Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược về cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng 1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mô Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng (15, 22, 29). Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật.
Cuối thế kỷ 19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh (15, 22). Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit.
Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau. Năm 1958, tính toàn năng của tế bào đã được khẳng định bằng công trình nghiên cứu của Stewart và cs. (1958) trên mô rễ cây cà rốt. Các tác giả này đã nuôi cấy mô rễ cà rốt trên môi trường đặc có nước dừa và đã thu nhận được khối mô sẹo gồm các tế bào nhu mô.
Khi chuyển mô sẹo này sang môi trường lỏng có cùng thành phần và nuôi lắc thì nhận được huyền phù gồm các tế bào riêng lẽ và các nhóm tế bào. Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường lỏng, không cấy chuyển thì thấy hình thành rễ. Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo rằng tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được khẳng định. Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính toàn năng của tế bào đã được thông báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phôi.
Phôi soma đã được ghi nhận ở nhiều giống như Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium, Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza. Ngày nay bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả. Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới (10, 11, 15.2 Công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống cây trồng Công nghệ sinh học thực vật hình thành do áp lực tự nhiên của xã hội theo hai khuynh hướng: áp lực gia tăng năng suất và áp lực giảm năng suất mùa màng. Trước những xu hướng đó, đòi hỏi ngày càng phải đưa nhanh kỹ thuật mới vào công tác lựa chọn, nhân giống cây trồng.
Sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật theo thời gian có thể được tóm tắt như sau: từ những năm 1920 bắt đầu là lai chéo, năm 1960 là kỹ thuật gây đột biến, năm 1970 là sự phát triển kỹ thuật cấy mô, đến năm 1980 là kỹ thuật dung hợp tế bào trần và từ những năm 1990 đến nay là sự phát triển của kỹ thuật gen (10, 12, 15. Nhờ sự kết hợp giữa nuôi cấy mô thực vật và công nghệ gen, người ta đã tạo ra được những thuộc tính mới cho cây trồng một cách có định hướng và hiệu quả. Nhờ thuộc tính totipotent của thực vật, người ta có thể hoàn toàn tái tạo nên một loạt các cây mới hoàn chỉnh từ một tế bào mang đặc tính mới chỉ trong một thời gian ngắn. Nhờ sự kết hợp này đã giúp cho công nghệ sinh học thực vật nói chung và nuôi cấy mô nói riêng có những bước tiến mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn.
Có thể nói một cách khái quát những ưu điểm của công nghệ này là: - Chọn lọc nhanh những tính trạng mong muốn, nuôi cấy mô là con đường nhanh nhất giúp chọn lọc và biểu hiện tính trạng. - Nuôi cấy mô tạo nguồn nguyên liệu thực vật tuyệt vời cho quá trình chuyển gen ở thực vật. - Nuôi cấy mô kết hợp với kỹ thuật dung hợp tế bào trần và đột biến có thể tạo ra các dòng lai khác loài. - Giúp nhân giống vô tính với tốc độ và số lượng lớn.
- Giúp tạo được cây sạch bệnh. - Thực vật nuôi cấy mô là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất các chất quý hiếm, đặc biệt là các dược chất. - Các cây mô là đối tượng tốt và hiệu quả của những nghiên cứu về sinh lý, sinh hóa, di truyền, bệnh lý, sinh học phân tử. - Các cây mô giúp trao đổi quốc tế nguồn giống thực vật rất dễ dàng.
- Các cây mô có thể cung cấp quanh năm.3 Vai trò của chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô Chất điều tiết sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chất điều tiết sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo. Những chất điều tiết sinh trưởng này được vận chuyển đến các bộ phận khác của cơ thể gây nên những tác động điều tiết của cây. 5 Vai trò điều hòa của chất điều tiết sinh trưởng thực vật là khởi động cho sự hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặc trì hoãn quá trình đó.
Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin, ngoài ra gibberelin và ethylen cũng có vai trò quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật.1 Các auxin Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có những dẫn xuất khác là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 – diclophenoxyl axetic axit (2,4-D). Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình tạo rễ (10, 12, 40, 41).
NAA, IBA, 2,4-D là những auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. Chúng có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Đối với rễ, về cơ bản auxin ức chế sự phát triển của rễ, chỉ ở nồng độ cực thấp (10 -10-12g/ml) thì mới có tác dụng kích thích sinh trưởng của rễ, vượt qua ngưỡng -9 này (10-8mg/l) thì lại thể hiện tác dụng ức chế. IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus.
Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy. Mặc dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất này lại có tính chất đối kháng. NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra. Chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy (10, 12, 40, 41).2 Cytokinin Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào.
Các cytokinin thường gặp là 6-benzyl aminopurin (BAP), Kinetin. Kinetin được Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic. Kinetin là dẫn xuất của base nitơ adenin. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin.
Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và tăng cường hoạt động của một số enzim (10, 40, 41). Benjamin và cs. (1987) đã cho rằng nồng độ BA cao (1-5ppm) kích thích sự phát triển của chồi đỉnh và đầu rễ của cây Atropa belladona.
Lat và cs. (1988) cho rằng khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 1- 5mg/l. Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh 6 trưởng nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô.
Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi, nếu tỷ lệ này cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển mô sẹo. Barna và Wakhlu (1998) chỉ ra rằng tốc độ tái sinh chồi của cây Plantago ovata tăng cao khi trên môi trường sử dụng KIN 4-6 µM phối hợp với NAA 0,05µM. Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác động đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, dẫn đến quá trình mitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào. Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào, cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường (10, 12, 40, 41).3 Các nhóm chất khác Ngoài những nhóm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, trong nuôi cấy in vitro còn sử dụng một số nhóm chất khác như Abscicis acid, ethylen, các amino acid.
Abscisis acid sử dụng ở nồng độ cao là chất ức chế sinh trưởng và trạng thái nghỉ bắt buộc. Ethylen được sinh ra trong quá trình nuôi cấy thực vật. Ethylen có thể kìm hãm sự sinh trưởng tế bào và đNy nhanh sự lão hóa trong quá trình nuôi cấy mô.