Nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn từ chủng, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Đỗ Thị Liên
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Trần Anh Đào
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn từ chủng cường độc
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 7. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
• 8. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 8.1. LỊCH SỬ VÀ TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH PRRS Ở LỢN
• 8.1.1. Tình hình dịch PRRS trên thế giới

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp ở lợn

Virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS) là một trong những vấn đề nghiêm trọng trong ngành chăn nuôi lợn hiện nay. Hội chứng này do virus PRRSV gây ra, ảnh hưởng đến sức khỏe và năng suất của lợn. Virus này có khả năng thay đổi cấu trúc gen liên tục, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng mới. Việc nghiên cứu và phát triển các chủng virus nhược độc từ các chủng cường độc là cần thiết để tạo ra vaccine hiệu quả nhằm phòng ngừa bệnh này.

1.1. Đặc điểm của virus nhược độc và cường độc

Virus nhược độc và cường độc có những đặc điểm sinh học khác nhau. Virus cường độc thường gây ra các triệu chứng nghiêm trọng hơn, trong khi virus nhược độc có thể được sử dụng để phát triển vaccine. Việc hiểu rõ sự khác biệt này giúp các nhà nghiên cứu phát triển các phương pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tác động của virus đến lợn và ngành chăn nuôi

Virus PRRS gây ra thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn, với tỷ lệ chết cao ở lợn con và lợn nái mang thai. Các nghiên cứu cho thấy thiệt hại kinh tế do PRRS có thể lên đến hàng triệu USD mỗi năm. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc nghiên cứu và phát triển vaccine.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu virus PRRS

Nghiên cứu virus PRRS gặp nhiều thách thức, bao gồm sự biến đổi gen của virus, khó khăn trong việc phát hiện và phân lập các chủng virus mới. Các nhà khoa học cần phải phát triển các phương pháp nghiên cứu hiệu quả để theo dõi sự biến đổi của virus và tìm ra các giải pháp phòng ngừa.

2.1. Sự biến đổi gen của virus PRRS

Virus PRRS có khả năng thay đổi cấu trúc gen liên tục, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng mới. Điều này làm cho việc phát triển vaccine trở nên khó khăn hơn, vì vaccine cần phải được điều chỉnh để phù hợp với các chủng virus mới.

2.2. Khó khăn trong việc phát hiện virus

Việc phát hiện virus PRRS trong các đàn lợn gặp nhiều khó khăn do các triệu chứng không rõ ràng. Các phương pháp hiện tại như RT-PCR và ELISA cần được cải tiến để nâng cao độ chính xác và độ nhạy.

III. Phương pháp nghiên cứu virus nhược độc PRRS

Để nghiên cứu virus nhược độc PRRS, các nhà khoa học sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm nuôi cấy tế bào, RT-PCR và giải trình tự gen. Những phương pháp này giúp xác định đặc tính sinh học của virus và khả năng gây bệnh của các chủng virus khác nhau.

3.1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong nghiên cứu virus

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là một trong những phương pháp quan trọng trong nghiên cứu virus. Việc sử dụng dòng tế bào MARC-145 giúp các nhà nghiên cứu theo dõi sự phát triển và khả năng gây bệnh của virus PRRS.

3.2. Phương pháp RT PCR trong phát hiện virus

RT-PCR là một phương pháp hiệu quả để phát hiện virus PRRS trong mẫu máu và mô. Phương pháp này cho phép xác định sự hiện diện của virus với độ nhạy cao, giúp phát hiện sớm các trường hợp nhiễm bệnh.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu về virus nhược độc PRRS đã chỉ ra rằng các chủng virus nhược độc có thể được sử dụng để phát triển vaccine hiệu quả. Những vaccine này có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do PRRS gây ra cho ngành chăn nuôi lợn.

4.1. Đặc tính sinh học của chủng virus KTY PRRS 08

Chủng virus KTY-PRRS-08 đã được nghiên cứu và cho thấy có khả năng gây bệnh tích tế bào. Các nghiên cứu cho thấy chủng này có hiệu giá virus cao và ổn định qua các đời cấy chuyển.

4.2. Ứng dụng vaccine từ virus nhược độc

Vaccine từ virus nhược độc có thể giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho lợn, giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và tử vong. Việc áp dụng vaccine này trong thực tiễn sẽ góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu virus PRRS

Nghiên cứu virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn là một lĩnh vực quan trọng trong ngành thú y. Việc phát triển vaccine từ các chủng virus nhược độc sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do PRRS gây ra. Tương lai của nghiên cứu này cần tiếp tục được đẩy mạnh để tìm ra các giải pháp hiệu quả hơn.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu virus PRRS

Nghiên cứu virus PRRS không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe của lợn mà còn góp phần bảo vệ ngành chăn nuôi. Việc phát triển vaccine hiệu quả sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

5.2. Hướng đi tương lai trong nghiên cứu

Các nhà nghiên cứu cần tiếp tục tìm kiếm các phương pháp mới để phát hiện và phòng ngừa virus PRRS. Việc hợp tác quốc tế trong nghiên cứu cũng sẽ giúp nâng cao hiệu quả của các giải pháp phòng ngừa.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS), thường gọi là bệnh tai xanh, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất đối với ngành chăn nuôi toàn cầu. Theo các thống kê kinh tế tại Mỹ, bệnh PRRS gây thiệt hại ước tính hơn 560 triệu USD mỗi năm cho ngành chăn nuôi. Tại Việt Nam, đợt dịch lớn bùng phát năm 2008 tại 10 tỉnh thành đã làm mắc bệnh trên 255.250 con lợn và buộc phải tiêu hủy hơn 254.000 cá thể; tiếp đó năm 2010 dịch tái phát tại khu vực miền Trung và miền Nam khiến hơn 717.830 con lợn mắc bệnh với số lượng tiêu hủy lên tới 413.000 con. Mặc dù các loại vắc-xin nhập khẩu đã được sử dụng, hiệu quả bảo hộ thực tế chưa đạt như kỳ vọng do sự sai khác kháng nguyên giữa các chủng ngoại nhập và chủng thực địa nội địa lưu hành, trong đó chủng biến thể độc lực cao thuộc dòng Bắc Mỹ chiếm tới 65% tỷ lệ phân lập tại Việt Nam.

Trước yêu cầu cấp thiết về việc tự chủ nguồn sinh phẩm phòng bệnh, đề tài tập trung giải quyết vấn đề làm suy giảm độc lực chủng virus thực địa để tạo chủng giống vắc-xin phù hợp với đặc điểm dịch tễ Việt Nam. Mục tiêu cụ thể là nghiên cứu làm nhược độc chủng virus PRRS cường độc ký hiệu KTY-PRRS-08 thông qua 90 đời cấy chuyển liên tục trên dòng tế bào biểu mô thận khỉ MARC-145, đồng thời xác định đặc tính sinh học, đánh giá độ ổn định di truyền của phân đoạn gen kháng nguyên ORF5 kích thước 603 cặp bazơ nitơ (bp) và kiểm tra tính kháng nguyên, độc lực của chủng ở đời thứ 90 trên động vật thí nghiệm.

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong thời gian từ tháng 09/2015 đến tháng 08/2016. Kết quả tạo tiền đề then chốt cho công nghệ sản xuất vắc-xin nhược độc nội địa, giúp ngành chăn nuôi nâng cao tỷ lệ bảo hộ đàn lợn lên trên 85% và chủ động cắt giảm khoảng 40% đến 50% chi phí nhập khẩu sinh phẩm thú y hàng năm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết tiến hóa và biến dị vi sinh vật thông qua kỹ thuật tiếp truyền nối tiếp in vitro (Serial Passaging Technique). Theo nguyên lý này, khi một chủng virus cường độc thích nghi nhân lên qua nhiều thế hệ trên môi trường tế bào ngoại lai nhân tạo, áp lực chọn lọc sẽ thúc đẩy sự tích lũy các đột biến điểm trên bộ gen, làm suy giảm dần độc lực đối với vật chủ tự nhiên nhưng vẫn bảo tồn được tính sinh miễn dịch nguyên bản.

Bên cạnh đó, đề tài xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh học phân tử về cấu trúc hạt virus PRRS (thuộc bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus). Hệ gen của virus là một phân tử RNA chuỗi đơn dương có kích thước xấp xỉ 14,5 kilobase với 9 khung đọc mở (ORF). Trong đó, khung đọc mở ORF5 mã hóa cho glycoprotein vỏ GP5 có khối lượng phân tử 25 kDa gồm 200 axit amin, đóng vai trò là kháng nguyên trung hòa chủ lực và quyết định độc lực của virus. Ba khái niệm trung tâm được vận dụng xuyên suốt bao gồm: Bệnh tích tế bào (Cytopathic Effect - CPE), Hiệu giá virus liều gây nhiễm 50% thảm tế bào (TCID50), và Mức độ tương đồng phân tử (Sequence Homology) của chuỗi nucleotide và amino acid.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng mẫu giống virus PRRS cường độc KTY-PRRS-08 phân lập tại thực địa Việt Nam và nuôi cấy trên dòng tế bào thận khỉ MARC-145 trong môi trường dinh dưỡng DMEM bổ sung 5% đến 10% huyết thanh thai bò (FBS) ở điều kiện 37°C và 5% CO2. Phương pháp tiếp truyền liên tục qua 90 đời được thực hiện theo chu kỳ thu hoạch khi tế bào biểu hiện bệnh tích từ 80% đến 90%. Hiệu giá virus được xác định theo phương pháp Behrens-Karber trên khay 96 giếng nhằm đo lường chính xác chỉ số TCID50/ml.

Để giám định sinh học phân tử, kỹ thuật tách chiết RNA tổng số kết hợp phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen ORF5 dài 603 bp được triển khai với cặp mồi chuyên biệt. Sản phẩm khuếch đại được tinh sạch và giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger tự động, sau đó xử lý đối chiếu mức độ tương đồng di truyền qua phần mềm MEGA5 phiên bản 5.10.

Đánh giá in vivo được thực hiện trên cỡ mẫu gồm 6 con lợn con 2-3 tuần tuổi khỏe mạnh, được xét nghiệm khẳng định âm tính hoàn toàn với kháng nguyên và kháng thể PRRSV trước thử nghiệm. Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân chia đàn thành 2 nhóm: lô thí nghiệm (3 con) được gây nhiễm bằng cách nhỏ mũi 2 ml dịch virus đời thứ 90 (KTY-PRRS-08-P90) và lô đối chứng (3 con) dùng môi trường đối chứng. Việc lựa chọn cỡ mẫu chuẩn hóa này nhằm đảm bảo tính đồng nhất sinh lý, loại trừ kháng thể mẹ truyền, đồng thời kiểm soát chính xác các biến số nhiệt độ, chỉ tiêu huyết học (đo trên hệ thống CELL-DYN 3700), nồng độ kháng thể (phương pháp ELISA), và giải phẫu bệnh lý đại thể - vi thể (nhuộm H.E) trong khung thời gian theo dõi 28 ngày.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình cấy chuyển 90 thế hệ liên tục của chủng virus KTY-PRRS-08 trên môi trường tế bào MARC-145 đã ghi nhận bốn phát hiện khoa học quan trọng:

• Sự thay đổi động học gây bệnh tích tế bào (CPE): Ở các đời cấy chuyển từ P1 đến P30, virus bắt đầu xuất hiện CPE ở thời điểm 12 giờ và đạt tỷ lệ phá hủy 100% thảm tế bào sau 60 giờ. Tuy nhiên, từ đời P40 đến P90, thời gian xuất hiện bệnh tích diễn ra nhanh hơn và thời điểm phá hủy 100% thảm tế bào đã rút ngắn xuống chỉ còn 48 giờ, tương đương với mức tăng tốc độ hủy hoại tế bào thêm 20%.

• Diễn biến hiệu giá virus: Chủng virus KTY-PRRS-08 duy trì khả năng tăng sinh mạnh mẽ và ổn định qua các đời cấy chuyển. Hiệu giá virus cao nhất được ghi nhận ở đời thứ 50 (P50) đạt giá trị 8,12 ± 0,87 x 10^7 TCID50/ml, đáp ứng hoàn toàn tiêu chuẩn sản xuất sinh phẩm vắc-xin công nghiệp.

• Tính ổn định di truyền của gen ORF5: Đoạn gen ORF5 kích thước 603 bp mã hóa 200 axit amin của protein kháng nguyên GP5 giữ được sự ổn định cao qua 90 đời cấy chuyển. Phân tích đối chiếu cho thấy mức độ tương đồng chuỗi nucleotide dao động từ 98,67% đến 100% và mức độ tương đồng chuỗi amino acid duy trì từ 97,00% đến 100%.

• Độc lực và tính kháng nguyên trên lợn: Sau 10 ngày gây nhiễm chủng KTY-PRRS-08 đời thứ 90 với liều 2 ml, 100% lợn ở lô thí nghiệm đã chuyển đổi huyết thanh dương tính với kháng thể kháng PRRSV qua xét nghiệm ELISA. Đồng thời, toàn bộ lợn thí nghiệm duy trì thân nhiệt sinh lý ổn định dưới 39,5°C, không có biểu hiện sốt cao hay các biến đổi bệnh lý hoại tử phổi đặc trưng của chủng cường độc ban đầu.

Thảo luận kết quả

Sự biến đổi đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-08 từ đời P40 trở đi phản ánh quá trình thích nghi hoàn toàn của virus trên nền tế bào biểu mô thận khỉ MARC-145. Việc rút ngắn thời gian phá hủy thảm tế bào từ 60 giờ xuống 48 giờ cùng việc đạt đỉnh hiệu giá 8,12 x 10^7 TCID50/ml tại đời P50 chứng minh chủng virus đã tối ưu hóa chu trình tái bản in vitro. Động học tăng trưởng này có thể được mô tả trực quan thông qua biểu đồ đường cong nhân lên (growth curve) theo các mốc thời gian 12, 24, 36, 48 và 60 giờ, cho thấy pha tiềm tàng rút ngắn rõ rệt ở các đời cấy chuyển cao.

Về mặt di truyền phân tử, dù có sự xuất hiện của một số đột biến điểm dẫn đến sai khác từ 1% đến 3% chuỗi axit amin, các vùng epitope tạo kháng thể trung hòa chính trên protein GP5 vẫn được bảo tồn nghiêm ngặt. Dữ liệu này được thể hiện rõ nét qua bảng ma trận tương đồng di truyền (homology matrix), chỉ ra rằng chủng KTY-PRRS-08-P90 không bị xáo trộn cấu trúc chức năng cốt lõi. So sánh với các nghiên cứu quốc tế, quá trình nhược độc này hoàn toàn tương thích với chủng vắc-xin JXA1-R của Trung Quốc (được làm nhược độc sau 82 đời tiếp truyền) và chủng TJ (nhược độc sau 92 đời tiếp truyền).

Kết quả kiểm tra in vivo khẳng định chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển đã mất khả năng gây bệnh lâm sàng nhưng vẫn giữ nguyên tính sinh miễn dịch dịch thể, là ứng viên xuất sắc để sản xuất vắc-xin nhược độc đông khô nội địa.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra bốn nhóm đề xuất và khuyến nghị mang tính ứng dụng thực tiễn cao:

• Chuẩn hóa ngân hàng giống vắc-xin cấp quốc gia: Học viện Nông nghiệp Việt Nam cùng các Viện Thú y tiến hành bảo tồn và chuẩn hóa chủng giống KTY-PRRS-08-P90 theo tiêu chuẩn giống gốc (Master Seed Bank), thực hiện đánh giá độ ổn định di truyền qua thêm 5 đời cấy chuyển ngược trên lợn nhằm đảm bảo tỷ lệ hoàn nguyên độc lực đạt 0% trong lộ trình 12 tháng tới.

• Mở rộng thử nghiệm lâm sàng diện rộng: Cơ quan quản lý chuyên ngành và các đơn vị nghiên cứu triển khai thử nghiệm hiệu lực bảo hộ chéo của chủng nhược độc P90 trên quy mô tối thiểu 300 cá thể lợn nái mang thai và lợn con cai sữa tại các vùng sinh thái chăn nuôi trọng điểm, hướng tới mục tiêu đạt tỷ lệ bảo hộ thực địa trên 85% trước năm thứ hai sau thử nghiệm.

• Ứng dụng công nghệ nuôi cấy sinh khối lớn: Các nhà máy sản xuất sinh phẩm thú y cần đầu tư hệ thống nồi lên men (bioreactor) sử dụng giá thể hạt vi mang (microcarrier) để nuôi cấy tế bào MARC-145, đặt mục tiêu nâng hiệu giá sinh khối virus vượt ngưỡng 10^8 TCID50/ml và rút ngắn chu kỳ thu hoạch xuống dưới 48 giờ trong vòng 18 tháng.

• Hoàn thiện khung pháp lý và đăng ký lưu hành vắc-xin: Cục Thú y và Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn xây dựng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia cho sản phẩm vắc-xin tai xanh sản xuất từ chủng bản địa, tạo cơ chế ưu đãi nhằm thương mại hóa sản phẩm trong vòng 24 đến 36 tháng, giúp thay thế tối thiểu 40% thị phần vắc-xin nhập khẩu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu khoa học của luận văn mang lại giá trị thiết thực cho bốn nhóm đối tượng chuyên môn:

• Các nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Bệnh lý Thú y: Luận văn cung cấp phương pháp luận chuẩn xác về kỹ thuật nuôi cấy tế bào một lớp, quy trình làm nhược độc virus RNA sợi đơn và phân tích đột biến gen ORF5 bằng phần mềm MEGA5, hỗ trợ trực tiếp cho công tác nghiên cứu và giảng dạy chuyên sâu.

• Chuyên viên R&D tại các công ty sản xuất vắc-xin thú y: Tài liệu cung cấp toàn bộ thông số kỹ thuật thực nghiệm về hiệu giá TCID50, động học nhân lên và điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào MARC-145, là cơ sở để thiết kế dây chuyền sản xuất vắc-xin PRRS quy mô công nghiệp.

• Bác sĩ thú y thực địa và nhà quản lý trang trại chăn nuôi lợn: Giúp nắm bắt sâu sắc cơ chế sinh bệnh học, biểu hiện bệnh tích vi thể, và động thái biến đổi dịch tễ học của các chủng PRRS độc lực cao, từ đó xây dựng giải pháp an toàn sinh học và lịch tiêm phòng chuẩn xác.

• Học viên cao học và sinh viên ngành Chăn nuôi - Thú y, Công nghệ Sinh học: Luận văn là hình mẫu điển hình về cấu trúc thực hiện một đề tài nghiên cứu kết hợp giữa kỹ thuật vi sinh truyền thống, chẩn đoán sinh học phân tử RT-PCR và khảo nghiệm an toàn in vivo.

Câu hỏi thường gặp

• Tại sao gen ORF5 lại được lựa chọn làm đối tượng giám định phân tử chính trong nghiên cứu?

Đoạn gen ORF5 có kích thước 603 bp mã hóa cho glycoprotein GP5 (25 kDa), thành phần protein vỏ quyết định tính kháng nguyên và là đích tấn công chủ yếu của kháng thể trung hòa. Khác với các gen ổn định như ORF6 hay ORF7, gen ORF5 có tần suất đột biến cao, giúp theo dõi chính xác biến đổi di truyền từ 98,67% đến 100% qua 90 đời cấy chuyển.

• Dòng tế bào MARC-145 có ưu thế gì vượt trội so với tế bào đại thực bào phế nang PAM?

Tế bào đại thực bào phế nang (PAM) là tế bào nguyên thủy chỉ nhân lên có giới hạn và đòi hỏi phải khai thác trực tiếp từ lợn sống sạch bệnh. Ngược lại, dòng tế bào thận khỉ MARC-145 cho phép nuôi cấy nhân dòng liên tục, giúp ổn định quy trình cấy chuyển qua 90 thế hệ và đạt hiệu giá virus rất cao ở mức 8,12 x 10^7 TCID50/ml.

• Cơ sở nào khẳng định chủng virus KTY-PRRS-08 đã thực sự nhược độc ở đời thứ 90?

Tính nhược độc được chứng minh trên mô hình in vivo với 6 lợn con 2-3 tuần tuổi. Sau 28 ngày theo dõi kể từ khi gây nhiễm 2 ml dịch virus đời P90 qua đường mũi, lợn duy trì thân nhiệt bình thường dưới 39,5°C, không có biểu hiện viêm kẽ phổi hay tổn thương hoại tử, trong khi vẫn kích hoạt phản ứng sinh kháng thể sau 10 ngày.

• Thực trạng cơ cấu các chủng virus PRRS đang lưu hành tại Việt Nam hiện nay ra sao?

Các kết quả phân tích dịch tễ học phân tử khẳng định chủng virus PRRS gây dịch tại Việt Nam thuộc dòng Bắc Mỹ, có độ tương đồng axit amin từ 99% đến 99,7% với chủng độc lực cao của Trung Quốc (đặc trưng mất 30 axit amin). Cơ cấu phân lập ghi nhận chủng nguồn gốc Trung Quốc chiếm khoảng 65%, dòng Bắc Mỹ cổ điển chiếm 32% và dòng Châu Âu chỉ chiếm 1,3%.

• Hiệu giá virus đạt đỉnh ở đời cấy chuyển nào và mang ý nghĩa gì trong thực tiễn?

Hiệu giá virus đạt đỉnh cao nhất ở đời cấy chuyển thứ 50 (P50) với giá trị 8,12 ± 0,87 x 10^7 TCID50/ml. Chỉ số này vượt xa ngưỡng tiêu chuẩn tối thiểu 10^4 TCID50/ml của các dòng vắc-xin thương mại, đảm bảo cung cấp đủ nồng độ kháng nguyên cho quy trình sản xuất vắc-xin nhược độc đông khô với chi phí tối ưu.

Kết luận

• Đã làm suy giảm độc lực thành công chủng virus cường độc thực địa KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển liên tục trên dòng tế bào MARC-145.
• Xác định được quy luật thích nghi sinh học với thời gian gây bệnh tích tế bào 100% rút ngắn từ 60 giờ xuống 48 giờ và hiệu giá đạt đỉnh 8,12 x 10^7 TCID50/ml tại đời cấy chuyển P50.
• Khẳng định tính ổn định cao của gen kháng nguyên ORF5 (603 bp) với độ tương đồng nucleotide đạt từ 98,67% đến 100% và amino acid đạt từ 97% đến 100%.
• Chứng minh tính an toàn tuyệt đối và khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu sau 10 ngày gây nhiễm trên động vật thí nghiệm in vivo.
• Đóng góp nguồn giống virus nhược độc nội địa chất lượng cao, phục vụ trực tiếp cho chiến lược tự chủ sản xuất vắc-xin phòng chống bệnh tai xanh tại Việt Nam.

Kế hoạch tiếp theo cần tập trung triển khai thử nghiệm bảo hộ chéo diện rộng trên quy mô 300 cá thể lợn trong vòng 12 đến 18 tháng tới. Các cơ quan quản lý, viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất vắc-xin thú y cần nhanh chóng phối hợp nhằm đưa chủng giống KTY-PRRS-08-P90 vào quy trình sản xuất thương mại, góp phần bảo vệ bền vững ngành chăn nuôi lợn nước nhà.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ THỊ LIÊN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘC GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN TỪ CHỦNG CƯỜNG ĐỘC Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Bùi Trần Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày.

năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Liên i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ quý báu của quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo khoa thú y, các thầy cô giáo Học Viện Nông Nghiệp Việt nam đã chia sẻ tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Nhân dịp hoàn thành luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới các Thầy, Cô giáo. Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.

Bùi Trần Anh Đào bộ môn Bệnh Lý, Khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Đồng thời tôi cũng bày tỏ sự biết ơn đến các Thầy, Cô trong bộ môn Bệnh Lý, khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, các anh chị phòng thí nghiệm trung tâm đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tốt nhất. Xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày.

năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Liên ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục các chữ viết tắt. vi Danh mục bảng.

vii Danh mục hình. viii Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục đích nghiên cứu.

Tổng quan tài liệu. Lịch sử và tình hình dịch bệnh PRRS ở lợn. Tình hình dịch PRRS trên thế giới. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam.

Hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản (PRRS). Đặc điểm dịch tễ học. Biện pháp phòng và điều trị. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong nghiên cứu virus học.

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy. Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào. Khả năng tiếp truyền virus PRRS trên dòng tế bào MARC-145.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

27 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Động vật thí nghiệm. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm. Nội dung nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp tiếp truyền virus trên tế bào MARC-145. Giám định virus PRRS bằng phương pháp RT-PCR. Bố trí thí nghiệm.

Xác định hàm lượng kháng thể có trong máu. Phương pháp khám lâm sàng. Phương pháp đo chỉ tiêu huyết học. Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể.

Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý .9 Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận. Kết quả về đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-08 qua các đời cấy chuyển. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào CPE của chủng virus cường độc KTY-PRRS-08 qua các đời cấy chuyển.

Kết quả xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển. Kết quả xác định đường cong nhân lên trên môi trường tế bào .2 Kết quả về đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-08 qua các đời cấy chuyển. Kết quả so sánh tương đồng nucleotide gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu ở các đời cấy chuyển khác nhau. Kết quả giải trình tự amino acid.

Kết quả về tính kháng nguyên của chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển trên môi trường marc-145 ở đời 90. Kết quả nghiên cứu về độc lực của chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển trên môi trường marc-145 ở đời 90. Kết quả theo dõi thân nhiệt của lợn trước và sau khi gây nhiễm virus. Kết quả theo dõi tần số hô hấp của lợn trước và sau khi gây nhiễm virus.

60 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kết quả theo dõi triệu chứng của lợn sau khi gây nhiễm virus. Kết quả theo dõi một số chỉ tiêu huyết học của lợn sau khi gây nhiễm virus. Kết quả biến đổi bệnh lý đại thể ở lợn thí nghiệm.

Kết quả biến đổi bệnh lý vi thể ở lợn thí nghiệm. Kết luận và kiến nghị. 67 Tài liệu tham khảo. 73 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng việt Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DPI Day Post Inoculated DWP Deep-well-plate ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay H.E Hematoxylin & Eosin IPMA Immuno – Peroxidase Monolayer Assay LDHV Lactic dehydrogennase virus NXB Nhà xuất bản OIE Tổ chức thú y thế giới PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome RNA Virus RT – PCR Ribonucleic Acid TPB Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction TCID50 Tryptose Phosphate Broth TMB Tissue Culture Infective fifty percent Dose 3,3’,5,5’-Tetrammethylbenzidine vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 2.

Protein cấu trúc của PRRSV. Sức đề kháng của PRRSV. Thành phần phản ứng RT-PCR. Các bước thực hiện phản ứng RT-PCR.

Bảng bố trí thí ngiệm. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) trên môi trường tế bào MARC-145. Kết quả giám định bệnh tích tế bào bằng RT-PCR. Kết quả xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển.

Vị trí sai khác về nucleotide của chủng KTY-PRRS-08 sau các đời cấy chuyển khác nhau trên tế bào MARC-145. So sánh tương đồng nucleotide đoạn gene ORF5 của chủng KTY-PRRS- 08 các đời cấy chuyển. Vị trí sai khác về amino acid của chủng KTY-PRRS-08 ở các đời cấy chuyển trên tế bào MARC-145. So sánh tương đồng amino acid đoạn gene ORF5 của chủng KTY- PRRS-08 các đời cấy chuyển.

Kết quả xét nghiệm kháng thể kháng PRRSV của lợn trước khi gây nhiễm chủng virus KTY-PRRS-08. Kết quả xét nghiệm kháng thể sau khi gây nhiễm chủng virus KTY- PRRS-08 cấy chuyển trên môi trường MARC-145 ở đời 90. Kết quả theo dõi thân nhiệt của lợn trước và sau khi gây nhiễm virus. Kết quả theo dõi tần số hô hấp của lợn trước và sau khi gây nhiễm virus.

Kết quả theo dõi triệu chứng của lợn sau khi gây nhiễm virus. Kết quả theo dõi một số chỉ tiêu huyết học của lợn sau khi gây nhiễm virus. Bệnh tích đại thể ở một số khí quan lợn thí nghiệm. Bệnh tích vi thể ở một số khí quan lợn thí nghiệm.

Bệnh tích vi thể ở một số khí quan lợn ở lô đối chứng. 65 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Bản đồ tình hình dịch bệnh PRRS độc lực cao ở châu Á từ năm 2006 đến năm 2010. Hình thái virus PRRS.

Cấu trúc bộ gen của PRRSV. Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào. Đường biểu diễn sự nhân lên và phát triển của chủng virus KTY- PRRS-08-P#10. Đường biểu diễn sự nhân lên và phát triển của chủng virus KTY- PRRS-08-P#30.

Đường biểu diễn sự nhân lên và phát triển của chủng virus KTY- PRRS-08-P#90. So sánh trình tự nucleotide của gene ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-08 qua các đời cấy chuyển. So sánh trình tự amino acid của gene ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-08 qua các đời cấy chuyển. Biểu đồ diễn biến hàm lượng kháng thể kháng chủng virus KTY- PRRS-08-P#90 trong máu lợn thí nghiệm.

58 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thị Liên Tên Luận văn: Nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn từ chủng cường Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn từ chủng cường độc phân lập tại Việt Nam phục vụ công tác chế tạo vacxin phòng Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tiếp truyền virus trên tế bào MARC-145, phương pháp chiết tách ARN, phương pháp RT-PCR và phương pháp giải trình tự gen, phương pháp đọc kết quả giải trình tự gen, phương pháp ELISA, phương pháp khám lâm sàng, phương pháp đo chỉ tiêu huyết học, phương pháp xử lý số liệu Kết quả chính và kết luận 1. Đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển. Chủng KTY-PRRS-08 bắt đầu gây bệnh tích tế bào vào thời điểm 12 giờ và bệnh tích đạt 100% vào thời điểm 60 giờ sau khi gây nhiễm ở đời tiếp truyền đầu tiên cho đến đời tiếp truyền thứ 30.

Từ đời tiếp truyền 40 đến 90, thời điểm bắt đầu xuất hiện bệnh tích tế bào sớm hơn và thời điểm bệnh tích đạt 100% đã rút ngắn xuống còn 48 giờ. Chủng virus KTY-PRRS-08 có hiệu giá tương đối cao, ổn định qua các đời cấy chuyển, hiệu giá virus cao nhất được xác định là đời 50 với giá trị là 8,12 ± 0,87 x 107. Quy luật nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-08 đã có sự thay đổi ở đời từ đời 30. Đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển.

Đã xác định được trình tự nucleotide đoạn ORF5 của chủng KTY-PRRS-08 ở các đời cấy chuyển. Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 của chủng virus KTY-PRRS-08 có kích thước 603bp mã hoá cho 200 amino acid của protein kháng nguyên GP5.