mở đầu cho phản ứng phân cắt và trong sự hình thành enzyme α-glycosyl (Collin & cộng sự, 2005) [12]. 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các họ thuộc glyoside hydrolase (GHs) có hoạt động trên xylan (Collin & cộng sự, 2005) Số thành viên Họ glycoside thủy phân Cơ chế xúc Nhóm acid/base Nucleophilchase hydrolase xylan Nếp gấp tác chính chính 5 8 (β/α)8 Giữ nguyên Glutamate Glutamate 7 1 β-Jelly roll Giữ nguyên Glutamate Glutamate 8 4 (α/α)6 Đảo ngược Glutamate Aspartate 10 127 (β/α)8 Giữ nguyên Glutamate Glutamate 11 173 β-Jelly roll Giữ nguyên Glutamate Glutamate 5-Blade β- 43 1 propeller Đảo ngược Glutamate Aspartate Các thành viên họ xylanase 10 có cấu trúc α/β gấp cuộn 8 lần và trọng lượng phân tử xấp xỉ 48 kDa, pI thấp, và thủy phân các liên kết glycoside với sự giữ được hình thể nguyên vẹn, trong khi đó, họ xylanase 11 có cấu trúc mạch β gập hình bánh sandwich gần giống với cấu trúc bàn tay phải và có khối lượng phân tử nhỏ hơn, vào khoảng 20 kDa, pI cao và thủy phân các liên kết glycoside với cơ chế xúc tác đổi chỗ hai lần (Hakylinen & cộng sự, 2003; Zhou & cộng sự, 2009). Xylanase thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase.
Xylanase thuộc hệ GH11 thuộc nhóm alkaline xylanase [36]. Cấu trúc Cấu trúc bậc ba của phân tử xylanase được xác định bằng cách sử dụng mô hình Insight II Molecular. Theo đó, cấu trúc xylanase bao gồm một miền đơn có chứa 2 vùng cấu trúc β và một miền có chuỗi xoắn α, các cấu trúc này chỉ có ở xylanase hệ GH11. Cấu trúc chung của phân tử xylanase được ví như ―bàn tay phải‖ với các ngón tay ở phía dưới và ngón cái nằm phía trên.
Trung tâm hoạt động là ngón tay cái, lòng bàn tay và ngón tay. 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc không gian xylanase của Bacillus subtilis [18] Xylanase được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955. Đó là enzyme thủy phân xylan, phá vỡ liên kết β-1,4-xylanosidic của xylan thành nhiều xylo-oligosaccharide có độ dài khác nhau.
Đặc tính của xylanase Trong trung tâm hoạt động của xylanase, axit amin quyết định sự hoạt động của enzyme là axit glutamic [2]. Sự thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống enzyme xylanolytic. 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan [36] Vai trò của các enzyme chính trong hệ thống enzyme xylanolytic cụ thể như sau: β-1,4-endo-xylanase và ferulic acid esterases Hai enzyme β-1,4-endo-xylanase và ferulic acid esterases là hai enzyme có vai trò chủ đạo trong quá trình thủy phân mạch chính của xylan.
Trong đó, β -1,4- endo-xylanase tấn công vào liên kết xylosidic của mạch chính còn ferulic acid esterases tấn công các liên kết xylosyl còn lại và giải phóng ra các xylooligosaccharides. Hai enzyme này là thành phần chính của hệ enzyme xylanolytic do các vi sinh vật phân hủy sinh học sinh ra, chẳng hạn như các loài thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum, Bacillus, Clostridium và Streptomyces [30]. Ferulic acid esterases là enzyme ngoại bào exoglyosidase thủy phân các oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đường xylose. Ferulic acid esterases có thể phân hủy các chất nhân tạo như p-nitrophenyl β-D-xyloside [31].
Trong số các xylooligomer, xylobiose thường là cơ chất tốt nhất. Ái lực của enzyme đối với xylooligosaccharide giảm theo mức độ tăng của phản ứng polymer hóa [22]. Hầu hết các ferulic acid esterases được nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế bởi xylose - sản phẩm thủy phân của chúng. Nhiều ferulic acid esterases có hoạt độ transferase, đặc biệt là ở các nồng độ cơ chất cao, tạo ra sản phẩm phân tử lượng cao.
α-L-Arabinofuranosidase 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Mặc dù enzyme arabinosidase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân xylan nhưng chỉ có một vài enzyme đã được tinh sạch và mô tả. Có hai loại enzyme arabinase, các enzyme α-L-arabinofuranosidase ngoại bào (EC 3.55) hoạt hóa ngược lại với p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranosida trên các arabinan phân nhánh và các enzyme 1,5-alpha-L-arabinase nội bào (EC3.99), chỉ hoạt hóa các arabinan dạng thẳng. α-L-Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3- và 1,5-α- L-arabinofuranosyl trong arabinoxylolan đã được báo cáo trong A. Enzyme này đặc hiệu cao đối với arabinoxylan và có thể giải phóng mỗi arabinose từ arabinoxylan.
Khi giải phóng arabinose, mạch chính xylan không bị thủy phân và không tạo ra xylooligosaccharide. Enzyme này không tác động đối với α-L-1,3 hoặc α-1,5 liên kết arabinose từ arabinan, arabinogalactan, hoặc p- nitrophenyl-alpha-L-arabinofuranoside. α-Glucuronidase α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2 giữa axit glucuronic và gốc xylose trong phân tử glucuronoxylan. Tính đặc hiệu của α-glucuronidase là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme.
Esterase acetylxylan Enzyme esterase acetylxylan là enzyme có thể cắt đứt giữa các nhóm acetyl với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên [20]. Trong các nghiên cứu trước đó đã chứng minh được enzyme này được chứng minh là sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến hoạt động của enzyme xylanase 1. Ảnh hưởng của một số ion kim loại Các ion kim loại có thể kìm hãm hay hoạt hóa enzyme.
Các ion kim loại nặng, ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ enzyme. Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng. Mức độ hoạt hóa của enzyme chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới hạn xác định, khi vượt qua ngưỡng nồng độ này những ion kim loại lại có tác dụng kìm hãm enzyme. Giới hạn nồng độ có tác dụng hoạt hóa enzyme của mỗi ion kim loại có thể khác nhau, vì vậy ở cùng nồng độ, cùng điều kiện phản ứng, đối với một enzyme, hai ion có thể có tác dụng trái ngược nhau.
Hiện tượng này thường xảy ra giữa các ion cùng hóa trị. Ảnh hưởng của mỗi ion 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com kim loại đến hoạt động của enzyme xylanase của các loài khác nhau là không giống nhau [1]. Ảnh hưởng của nhiệt độ Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định khi chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme. Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng là hệ số Q10.
Đó là tỷ lệ của vận tốc phản ứng ở một nhiệt độ nào đó so với vận tốc phản ứng ở nhiệt độ thấp hơn 10oC. Hệ số này càng lớn, phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ thường. Q10 = kt+10 /kt Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme cho thấy, nhiệt độ hoạt động thích hợp (topt) của nhiều enzyme vào khoảng 40-50oC; trên 50oC hoạt độ thường bị giảm mạnh do cấu trúc phân tử của enzyme bị phá vỡ [1]. Xylanase, được sinh tổng hợp bởi nấm thường có nhiệt độ thích hợp là 40- 60oC.
Ví dụ, xylanse của Aspegillus niger hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ từ 45-50oC. Còn đối với xylanase, được sinh tổng hợp bởi các loài vi khuẩn thường có nhiệt độ thích hợp từ 37-80oC [21]. Ví dụ, xylanase của Bacillus sp. hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ từ 50-80oC.
Ảnh hưởng của pH Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trường. Đó là do pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa gốc R của các gốc acid amin trong phân tử enzyme, ion hóa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động, ion hóa cơ chất, ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng. Đường biểu diễn vận tốc của nhiều phản ứng enzyme ở các pH khác nhau có dạng hình chuông hẹp cân đối, có đỉnh chuông ứng với pH trung tính. Như vậy pH thích hợp (pHopt) của phần lớn enzyme vào khoảng 7.
Tuy nhiên, một số enzyme có pHopt rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh vật), hoặc khá cao như subtisin (protease kiềm của Bacillus), hoặc ít thay đổi trong một khoảng pH xác định [1]. Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm thường hoạt động ở khoảng pH từ 3,5- 6,5. Ví dụ, pH tối ưu cho xylanase của Aspegillus niger là 5. Còn đối với xylanase được sinh tổng hợp bởi các loài vi khuẩn như Bacillus thường có khoảng pH rộng hơn từ 4-10 [21].
22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa Các chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất mạnh tới hoạt độ của enzyme, tùy từng loại enzyme mà sự ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa là khác nhau. Trịnh Đình Khá (2006) khi nghiên cứu trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy các chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Trixton X-100, SDS đều làm giảm hoạt tính của xylanase và SDS làm giảm mạnh nhất, chỉ còn 18-34%.
Các dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, isopropanol và aceton) đều ức chế hoạt tính xylanase, riêng n-butanol ức chế chỉ còn 33-63%. Đỗ Thị Tuyên & cộng sự (2008) cho rằng các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol không ảnh hưởng mạnh tới hoạt độ xylanase từ chủng A. ozyzae DSM1863, riêng n-butanol làm tăng và aceton làm giảm nhẹ hoạt tính. Tween 20 và Triton X-100 không ảnh hưởng mạnh ở nồng độ thấp (0,2-1%) nhưng làm giảm hoạt tính xylanase ở nồng độ cao (2%), trong khi đó SDS làm giảm hoạt độ enzyme mạnh ở tất cả các nồng độ [31].
Ứng dụng của xylanase 1. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm Công nghiệp thực phẩm là một trong những ngành công nghiệp có giá trị kinh tế lớn mà trong đó sự trao đổi chất của vi sinh vật có nhiều ứng dụng, doanh thu trên toàn thế giới hàng năm của ngành này lên tới 109 đô la cùng với đó các nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này cũng tăng lên dần. Xét ở quy mô công nghiệp, sản xuất enzyme là một lĩnh vực đang ngày càng phát triển của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ thực phẩm nói riêng. Các enzyme đóng vai trò vô cùng quan trọng, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng cao, đặc biệt là enzyme xylanase, được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất trên toàn thế giới [14].
Xylanase được ứng dụng trong sản xuất nước hoa quả và làm trong rượu. Trước kia, người ta chỉ lọc dịch hoa quả rồi bỏ bã, nhưng khi bổ sung xylanase vào phần bã hoa quả sau khi lọc sẽ thu được một lượng dịch hoa quả bổ sung thêm. Hơn nữa, xylanase còn có thể hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao (khoảng 60-70oC) nên có thể ngăn chặn được sự nhiễm vi sinh vật khi chế biến nước hoa quả ở nhiệt độ cao [15].