Nghiên cứu và phân tích cellulase trong Bacillus sp.

Nghiên cứu screening và đặc trưng hóa cellulase trong Bacillus sp, góp phần phát triển ứng dụng enzyme trong công nghiệp sinh học.

• Tác giả: Samley Mam
• Người hướng dẫn: Dr. Nguyen Thi Thanh Thuy
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Food Technology
• Đề tài: Screening And Characterization Of Cellulase In Bacillus Sp.
• Loại tài liệu: Thesis
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• DECLARATION
• ACKNOWLEDGEMENT
• TABLE OF CONTENTS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• THESIS ABSTRACT
• 1. PART I – INTRODUCTION
• 2. PART II – LITERATURE REVIEW
• 2.1. General information of cellulase
• 2.2. Classification of cellulase
• 2.3. Applications of cellulases in the industries
• 2.4. Microbial sources of cellulases
• 2.5. Factors affect for cellulase production by Bacilli and characterization of enzyme
• 2.6. General information of Bacillus sp. and their cellulase production ability
• 2.7. Factors affect the cellulase production ability of Bacillus sp.
• 2.8. Characterization of cellulase produced by Bacillus sp.
• 3. PART III - MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Bacterial screening and characterization
• 4. RESULTS AND DISCUSSIONS
• 4.1. Screening Bacillus sp. producing cellulase bacteria
• 4.2. Identification of selected Bacillus sp.
• 4.3. Sequencing of 16S rDNA gene
• 4.4. Cellulase production of Bacillus pumilus B6
• 4.5. Characterization of cellulase activity of Bacillus pumilus B6
• 4.6. Effect of optimal temperature for cellulase activity
• 4.7. Effect of optimal pH for cellulase activity
• 4.8. Thermal stability on cellulase activity

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu cellulase từ Bacillus sp

Nghiên cứu về cellulase từ Bacillus sp. đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trong những năm gần đây. Cellulase là một loại enzyme quan trọng trong quá trình phân hủy cellulose, một thành phần chính của thành tế bào thực vật. Việc tìm kiếm và phân tích cellulase từ Bacillus sp. không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của enzyme này mà còn mở ra nhiều ứng dụng trong công nghiệp và nông nghiệp.

1.1. Đặc điểm và phân loại cellulase

Cellulase được phân loại thành ba loại chính: endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Mỗi loại enzyme này có vai trò riêng trong quá trình phân hủy cellulose. Endoglucanase cắt đứt liên kết glycosidic bên trong chuỗi cellulose, trong khi exoglucanase cắt từ đầu chuỗi. β-glucosidase giúp chuyển đổi cellobiose thành glucose, tạo ra nguồn năng lượng cho vi sinh vật.

1.2. Tầm quan trọng của Bacillus sp. trong sản xuất cellulase

Các loài Bacillus có khả năng sản xuất cellulase cao, đặc biệt là trong điều kiện nuôi cấy thích hợp. Chúng có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng công nghiệp như sản xuất biofuel, chế biến thực phẩm và xử lý chất thải. Việc nghiên cứu Bacillus sp. giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme này.

II. Thách thức trong việc sản xuất cellulase từ Bacillus sp

Mặc dù Bacillus sp. có tiềm năng lớn trong sản xuất cellulase, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Các yếu tố như nhiệt độ, pH và thành phần môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến hiệu suất sản xuất enzyme. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là rất cần thiết để đạt được năng suất cao nhất.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của cellulase. Nghiên cứu cho thấy rằng Bacillus pumilus có hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 55°C và pH 6. Việc duy trì các điều kiện này trong quá trình sản xuất là rất quan trọng để đảm bảo hiệu suất cao.

2.2. Khó khăn trong việc tối ưu hóa quy trình sản xuất

Quy trình sản xuất cellulase từ Bacillus sp. thường gặp khó khăn trong việc duy trì ổn định hoạt tính enzyme. Các yếu tố như sự cạnh tranh giữa các vi sinh vật khác và sự thay đổi trong môi trường nuôi cấy có thể làm giảm hiệu suất sản xuất. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra giải pháp khắc phục.

III. Phương pháp nghiên cứu cellulase từ Bacillus sp

Nghiên cứu về cellulase từ Bacillus sp. thường sử dụng các phương pháp như nuôi cấy vi sinh vật, phân lập enzyme và phân tích hoạt tính enzyme. Các phương pháp này giúp xác định khả năng sản xuất cellulase của các chủng vi sinh vật khác nhau và tối ưu hóa quy trình sản xuất.

3.1. Phương pháp nuôi cấy và phân lập Bacillus sp.

Việc nuôi cấy Bacillus sp. được thực hiện trong môi trường thích hợp để kích thích sản xuất cellulase. Sau đó, các chủng vi sinh vật được phân lập và xác định thông qua phương pháp PCR và giải trình tự gen 16S rDNA.

3.2. Phân tích hoạt tính cellulase

Hoạt tính của cellulase được xác định thông qua các phương pháp đo lường như phương pháp DNS. Các yếu tố như nhiệt độ, pH và thời gian ủ cũng được kiểm tra để xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme.

IV. Ứng dụng thực tiễn của cellulase từ Bacillus sp

Sản phẩm cellulase từ Bacillus sp. có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Từ chế biến thực phẩm đến sản xuất biofuel, enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện hiệu suất và chất lượng sản phẩm.

4.1. Ứng dụng trong ngành thực phẩm

Trong ngành thực phẩm, cellulase được sử dụng để cải thiện quá trình chế biến và tăng cường hương vị. Enzyme này giúp phân hủy cellulose trong thực phẩm, làm tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ dinh dưỡng.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất biofuel

Sản xuất biofuel từ cellulose là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của cellulase. Enzyme này giúp chuyển đổi cellulose thành glucose, từ đó tạo ra ethanol và các loại nhiên liệu sinh học khác, góp phần vào việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu cellulase từ Bacillus sp

Nghiên cứu về cellulase từ Bacillus sp. đang mở ra nhiều triển vọng mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng enzyme này sẽ góp phần vào sự phát triển bền vững trong nhiều ngành công nghiệp.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các chủng Bacillus mới có khả năng sản xuất cellulase cao hơn. Đồng thời, việc ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và nâng cao hiệu suất enzyme.

5.2. Tác động đến ngành công nghiệp

Sự phát triển của cellulase từ Bacillus sp. sẽ có tác động tích cực đến nhiều ngành công nghiệp, từ thực phẩm đến năng lượng tái tạo. Điều này không chỉ giúp cải thiện hiệu suất sản xuất mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường enzyme công nghiệp toàn cầu ghi nhận quy mô thương mại đạt khoảng 4,5 đến 5,0 tỷ USD, trong đó enzyme cellulase chiếm khoảng 20% tổng thị phần nhờ vai trò trung tâm trong quá trình thủy phân sinh khối lignocellulose. Nhu cầu ứng dụng cellulase ngày càng tăng cao trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm, dệt nhuộm, sản xuất giấy, xử lý thức ăn chăn nuôi và chuyển hóa nhiên liệu sinh học. Tuy nhiên, phần lớn chế phẩm cellulase thương mại hiện nay có nguồn gốc từ nấm sợi với chu kỳ sinh trưởng dài, nhạy cảm với biến đổi nhiệt độ và khó thao tác di truyền quy mô lớn.

Xuất phát từ thực tiễn đó, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam tập trung giải quyết bài toán sàng lọc và đánh giá đặc tính sinh hóa của cellulase ngoại bào từ vi khuẩn chi Bacillus. Mục tiêu cụ thể là tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh mẽ, định danh phân tử bằng trình tự gen 16S rDNA và xác định các thông số động học enzyme then chốt gồm nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu cùng độ bền nhiệt và độ bền pH.

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm trong giai đoạn năm 2016 - 2017 tại Khoa Công nghệ Thực phẩm và Phòng thí nghiệm Trung tâm của Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả đã sàng lọc thành công chủng Bacillus pumilus B6.4 đạt chứng nhận an toàn sinh học GRAS từ Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), sở hữu hoạt tính enzyme thô và tinh sạch sơ bộ đạt 3,027 U/ml, hoạt động bền bỉ ở nhiệt độ 55°C và duy trì trên 58% hoạt tính sau 150 phút ủ nhiệt. Đóng góp này mở ra giải pháp sinh học giá trị cao nhằm thay thế hóa chất độc hại, nâng cao hiệu suất thủy phân cellulose trong ngành công nghệ thực phẩm và công nghiệp chế sinh học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết phân giải xúc tác sinh học của phức hệ enzyme cellulase (EC 3.2.1.x), bao gồm ba nhóm enzyme hoạt động hiệp đồng đồng bộ để phân cắt liên kết beta-1,4-glycosidic trong phân tử cellulose:

• Endoglucanase (EC 3.2.1.4): Cắt ngẫu nhiên các liên kết nội mạch tại các vùng vô định hình của sợi cellulose, làm giảm nhanh độ nhớt cơ chất và giải phóng các đoạn oligomer ngắn.
• Exoglucanase hay Cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91): Tấn công từ đầu khử hoặc đầu không khử của chuỗi glucan, giải phóng đơn vị disaccharide cellobiose.
• Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21): Thủy phân cellobiose và các cellodextrin mạch ngắn tan trong nước thành các phân tử đơn phân D-glucose tự do.

Khung lý thuyết phân loại vi sinh vật hiện đại kết hợp phương pháp quan sát hình thái tế bào học, đặc tính sinh lý vi sinh vật với mô hình giải trình tự vùng gen 16S rDNA bảo tồn (kích thước khoảng 1,5 kb) và dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp ghép nối láng giềng (Neighbor-Joining). Ngoài ra, nghiên cứu tích hợp tiêu chuẩn an toàn vi sinh vật thực phẩm GRAS (Generally Recognized As Safe) nhằm đảm bảo chế phẩm enzyme không chứa độc tố vi khuẩn nguy hại.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 100 chủng vi khuẩn Bacillus thuần khiết được thu thập từ hai hệ sinh thái tự nhiên giàu hoạt tính phân giải sinh học: sản phẩm lên men truyền thống tương ớt Mường Khương và dịch dạ cỏ bò.

Quy trình nghiên cứu được triển khai tuần tự theo ba giai đoạn:

1. Sàng lọc định tính: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch trên đĩa môi trường MT2 bổ sung 2% cơ chất Carboxymethyl Cellulose (CMC). Hoạt tính enzyme được phát hiện qua phản ứng nhuộm bề mặt bằng dung dịch Lugol 1% trong 15 phút, đo đường kính vòng phân giải sáng (D - d, tính bằng mm). Phương pháp này cho phép đánh giá sơ bộ nhanh chóng số lượng mẫu lớn.
2. Định danh phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB, khuếch đại gen 16S rDNA qua phản ứng PCR với cặp mồi phổ biến 8F và 1492R. Chu trình nhiệt gồm 35 chu kỳ biến tính ở 94°C (45 giây), gắn mồi ở 55°C (60 giây) và kéo dài ở 72°C (60 giây). Sản phẩm tinh sạch được giải trình tự Sanger, so đối chiếu cơ sở dữ liệu NCBI BLAST và phân tích quan hệ di truyền qua phần mềm TreeView.
3. Định lượng hoạt tính và khảo sát đặc tính enzyme: Lên men chìm trong môi trường lỏng MT1 ở 37°C trong 36 giờ, thu dịch chiết enzyme thô qua ly tâm 6.000 vòng/phút ở 4°C trong 15 phút. Tinh sạch sơ bộ bằng kết tủa phân đoạn cồn 96% theo tỷ lệ thể tích 1:4. Hoạt tính cellulase được định lượng chuẩn xác bằng phương pháp quang phổ đo lượng đường khử giải phóng qua phản ứng với thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) ở bước sóng 540 nm đối chiếu đường chuẩn glucose. Nhiệt độ tối ưu được thử nghiệm từ 40°C đến 80°C, pH tối ưu khảo sát từ 5,0 đến 8,0 và độ bền nhiệt, bền pH được theo dõi trong khoảng thời gian từ 30 đến 240 phút.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc 100 chủng Bacillus trên đĩa thạch CMC phân bố đường kính vòng phân giải từ 3 mm đến 24 mm với tỷ lệ cụ thể:

• Nhóm vòng phân giải 0 - 5 mm chiếm 5% tổng số chủng (2% từ tương ớt, 3% từ dạ cỏ bò).
• Nhóm vòng phân giải 6 - 10 mm chiếm 27% (7% từ tương ớt, 20% từ dạ cỏ bò).
• Nhóm vòng phân giải 11 - 15 mm chiếm tỷ lệ cao nhất với 34% (11% từ tương ớt, 23% từ dạ cỏ bò).
• Nhóm vòng phân giải 16 - 20 mm đạt 25% (6% từ tương ớt, 19% từ dạ cỏ bò).
• Nhóm vòng phân giải mạnh 21 - 25 mm chiếm 9% (2% từ tương ớt, 7% từ dạ cỏ bò).

Trong đó, có 3 chủng thể hiện vòng phân giải cực đại đạt 24 mm gồm A1.2, A1.8 và B6.4. Kết quả phân tích trình tự 16S rDNA xác định chủng A1.2 tương đồng 97% với Bacillus cereus, chủng A1.8 tương đồng 99% với Bacillus cereus, và chủng B6.4 đạt độ tương đồng 97% với Bacillus pumilus. Do Bacillus pumilus thuộc nhóm chủng vi sinh vật an toàn sinh học GRAS, chủng B6.4 đã được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu sâu.

Hoạt tính cellulase của chủng Bacillus pumilus B6.4 sau tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 96% đạt mức 3,027 U/ml. Khảo sát động học cho thấy nhiệt độ tối ưu của enzyme đạt 55°C (hoạt tính tương đối đạt 100%), duy trì mức hoạt tính cao trong dải nhiệt 50 - 60°C (đạt 78% tại 50°C và 75% tại 60°C), giảm xuống 66% tại 40°C và còn 20% ở 80°C. Về mặt ion hydro, pH tối ưu của enzyme là 6,0; hoạt tính giữ mức 87% tại pH 7,0 nhưng giảm mạnh xuống còn 36% tại pH 8,0.

Về độ bền nhiệt, enzyme duy trì trên 58% hoạt tính ban đầu trong khoảng nhiệt độ từ 55°C đến 65°C sau 150 phút ủ nhiệt ở pH 5,0 và vẫn giữ trên 40% hoạt tính sau 240 phút. Về độ bền pH, enzyme duy trì trên 56% hoạt tính ở dải pH 5,5 đến 6,5 sau 120 phút ở 40°C và duy trì trên 21% sau 240 phút.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất sinh tổng hợp cellulase vượt trội của chủng Bacillus pumilus B6.4 (3,027 U/ml) cao hơn đáng kể khi so sánh với nhiều công bố quốc tế về các chủng cùng chi, chẳng hạn như Bacillus velezensis (khoảng 0,45 U/ml), Bacillus safensis (0,233 U/ml) hay Bacillus subtilis CY5 (0,57 U/ml). Sự chênh lệch này bắt nguồn từ sự thích nghi chuyển hóa đặc thù của hệ vi sinh vật đường ruột động vật nhai lại, nơi có mật độ xơ thô thực vật cao kích thích biểu hiện mạnh mẽ các operon mã hóa enzyme phân giải cellulose ngoại bào.

Đặc tính xúc tác tối ưu ở 55°C cùng vùng pH hơi acid (pH 6,0) của cellulase từ Bacillus pumilus B6.4 có ý nghĩa công nghệ to lớn. Cấu trúc không gian của enzyme duy trì được độ linh động của trung tâm hoạt động ở nhiệt độ cao nhờ mạng lưới liên kết hydro và cầu muối nội phân tử vững chắc. Khi nhiệt độ vượt quá 70°C, các liên kết yếu bị bẻ gãy dẫn đến sự biến tính cấu trúc bậc ba và làm mất hoạt tính xúc tác.

Toàn bộ diễn biến động học enzyme được trực quan hóa mạch lạc qua các đồ thị phân bố đường cong Gauss của nhiệt độ và pH, cây phát sinh loài Neighbor-Joining và biểu đồ đường thể hiện tỷ lệ hoạt tính tồn dư theo thời gian ủ nhiệt từ 0 đến 240 phút. Dữ liệu này chứng minh chế phẩm enzyme có khả năng chịu nhiệt và thích ứng acid tốt, đáp ứng hoàn hảo yêu cầu kỹ thuật của quy trình đường hóa sinh khối công nghiệp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa môi trường lên men quy mô bán công nghiệp: Triển khai nghiên cứu mở rộng quy mô nuôi cấy chủng Bacillus pumilus B6.4 trên hệ thống Bioreactor từ 50 lít đến 500 lít, tận dụng các nguồn phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ như bã mía, rơm rạ tiền xử lý và cám gạo. Mục tiêu nâng cao hoạt tính enzyme dịch thô lên trên 5,5 U/ml trong thời gian 6 đến 12 tháng do nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm lên men chủ trì.
2. Phát triển công nghệ cố định enzyme trên giá thể: Ứng dụng các vật liệu mang sinh học như hạt natri alginate, chitosan hoặc vật liệu nano từ tính để cố định cellulase, nhằm nâng cao độ bền nhiệt của enzyme lên mức 70°C và kéo dài khả năng tái sử dụng qua hơn 10 chu kỳ phản ứng liên tục. Lộ trình thực hiện trong vòng 12 đến 18 tháng do các kỹ sư công nghệ enzyme thực hiện.
3. Thử nghiệm ứng dụng trong làm trong nước quả và sản xuất cồn sinh học: Tiến hành thử nghiệm đưa chế phẩm enzyme B6.4 vào quy trình trích ly, làm trong nước ép trái cây có múi và quá trình đường hóa bã ngô phục vụ lên men bio-ethanol, đặt chỉ tiêu tăng hiệu suất thu hồi đường khử lên trên 75% trong vòng 12 tháng tại các trung tâm R&D doanh nghiệp chế biến.
4. Giải trình tự toàn bộ hệ gen và biểu hiện gen tái tổ hợp: Thực hiện giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) của chủng Bacillus pumilus B6.4 nhằm xác định chính xác cụm gen mã hóa endoglucanase, tiến hành nhân dòng và biểu hiện dị phân trên các chủng chủ công nghiệp như Bacillus subtilis hoặc Pichia pastoris trong vòng 18 đến 24 tháng bởi các viện nghiên cứu chuyên ngành.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Giảng viên và nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về quy trình phân lập vi sinh vật từ các nguồn mẫu tự nhiên đặc thù, kỹ thuật sinh học phân tử 16S rDNA và phương pháp phân tích động học enzyme chuẩn hóa.
• Kỹ sư R&D trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và đồ uống: Nắm bắt thông số tối ưu về nhiệt độ 55°C và pH 6,0 của enzyme cellulase an toàn GRAS để ứng dụng trực tiếp vào quy trình làm trong nước quả, giảm độ nhớt dịch hèm bia và nâng cao chất lượng chiết xuất thực vật.
• Doanh nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học và thức ăn chăn nuôi: Tham khảo giải pháp enzyme phân giải sinh khối thực vật, bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho động vật đơn dịch nhằm tăng tỷ lệ tiêu hóa xơ và cải thiện hiệu suất chuyển hóa thức ăn.
• Học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh học: Tài liệu tham khảo học thuật giá trị về phương pháp luận thiết kế thí nghiệm, kỹ năng xử lý số liệu quang phổ DNS và xây dựng báo cáo khoa học theo chuẩn mực quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao chủng Bacillus pumilus B6.4 lại được ưu tiên lựa chọn thay vì hai chủng Bacillus cereus A1.2 và A1.8 dù có cùng đường kính vòng phân giải 24 mm? Chủng Bacillus pumilus được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận thuộc nhóm an toàn sinh học GRAS, hoàn toàn không sinh độc tố gây ngộ độc đường tiêu hóa. Ngược lại, Bacillus cereus là vi khuẩn có nguy cơ sinh độc tố nôn và tiêu chảy cao, không phù hợp cho các ứng dụng thực phẩm và dinh dưỡng.

Phương pháp định lượng hoạt tính cellulase bằng thuốc thử DNS có ưu điểm gì so với phương pháp đo độ nhớt? Phương pháp DNS đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 540 nm phản ánh trực tiếp và chính xác nồng độ nhóm đường khử tự do giải phóng từ cơ chất CMC, thiết lập mối quan hệ tuyến tính với hoạt độ enzyme theo đơn vị quốc tế (U/ml). Phương pháp đo độ nhớt chỉ phản ánh sự đứt gãy mạch cơ học mà không định lượng được sản phẩm đường hóa cụ thể.

Hoạt tính enzyme 3,027 U/ml của chủng B. pumilus B6.4 có ý nghĩa thực tiễn như thế nào khi so với các nghiên cứu trước đây? Hoạt tính 3,027 U/ml của chủng B6.4 cao gấp 6 đến 13 lần so với các chủng Bacillus velezensis (0,45 U/ml) và Bacillus safensis (0,233 U/ml). Năng lực sinh enzyme cao này giúp rút ngắn thời gian lên men, giảm chi phí tinh chế và nâng cao tính khả thi khi thương mại hóa chế phẩm.

Đặc tính bền nhiệt ở 55 đến 65 độ C trong 150 phút mang lại lợi ích gì trong quy trình sản xuất công nghiệp? Nhiệt độ phản ứng 55 - 65°C giúp tăng tốc độ khuếch tán cơ chất, giảm độ nhớt của dịch huyền phù sinh khối và hạn chế tối đa nguy cơ nhiễm tạp các vi sinh vật ưa ấm thông thường trong suốt quá trình thủy phân công nghiệp quy mô lớn.

Nguồn mẫu từ dạ cỏ bò đóng góp gì vào việc phát hiện chủng vi khuẩn phân giải cellulose mạnh? Dạ cỏ bò là môi trường lên men kỵ khí tự nhiên chứa hệ vi sinh vật cộng sinh phân giải xơ thực vật hoàn hảo nhất. Chủng Bacillus pumilus B6.4 phân lập từ dạ cỏ sở hữu hệ gen mã hóa enzyme cellulase có hoạt lực phân cắt liên kết beta-glucan mạnh mẽ, thích nghi với điều kiện giàu chất hữu cơ phức tạp.

Kết luận

• Luận văn đã hoàn thành xuất sắc việc sàng lọc 100 chủng vi khuẩn Bacillus từ tương ớt Mường Khương và dạ cỏ bò, tuyển chọn được 3 chủng thể hiện vòng phân giải CMC đạt cực đại 24 mm.
• Ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự gen 16S rDNA để định danh chủng ưu việt Bacillus pumilus B6.4 với độ tương đồng 97%, đáp ứng tiêu chuẩn an toàn sinh học GRAS trong công nghệ thực phẩm.
• Xác định hoạt tính enzyme cellulase đạt 3,027 U/ml, hoạt động tối ưu tại nhiệt độ 55°C và pH 6,0, thể hiện tính chất của một endoglucanase chịu nhiệt và ưa acid nhẹ.
• Khẳng định độ bền nhiệt vượt trội với khả năng duy trì trên 58% hoạt tính sau 150 phút ở 55 - 65°C và độ bền pH trên 56% sau 120 phút ở pH 5,5 - 6,5.
• Đóng góp nguồn giống vi sinh vật bản địa quý giá cùng quy trình công nghệ tạo chế phẩm sinh học phục vụ đắc lực cho công nghiệp chế biến thực phẩm và chuyển hóa phụ phẩm nông nghiệp bền vững.

Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm đến việc nhận chuyển giao chủng giống vi sinh vật hoặc mở rộng hợp tác ứng dụng chế phẩm cellulase từ Bacillus pumilus B6.4 có thể kết nối trực tiếp với Bộ môn Quản lý Chất lượng và An toàn Thực phẩm, Khoa Công nghệ Thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam để triển khai các dự án R&D chuyên sâu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE SAMLEY MAM SCREENING AND CHARACTERIZATION OF CELLULASE IN BACILLUS sp. Student: Samley MAM Student code: 24181065 Supervisor: Dr. Nguyen Thi Thanh Thuy Department: Food safety and Quality management - VNUA AGRICULTURAL UNIVERSITY PRESS - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DECLARATION This thesis contains no material that has been accepted for the award of any other degree or diploma in any educational institution and, to the best of my knowledge and belief, it contains no material previously published or written by other person, except where due to reference is made in the text of the thesis. Hanoi, May 10th, 2017 Master candidate Samley MAM i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ACKNOWLEDGEMENT First of all, I would like to sincerely thank the Vietnam National University of Agriculture (VNUA) in Vietnam, in particular the Faculty of Food Science and Technology, for providing all the conditions leading to this thesis and allowing me to follow the program Food Technology that financially supported by Académie de Recherche et d’Enseignement Supérieur – Commission de la Cooperation au Dévelopement (ARES-CCD).

I express my gratitude to my supervisor Dr. Nguyen Thi Thanh Thuy, for being my mentor during my thesis research on “Screening and characterization of cellulase in Bacillus sp. Especially, I would like to acknowledge her precious advices, the very helpful discussions, and good explanation with her friendly encouragement. I am very grateful to Ms.

Trinh Thi Thu Thuy for being my co-supervisor an offering me the great opportunity to perform my master work in her laboratory. On the other hand, I really sincerely thank for her great support not only the idea but also her value time to solve the problem that incidentally faced during this research. I particularly thank her for sharing her well-guided expertise in the field of characterization of cellulolytic enzyme, and for giving assistance supported. I would like to offer a big thank to Dr.

Nguyen Hoang Anh, head of Central Laboratory, gave me a lot of advice and suggestion for my methodology. Last but not least, I am deeply grateful to my beloved parents, namely, Mr. SVAY KOU, Mrs. SOUT HUN, and my beloved siblings.

This successful result could not be obtained if without their encouragement and support. Hanoi, May 10th, 2017 Master candidate Samley MAM ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TABLE OF CONTENTS DECLARATION. ii TABLE OF CONTENTS. iii LIST OF TABLES.

v LIST OF FIGURES. vi THESIS ABSTRACT. vii PART I – INTRODUCTION. 2 PART II –LITERATURE REVIEW.

General information of cellulase. Classification of cellulase. Applications of cellulases in the industries. Microbial sources of cellulases.

Factors affect for cellulase production by Bacilli and characterization of enzyme. General information of Bacillus sp. and their cellulase production ability. Factors affect the cellulase production ability of Bacillus sp.

Characterization of cellulase produced by Bacillus sp. 18 PART III - MATERIALS AND METHODS. 20 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Bacterial screening and characterization.

RESULTS AND DISCUSSIONS. Screening Bacillus sp. producing cellulase bacteria. Identification of selected Bacillus sp.

Sequencing of 16S rDNA gene. Cellulase production of Bacillus pumilus B6. Characterization of cellulase activityof Bacillus pumilus B6. Effect of optimal temperature for cellulase activity.

Effect of optimal pH for cellulase activity. Thermal stability on cellulase activity. 47 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LIST OF TABLES Table 2. Cellulase producing fungal strains.

Cellulase producing by bacterial strains. Optimum temperature and pH of enzyme produced by Bacillus sp. Clear zone of cellulase produced by 100 strains of Bacillus sp. Ratio of clear zone category .Thermal stability in enzyme activity (U/ml).

pH stability in enzyme activity (U/ml). 35 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LIST OF FIGURES Figure 2. Efficiency in cooperation of members of cellulase enzyme system. Diagram for bacterial characterization.

Screening cellulase production by the agar-well diffusion method. Biggest clear zone of collection strains of A1. Cell morphology of strains A1. Phylogenetic tree of Bacillus cereus A1.

Phylogenetic tree Bacillus cereus A1. Phylogenetic tree Bacillus pumilus B 6. Effect of optimal temperature on enzyme production. Effect of optimal temperature on enzyme production.

Thermal stability on enzyme production. pH stability on enzyme production. 35 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Master candidate: Samley Mam Thesis title: Screening and characterization of cellulase in Bacillus sp. Major: Food Technology Code:24181065 Educational Organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) General objectives: Screening and characterization of cellulase in Bacillus sp.

and determine some characteristic of this enzyme. Specific objectives - Screening Bacillus sp. producing cellulase from the collection of Bacillus sp.; - Identification of selected strains by 16S rDNA gene sequencing; - Characterization of cellulase produced by selected strain (including optimal temperature, optimal pH, thermal stability and pH stability). Materials and Methods Materials A hundred strains of Bacillus sp.

were supplied by Faculty of Food Science and Technology, Vietnam National University of Agriculture. There are two different sources of collection strains, one from the Muong Khuong chili sauce and the other from cow rumen. Methods Microorganisms with cellulolytic activity were incubated in MT1 media and determined by the formation of clear zone around colony through the lugol overlay method; Cellulolytic bacteria were identified by using 16S rDNA gene sequencing; the neighbor - joining phylogenetic analysis was carried out with Tree view programme to show evolution relationship between selected strains and some others in the database; Cellulase was measured indirectly by spectrometric determination of reducing sugars by DNS method. Optimal temperature was determined by incubating the enzyme at the various temperatures ranging from 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, and 80°C; Thermal stability was first investigated by pre-incubating the enzyme at the various temperature including: 45, 55, 65, 75, and 85 °C for 30, 60, 90, 120, 150, 180, and 120 minutes; Residual enzyme activity was determined with 1 % CMC in a 50 mM sodium acetate buffer with pH 5.

Optimal pH was determined with different buffer at various pH : 5. The pH stability was tested by pre-incubating the enzyme in variable pH buffer 5.5 at 37 °C for 30, 60, 90, 120, 150, 180 and 240 minutes. vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Main findings and conclusion: Three among of 100 isolates collection strains were cultured on CMC agar plate for screening cellulase producing bacteria. In which, 3 isolates coded A1.4 having the highest diameter of clear zone as 24 mm were chosen for further studies.

Those strains were identified as Bacillus cereus A1.8, and Bacillus pumilus B6. According to the Bacillus pumilus notified as a GRAS (FDA, 2015), it was chosen for further studies. The result showed that the crude and purification enzyme activity of Bacillus pumilus B6.4 were found at 3. The optimal temperature and pH for cellulolytic cellulase of Bacillus pumilus B6.4 were found at 55 oC and 6.

On the other hand, the enzyme was maintained more than 58 % stability at 55 to 65 oC after 150 min whereas the pH stability was maintained more than 56 % at 5. viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. INTRODUCTION The last two decades, the using of enzyme in industrial process has significantly increased and remained a constant effort (Lima et al. According to the BBC Research (2011), the number usages of the total market for industrial enzyme reached to USD 4.

Some enzymes are commonly used may be mentioned as amylase, protease, lipase, xylanase, cellulase and so on (Bhat, 2000). The cellulase has its significance due to key role in biotechnology and industrial applications (Bhat, 2000). It has been widely utilized for bioremediation (Zahangir et al., 2005), food processing (Chandara et al., 2005), paper, pulp industry, supplement in animal feed industry (Chandara et al., 2005), textile industry (Ali and Saad, 2008), alcoholic beverage, malting and brewing (Sreeja et al., 2013), formulation of washing powders, extraction of fruit and vegetable juices, and starch processing (Camassola and Dillon, 2007). is a Gram-positive aerobic or facultative endorspero-forming bacterium, rod-shaped bacterium (Shneath et al., 1986) which has been widely used in large-scale commercial enzyme application (Schallmey et al.

can produce a variety of extracellular cellulolytic enzymes that extremely express high cellulose degradation activities (Rastogi et al. The production of extracellular cellulase in microorganisms is significantly affected by a number of factors such as temperature, pH, aeration (Immanuel et al., 2006), agitation and medium constituents (Prasertsan and Doelle, 1987). Previously, the number of researchers in the Faculty of Food Science and Technology were investigated about some beneficial of Bacillus strains which can produce antibacteria, glucanase, protease, lactase and so on. In this study, the Bacillus strains were screened to find out more ability of producing cellulolytic cellulase.

General objective The aim of this research is to screen and characterization of cellulase in Bacillus sp. and determines some characteristic of this enzyme. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Specific objectives - Screening Bacillus sp.

producing cellulase from the collection of Bacillus sp.; - Identification of selected strains by 16S rDNA gene sequencing; - Characterization of cellulase produced by selected strain including optimal temperature, optimal pH, thermal stability and pH stability. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] PART II. LITERATURE REVIEW Cellulases are inducible enzymes synthesized by a large diversity of microorganisms including both fungi and bacteria during their growth on cellulosic materials. These enzymes have represented a target for both academic as well as industrial research (Singhet al.

Basic and applied studies on cellulolytic enzymes have demonstrated their biotechnological potential in various industries including food, animal feed, brewing and wine making, agriculture, biomass refining, pulp and paper, textile, and laundry. General information of cellulase Cellulase is the enzyme of commercial passion and also plays an essential function in hydrolysis of cellulose, a prime element of plant cell wall surface (Chandra et al. Cellulase covers a wide location in the worldwide market of industrially essential enzymes (Yoon et al. In addition, cellulase adds ~ 20 % of the complete enzyme market in all over the globe, due to its huge need in numerous markets (Srivastava et al.

Amongst these, the need of cellulase will certainly be highly selected by the business manufacturing of biofuels in future and also this will certainly additionally improve the need of cellulose from the biofuel sector (Yoon et al. For the manufacturing of biofuels sugar is one of the most preferable items which is gotten from the hydrolysis of cellulosic substrate via cellulase (Srivastava et al. Classification of cellulase The cellulase enzyme complex contains three different kinds of enzyme that perform well in collaboration in degradation of cellulose in figure 2. A cellulase enzyme system comprises of three classes; endoglucanase (EC 3.4), exoglucanase or cellobiohydrolase (EC 3.91), and β-glucosidase (EC 3.21) (Henrissat, 1994; Knowles et al., 1987; Lynd et al., 2002; Teeri, 1997; Wood and Garica, 1990; Zhang and Lynd, 2004b).

3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] They perform in a good cooperation to rapidly breakdown the cellulose complex and produce glucose (fermentable energy source) for bioethanol production (Beguin and Aubert, 1994). Cellulolytic enzyme complexes are distinguished as hydrolases which be able to breakdown O-glycosidic bonds between glucose units. They are classified by the Enzyme Commission with the number 3.x, where x signs the different cellulase enzyme type. (Lynd et al.

Efficiency in cooperation of members of cellulase enzyme system Source: Mussatto and Teixeria (2010) The following three classes of cellulolytic cellulases act in synergism during cellulose hydrolysis: Endoglucanases: This cluster is commonly represented by β-1,4 endoglucanase (E. It randomly digests the inner glycosidic-linkages of the amorphous cellulose part, liberating polysaccharides with lower polymerization degree (DP) and soluble oligosaccharides (DP<7).