bằng hệ vi sinh, ức chế E. coli, Salmonella và hỗ trợ điều trị hội chứng không dung nạp đường lactose.
• Học viên cao học và sinh viên ngành Sinh học, Công nghệ thực phẩm: Nguồn tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp bố trí thí nghiệm in vitro, chuẩn độ axit hữu cơ theo phương pháp Therner và dựng đường chuẩn glucose bằng phản ứng DNS.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao vi khuẩn Bifidobacterium được xem là ứng viên probiotic hàng đầu cho hệ tiêu hóa?

Bifidobacterium chiếm tới 80% hệ vi sinh vật ở trẻ sơ sinh và 25% ở người lớn, giữ vai trò rào chắn tự nhiên bảo vệ niêm mạc ruột. Vi khuẩn này chuyển hóa đường qua con đường Fructose-6-Phosphate sinh axit axetic và axit lactic, tạo môi trường pH thấp giúp ức chế mạnh các mầm bệnh như E. coli và Salmonella, đồng thời được cơ quan y tế quốc tế chứng nhận an toàn sinh học cấp độ GRAS.

Vai trò của việc xác định gen F-6-PPK trong nhận diện vi khuẩn Bifidobacterium là gì?

Enzyme Fructose-6-Phosphate Phosphoketolase (F-6-PPK) là enzyme đặc hữu chỉ xuất hiện ở chi Bifidobacterium mà không có ở các vi khuẩn đường ruột khác. Việc thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen xfp mã hóa enzyme này với kích thước chuẩn 591 bp cho phép xác định chính xác và nhanh chóng vị trí phân loại đến cấp độ chi của các chủng phân lập trước khi giải trình tự 16S rDNA.

Khả năng sống sót của các chủng Bifidobacterium phân lập trong điều kiện tiêu hóa mô phỏng đạt mức nào?

Các chủng tuyển chọn thể hiện khả năng thích nghi cao khi trải qua 4 giờ trong dịch dạ dày nhân tạo ở pH 3,0 chứa 3 g/l pepsin và tiếp tục 16 giờ trong dịch ruột nhân tạo ở pH 8,0 chứa pancreatin và 5 g/l muối mật. Mật độ tế bào sống sót luôn duy trì ở ngưỡng cao từ 10^7 đến 10^8 CFU/ml, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn hiệu quả của probiotic thương mại.

Công thức chất mang nào đem lại hiệu quả bảo vệ tế bào vi khuẩn tối ưu trong quá trình đông khô?

Hỗn hợp phối trộn sinh khối vi khuẩn với chất mang sữa gầy (skim milk) kết hợp đệm phosphate pH 7,0, monosodium glutamate và L-cysteine theo tỷ lệ thích hợp cho tỷ lệ sống sót cao nhất. Công thức này giúp bảo vệ màng tế bào khỏi tổn thương do nhiệt và tinh thể đá, duy trì mật độ vi khuẩn ổn định sau 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ 4°C.

Ý nghĩa thực tiễn của các thông số lên men trên thiết bị 5 lít trong nghiên cứu là gì?

Thử nghiệm lên men 5 lít đã xác lập được bộ thông số công nghệ chuẩn gồm: tốc độ khuấy đảo nhẹ từ 20 đến 30 vòng/phút, tỷ lệ cấy giống từ 5% đến 10%, và thời gian nuôi cấy từ 24 đến 36 giờ. Đây là cơ sở dữ liệu quan trọng giúp các cơ sở công nghệ sinh học trong nước dễ dàng nhân rộng quy mô lên men công nghiệp mà không phải thử nghiệm lại từ đầu.

Kết luận

• Đề tài đã phân lập thành công 50 chủng vi sinh vật kỵ khí từ 15 mẫu nguồn gốc đa dạng tại Việt Nam, tuyển chọn và khẳng định 15 chủng bản địa thuộc chi Bifidobacterium bằng chỉ thị phân tử gen xfp kích thước 591 bp.
• Định danh phân tử dựa trên trình tự gen 16S rDNA đã xếp 15 chủng vào 3 loài vi khuẩn có giá trị probiotic cao gồm: Bifidobacterium animalis subsp. lactis (7 chủng), Bifidobacterium longum (4 chủng), và Bifidobacterium bifidum (4 chủng).
• Các chủng tuyển chọn thể hiện hoạt tính sinh học xuất sắc với khả năng chịu muối mật 1,0%, tồn tại bền vững qua dịch dạ dày pH 3,0 và dịch ruột pH 8,0 (mật độ duy trì trên 10^7 CFU/ml), cùng hoạt tính đối kháng mạnh với các vi khuẩn gây bệnh đường ruột.
• Thiết lập thành công quy trình công nghệ nuôi cấy tối ưu trên thiết bị lên men 5 lít (khuấy 20-30 vòng/phút, giống cấy 5-10%, thời gian 24-36 giờ) và lựa chọn chất mang skim milk kết hợp L-cysteine bảo quản tế bào đông khô ổn định trong 4 tuần ở 4°C.
• Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tiếp theo, các đơn vị sản xuất và cơ quan nghiên cứu cần phối hợp triển khai nâng quy mô lên men pilot 100 lít và hoàn tất các thử nghiệm tiền lâm sàng, góp phần thúc đẩy tự chủ nguồn men vi sinh probiotic chất lượng cao mang thương hiệu Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Định nghĩa probiotic Probiotic xuất phát từ tiếng Hy Lạp và có nghĩa là "cho cuộc sống", ban đầu được nó được sử dụng với ý nghĩa trái ngược với từ "kháng sinh". Tuy nhiên, định nghĩa này đã được cải tiến trong những năm qua. Ban đầu, probiotic được mô tả là chất tăng cường sức khoẻ của bệnh nhân suy dinh dưỡng, kích thích sự phát triển của các vi sinh vật khác, hoặc góp phần vào cân bằng vi khuẩn đường ruột.

Các định nghĩa gần đây cho thấy rằng probiotic bao gồm các vi sinh vật sống [62]. Trong đó, định nghĩa của Fuller (1992) được sử dụng rộng rãi: “Probiotic như là một chất bổ sung vi sinh vật sống, tác động có lợi đến vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột”. Theo khuyến cáo của một nhóm làm việc cho FAO / WHO về việc đánh giá probiotic trong thực phẩm, probiotic được định nghĩa là "các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp mang lại lợi ích cho sức khoẻ"[23]. Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic [62] Tiêu chuẩn an toàn  Có nguồn gốc rõ ràng.

 Xác định chính xác về phân loại.  Không độc hại, không gây bệnh, đạt tiêu chuẩn GRAS.  Đặc tính chủng: Chịu kháng sinh ở nồng độ thấp và có hoạt động trao đổi chất trong cơ thể vật chủ. Tính phù hợp về công nghệ  Có khả năng sản xuất và bảo quản số lượng lớn  Mật độ cao (ưu tiên 106 -108 CFU/ml,g).

 Mang lại các tính chất cảm quan mong muốn (hoặc không có những phẩm chất không mong muốn).  Ổn định di truyền.  Kháng Phage. 3 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Tiêu chuẩn chức năng  Kháng với muối mật và axit.

 Bám dính được vào bề mặt niêm mạc.  Có khả năng sống sót, tăng sinh và hoạt động trao đổi chất ở vị trí mục tiêu trong cơ thể sống.  Có khả năng sinh bacteriocin, axit hữu cơ và một số các chất kháng khuẩn để cạnh tranh với các vi khuẩn khác.  Có khả năng mang lại một hoặc nhiều lợi ích về sức khoẻ được kiểm chứng lâm sàng.

Tiêu chuẩn sinh lý và ảnh hưởng đến sức khỏe mong muốn  Phản ứng đối với vi khuẩn gây bệnh / ung thư.  Sản sinh các chất chống vi khuẩn (bacteriocin, hydrogen peroxide, axit hữu cơ hoặc hợp chất ức chế khác).  Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vắc-xin, peptide).  Cải thiện các phản ứng miễn dịch.

 Giảm dị ứng lactose.  Giảm cholesterol huyết thanh.  Phòng ngừa một số loại bệnh tiêu chảy. Lợi ích của probiotic Các tác động có lợi cho sức khoẻ của probiotic, được ghi nhận đối với một số chủng nhất định, bao gồm ngăn ngừa một số loại bệnh tiêu chảy, đặc biệt do rotavirus, giảm các triệu chứng liên quan đến việc sử dụng kháng sinh quá nhiều, giảm tỷ lệ dị ứng ở người dễ bị dị ứng, cải thiện đáp ứng miễn dịch, giảm hiện tượng không dung nạp lactose và giảm các chất chuyển hóa không có lợi.

Một số ảnh hưởng có lợi khác liên quan đến sức khoẻ, thông qua việc sử dụng probiotic như sau: phòng ngừa hoặc giảm triệu chứng viêm ruột mạn tính, giảm nguy cơ tiêu chảy cấp ở trẻ em, giảm nguy cơ nhiễm trùng đường hô hấp, ức chế Helicobacter pylori và giảm cholesterol huyết thanh [45]. 4 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Hơn nữa, probiotic có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột và các cơ quan khác bằng cách điều biến các thông số miễn dịch, tính thấm qua ruột hoặc bằng cách cung cấp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học. Các cơ chế được nghiên cứu bởi De Vrese và Schrezenmeir (2008) bao gồm: Giảm pH ruột; Sản xuất các chất diệt khuẩn (ví dụ axit hữu cơ, H2O2 và bacteriocin); Sự kết tụ các vi sinh vật gây bệnh; Tăng cường sự vững chắc cho các chất nền lên men hoặc thụ thể trên bề mặt tế bào niêm mạc ruột; Hấp thu và chuyển hóa các chất có khả năng gây bệnh, độc hại hoặc ung thư; Điều biến các cơ chế miễn dịch; Kích thích nhu động ruột và sản xuất chất nhầy [16]. Giới thiệu Năm 1899, Tissier quan sát và phân lập vi khuẩn hình chữ Y trong phân của trẻ sơ sinh bú mẹ và gọi nó là "Bacillus bifidus communis" (Lat.

Bifidus: đứt đoạn, phân nhánh). Tuy nhiên, do sự tương đồng với lactobacilli, bifidobacteria đã được đưa vào chi Lactobacillus. Và mãi cho đến khi đến khi hệ thống phân loại vi khuẩn mới của Bergey ra đời trong ấn bản cùng tên tái bản lần thứ VIII, chúng mới được phân loại lại và công nhận là một chi riêng. Khác với Lactobacillus, bifidobacteria có fructose-6-phosphate phosphoketolase, không có aldolase hoặc glucose-6-phosphate dehydrogenase và có hàm lượng G+C trong DNA cao nằm trong khoảng từ 55 đến 67%.

Bifidobacteria catalase âm tính, ngoại trừ B. Chi Bifidobacterium, gồm 42 loài, thuộc Họ Bifidobacteriaceae, Bộ Bifidobacteriales, Phân lớp Actinobacteridae, Lớp Actinobacteria, Ngành Firmicutes, Giới Vi khuẩn[7]. Hình thái Bifidobacteria là vi khuẩn Gram dương, sống kỵ khí, không di động, không hình thành bào tử , tế bào thường cong, hình que phân nhánh, dạng đơn lẻ, xếp chuỗi hoặc tạo thành các cụm, dạng chữ “Y” hoặc “V” (Hình 1. 5 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Hình 1.1: Hình dạng tế bào đặc trưng của Bifidobacterium [71] 1.

Sinh học phân tử Phân loại đến chi Bifidobacteria có enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK) (EC 4.22), tham gia vào quá trình phân huỷ glucose qua con đường phosphoketolase hay còn gọi là "bifid shunt" thông qua erythrose-4-phosphate và acetyl-phosphate, đây là điểm khác biệt với vi khuẩn đường ruột khác. Do đó enzyme này cũng như gen mã hóa cho nó được dùng để làm phân tử chỉ thị cho nhóm này [5]. Phân loại đến loài Sự khác biệt của các loài trong chi thường dựa vào sự đồng nhất DNA-DNA hoặc các đặc tính hình thái khác nhau. Trong những năm gần đây, sự chú ý của nhiều nhà khoa học về mặt phân loại đã được thu hút vào các đầu dò DNA và gen rRNA.

Các chuỗi DNA được sử dụng phổ biến nhất để nhận diện bifidobacteria ở chi và mức độ loài là gen 16S rRNA và 23S rRNA, cũng như vùng gen internal transcribed spacer (ITS) nằm giữa các gen rRNA 16S và 23S. Đặc biệt, trình tự rDNA 16S có 9 vùng biến đổi, đặc biệt thích hợp để thiết kế oligonucleotides dùng để định danh đến loài nhóm bifidobacteria. Ngoài ra, ưu điểm của việc sử dụng các gen rRNA là số lượng bản sao của chúng trong một tế bào vi khuẩn khá cao. Roy và cộng sự (1996) đã nghiên cứu thiết kế được các oligonucleotides dựa trên chuỗi 16S rDNA sử dụng cho B.

Sau đó, Matsuki và cộng sự (1998, 1999) đã 6 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội thiết kế được các cặp primer đặc hiệu cho hầu hết các loài Bifidobacterium sống ở đường ruột của con người như: B. Ngoài phân tích trình tự rDNA 16S, SR 23S và 16S-23S, hiện nay để phân biệt các loài có mối quan hệ gần gũi cùng thuộc chi Bifidobacterium, trình tự gen của protein ưa nhiệt 60 kDa (HSP60) được sử dụng. HSP60 là một protein thuộc họ chaperonin, thành viên họ này có trong tất cả các vi khuẩn và tế bào eukaryote ở các cơ quan như ty thể và lục lạp, gen HSP60 không dễ dàng chuyển từ một vi khuẩn này sang vi khuẩn khác, tính bảo thủ cao và có một bản sao trong gần như tất cả các loài vi khuẩn, do đó rất đặc trưng cho từng loài vi khuẩn. Những đặc điểm trên cho thấy HSP60 một đại phân tử thích hợp cho nghiên cứu phát sinh loài của các loài vi khuẩn có mối quan hệ gần gũi với nhau.

7 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Hình 1.2: Cây phát sinh các loài thuộc chi Bifidobacterium dựa trên trình tự rDNA 16S [24] 8 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 1. Môi trường sống Môi trường sống của bifidobacteria chủ yếu là trong đường ruột của động vật máu nóng. Đôi khi chúng là tác nhân gây bệnh ở con người (chủ yếu là sâu răng) nhưng thường chúng được coi là không gây bệnh. Thông thường, các loài Bifidobacterium là đặc trưng đối với người và động vật; Ngoài ra, đã có nghiên cứu chứng minh rằng bifidobacteria có trong nước thải và trong các sản phẩm sữa lên men [6].

Ruột của trẻ sơ sinh bị xâm chiếm bởi vi sinh vật từ hệ sinh dục của người mẹ và môi trường bên ngoài. Ngoài ra, các nghiên cứu mới cho thấy việc di chuyển vi khuẩn từ tuyến ruột sang tuyến vú của người mẹ có thể là nguồn lây nhiễm cho sữa mẹ và dẫn đến sự lây lan sang ruột của trẻ sơ sinh [47]. Các nghiên cứu sử dụng công nghệ lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) cho thấy bifidobacteria chiếm tới 75% tổng số vi khuẩn trong phân của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và đến 91% trẻ bú sữa mẹ [28]. Theo thời gian số lượng bifidobacteria trong đường tiêu hoá của con người giảm dần, các vi sinh vật trong phân của trẻ em tương tự như người lớn sau hai năm đầu đời.

Ở người cao tuổi, số lượng bifidobacteria thấp hơn, trong khi số lượng Clostridium trong phân tăng lên [51]. 9 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Bảng 1.1: Môi trường sống của các loài thuộc chi Bifidobacterium Loài Chủng Nguồn Phân lập từ người B.