Chương 1: Mở đầu Chương 2: Tổng quan Chương 3: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 4: Kết quả và bàn luận Chương 5: Kết luận và kiến nghị 4 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2. Lipase tự do 2. Giới thiệu Enzyme là chất xúc tác sinh học hiệu quả của nhiều phản ứng bởi khả năng chọn lọc cơ chất và hoạt tính cao (Zdarta và cộng sự, 2018). Hiện nay, nhu cầu sử dụng các enzyme khác nhau trong công nghiệp ngày càng cao và đã có tới hàng ngàn enzyme thương mại được sản xuất để phục vụ nhu cầu sử dụng.
Trong đó, enzyme lipase là một trong những enzyme tiềm năng, thu về lợi nhuận cao thứ ba trên tổng doanh số toàn cầu (năm 2017) vì có thể ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghiệp như thực phẩm, hóa chất, y học, dược phẩm, giày da, dệt may, mỹ phẩm và giấy (Konwar và cộng sự, 2018). Nguồn gốc của enzyme lipase Hiện nay, enzyme lipase có thể được thu nhận từ các nguồn tự nhiên bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật (Zhong, 2006): Lipase thực vật: Lipase từ thực vật có thể thu được từ các bộ phận khác nhau của cây như trong nhựa của quả đu đủ, trong các hạt chứa dầu như ngô, đậu phộng (Seth và cộng sự, 2014). Ngoài ra, lipase từ thực vật đã được nghiên cứu, tinh sạch và dần được ứng dụng trong việc chuyển hóa chất béo theo nhu cầu mong muốn nhưng vẫn chưa phổ biến (Dương và cộng sự, 2012). Lipase động vật: Lipase từ động vật thường được thu nhận từ tuyến tụy của gia súc như cừu, bò, lợn.
Tuy nhiên enzyme lipase từ động vật không tinh khiết, phải trải quá các quá trình tinh sạch để loại bỏ tạp khuẩn trước khi tham gia phản ứng xúc tác như lipase từ tuyến tụy của lợn trong quá trình thu nhận dễ lẫn trypsin, virus và hormone của động vật gây vị đắng (Whitehurst và cộng sựu, 2009). Lipase vi sinh vật: Lipase từ vi sinh vật hiện đang được quan tâm nhiều hơn lipase từ thực vật và động vật vì vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng cao, sản xuất enzyme có hoạt tính xúc tác cao. Bên cạnh đó, vi sinh vật được xem là nguồn nguồn nguyên liệu rẻ, sẵn có và không ảnh hưởng khai thác tài nguyên môi trường (Shu và cộng sự, 2010). Lipase có thể được thu nhận từ một số loại vi sinh 5 vật như Stetphylococcus hyicus, Pseudomonas fragi, Staphylococcus aureus, Geotrichum Candium, Rhừomucor miecher, Candida antarctica , Achromobacter lipolyticum (Nguyễn, 2018).
Cấu trúc hoạt động của enzyme lipase Trung tâm hoạt động của lipase gồm bộ ba xúc tác là nucleophilic (Serine, Cysteine), acid (Aspartate hoặc Glutamate) và Histidine được thể hiện ở Hình 2. Tùy vào môi trường xung quanh mà lipase sẽ chuyển từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động bằng cách đóng, mở nắp để cản trở hoặc cho phép cơ chất khuếch tán tự do vào vị trí xúc tác (Aravindan, 2007). Ở trạng thái không hoạt động, nắp sẽ che đi trung tâm hoạt động của lipase làm cho cơ chất không thể gắn vào, còn khi chuyển sang trạng thái hoạt động, nắp này sẽ mở ra làm cho cơ chất tiếp xúc với trung tâm hoạt động và tham gia phản ứng (Wang, 2019). Nắp của lipase là một chuỗi polypeptide vừa có tính kỵ nước vừa có tính ưa nước như khi đóng nắp, phần mặt ưa nước hướng ra ngoài dung môi và mặt kỵ nước hướng vào lõi protein đến khi enzyme chuyển sang trạng thái mở, mặt kỵ nước sẽ lộ ra ngoài làm tăng diện tích bề mặt kỵ nước và làm tăng khả năng liên kết với cơ chất (Vương và cộng sự, 2011; Mateo và cộng sự, 2007).2 thể hiện sơ đồ phản ứng của enzyme lipase tại mặt phân cách hai pha dầu- nước.2: Cấu trúc 3 chiều của enzyme Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng của enzyme lipase lipase (Van Pouderoyen, 2001) (Aravindan, 2007) 6 2.
Tính chất của enzyme lipase a. Ảnh hưởng của pH đến enzyme lipase Hoạt động của lipase phụ thuộc vào pH, lipase ổn định trong dung dịch trung tính ở nhiệt độ phòng và thể hiện hoạt tính cao trong khoảng pH từ 4-9 (Jaeger và cộng sự, 1994). Một số lipase ổn định trong cả một loạt các giá trị pH khác nhau. Lipase ngoại bào thu được từ A.
niger, Chromobacterium viscosum và Rhizophus có thể hoạt động ở pH acid.nitroaeducens là loại lipase duy nhất hoạt động ở pH kiềm (pH 11) (Aravindan, 2007). Ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme lipase Thông thường, lipase có thể hoạt động ổn định trong khoảng nhiệt độ 30-35 ℃. Tuy nhiên một số lipase có nguồn gốc từ vi sinh vật ưa nhiệt Lipase có thể hoạt động ổn định trong khoảng nhiệt độ 30-35 ℃ nhưng đối với lipase thu từ vi sinh vật ưa nhiệt như Achromobacter spp. thì có thể hoạt động ở 40-60 ℃ và enzyme lipase thu nhận từ vi sinh chịu nhiệt như Bacillus subtilis, Thermomyces lanuginose, Rhizopus orzae, và Psedomonas sp còn có thể kháng nhiệt lên tới 90 ℃ (Jaeger và cộng sự, 1994).
Cơ chất phản ứng của enzyme lipase Dầu ô liu được chọn để làm cơ chất do có nồng độ acid oleic cao hơn 70% phù hợp để xác định hoạt tính của lipase. Lipase hoạt động ở bề mặt phân cách của hai pha dầu và nước nên cơ chất phải được nhũ hóa mịn để lipase có thể tiếp xúc với cơ chất được diện tích bề mặt lớn nhất (Thomson và cộng sự, 1999).3 thể hiện 2 dạng cơ chất của enzyme lipase, nhóm ankyl của gốc acid (R3) loại 1 có 4 carbon và loại 2 có 3 carbon.3: Cơ chất của lipase a) Loại 1 ; b) Loại 2 (Aravindan, 2007) 7 d. Cofactor Lipase là enzyme thuộc nhóm hydrolase không cần phải có các cofactor trong quá trình xúc tác phản ứng. Các ion kim loại có thể kích thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme như Ca2+ đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc và thực hiện chức năng của các enzyme, trong khi đó Zn2+, Fe2+, Fe2+ thì ức chế mạnh hoạt động của lipase.
Ion của các muối như Ca2+, Cd2+ và Fe2+ tăng cường hoạt động xúc tác sinh học lipase nhưng một số ion như Co2+, Zn2+ Mg2+, Mn2+, Al3+, Na+ có tác dụng ức chế nhẹ hoạt động của lipase (Verma và cộng sự, 2012). Các phản ứng xúc tác Lipase là được xem là một chất xúc tác sinh học có thể xúc tác cho nhiều loại phản ứng khác nhau như phản ứng thủy phân, ester hóa, ester hóa nội phân tử, acid hóa, khử rượu và amin hóa (Hình 2. Trong đó khả năng xúc tác phản ứng thủy phân là một trong những ứng dụng tiềm năng của lipase. Trong quá trình thủy phân, lipase hoạt động trên các liên kết carboxylic ester có trong triacylglycerol để xúc tác cho quá trình thủy phân triglyceride thành glycerol và các acid béo tự do (Hình 2.4: Phản ứng thủy phân triacylglycerol xúc tác bởi lipase (Jaeger và cộng sự, 1994) 8 Hình 2.5: Các phản ứng khác nhau được xúc tác bởi lipase (Houde và cộng sự, 2004) 2.
Ứng dụng Lipase đóng vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp do tính ổn định trong dung môi hữu cơ, tính chọn lọc và khả năng xúc tác không cần các cofactor. Việc ứng dụng lipase thương mại trong nhiều lĩnh vực sản xuất có thể mang lại doanh thu lên tới hàng tỷ đô la (Jaeger, 1999). Trong công nghiệp hóa chất, lipase được ứng dụng để sản xuất dược phẩm tinh khiết như prostaglandin, cephalosporin, thuốc chống viêm steroid, hydantoin và penicilin. Lipase cũng được dùng để sản xuất chất hoạt động bề mặt và tạo hương thơm cho các sản phẩm mỹ phẩm, nước hoa và dùng để phân giải các hợp chất chất diệt cỏ trong nông nghiệp (Sandoval, 2018).
Đối với ngành công nghiệp giấy, lipase được dùng để kiểm soát và loại bỏ chất béo không cần thiết nhằm tăng độ trắng và giảm thiểu được sự ô nhiễm nước thải (Jaeger, 1999). Trong công nghiệp chất tẩy rửa, lipase đóng vai trò là chất phụ gia được thêm vào các dung dịch kiềm ở nhiệt độ cao để hỗ trợ làm sạch. Đối với sinh học môi trường, lipase đóng vai trò là chất xử lý nước thải, phân hủy dầu và các hợp chất hữu cơ còn sót lại trong nước (Sandoval, 2018). Bên cạnh đó, lipase còn được dùng sản xuất chất chống oxy hóa, chất tạo màng sinh học như polyphenol, polysaccharide, polyester.
Công nghiệp dệt may sử dụng lipase để giặt 9 sạch và xử lý quần áo jean, ứng dụng để sản xuất chất bôi trơn, dầu diesel sinh học từ các nguồn thực vật, động vật và đóng vai trò giúp giảm độ nhớt của dầu (Sandoval, 2018). Trong công nghệ thực phẩm, lipase được dùng để sản xuất hoặc cải tiến chất lượng của các loại thực phẩm khác nhau như phô mai, bơ, dầu ăn, thức ăn cho trẻ em, chất nhũ hóa để cải thiện các sản phẩm bánh nướng và mì nhằm tạo ra hương vị hấp dẫn hơn (Sandoval, 2018, Verma và cộng sự, 2012). Lipase giúp tạo ra chất béo có nguồn gốc từ thực vật tương tự với chất béo từ sữa mẹ để trẻ em dễ hấp thu. Nhờ có lipase thương mại mà có thể sản xuất chất thay thế bơ ca cao có các đặc tính vật lý tương tự bơ ca cao, có độ tan chảy đặc trưng của sô cô la nhưng chi phí sản xuất thấp hơn.
Lipase còn kết hợp với protease tạo ra một loại phô mai có đầy đủ hương vị mà không bị đắng ngay cả sau 90 ngày ủ chín (Houde, 2004). Cố định enzyme lipase 2. Giới thiệu Trong công nghệ sinh học, quá trình cố định enzyme trở thành chất xúc tác ổn định và có khả năng tái sử dụng đã mang lại hiêu quả kinh tế cao (Xie và cộng sự, 2009). Enzyme cố định bị giới hạn về mặt vật lý trong một vùng xác định nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác cao nhất.
Nhiều vật liệu cố định đã được nghiên cứu và sử dụng để cố định lipase như nhựa polymer, sillica, gốm sứ, vật lịnano carbon, vật liệu từ tính. Vật liệu cố định cần phải có giá thành thấp, quy trình cố định phải dễ thực hiện để thu hồi lipase giữ được hoạt tính cao trong thời gian dài. Vì vậy, nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để cố định enzyme lipase và có thể chia thành ba loại chính là gắn enzyme lên vật liệu cố định bằng phương pháp hấp phụ vật lý, phương pháp bao gói enzyme và phương pháp tạo liên kết ngang (Hình 2.6: Các phương pháp cố định enzyme (Zhaoo và cộng sự, 2105) 2. Các phương pháp cố định enzyme Hình 2.7: a) Phương pháp tạo liên kết ngang; b) Phương pháp bao gói; c) Phương pháp hấp phụ 11 a.