Đặt vấn đề Xylan là thành phần chính của hemicellulose, chiếm 20-35% khối lƣợng chất khô. Thành phần của xylan bao gồm mạch chính đƣợc cấu tạo bởi đƣờng D-xylopyranose thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên Oacetyl, α-L- arabinofuranosyl, α-D-glucuronosyl. Để thủy phân hoàn toàn xylan cần có sự tham gia hoạt động của tổ hợp xylanase (Nascimento & cs. Đến nay, xylanase từ vi sinh vật đƣợc quan tâm chú ý mạnh mẽ bởi khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ bột giấy, thức ăn chăn nuôi, chuyển hóa lignocellulose, cồn sinh học và công nghiệp đồ uống (Vũ Văn Lợi & cs.
Vi khuẩn có nhiều đặc điểm vƣợt trội hơn so với các sinh vật khác, biểu hiện ở khả năng sinh sản nhanh, vòng đời ngắn và chi phí nghiên cứu thấp nên rất phù hợp cho việc nghiên cứu các sản phẩm thứ cấp nói chung và enzyme xylanase nói riêng. Xylanase đƣợc sinh tổng hợp bởi rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau nhƣ vi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn (Fusarium oxysporum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger,…). Trong đó, xylanase từ xạ khuẩn đƣợc công bố có khả năng chịu nhiệt, chịu kiềm và không có hoạt tính cellulase (Rifaat, 2006). Hiện nay, enzyme xylanase đƣợc ứng dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực nhƣ: nghành chăn nuôi, nông nghiệp, công nghiệp, sản xuất giấy và hoá chất.
Sử dụng xylanase trong tẩy trắng bột giấy giúp làm giảm lƣợng chlorine (Cl2) và hypochlorine (ClO2) dùng trong tẩy trắng, đồng thời giảm lƣợng hóa chất thải ra môi trƣờng. Xylanase bổ sung vào chế độ ăn dựa trên lúa mạch đen của gà thịt dẫn đến giảm độ nhớt đƣờng ruột, do đó cải thiện cả tăng trọng của gà con và hiệu quả chuyển đổi thức ăn của chúng (Bedford & Classen, 1992). Xylanase kết hợp với cellulase và amylase, dẫn đến năng suất nƣớc trái cây đƣợc cải thiện bằng phƣơng pháp hóa lỏng trái cây và rau quả, tăng thu hồi hƣơng liệu, tinh 2 dầu, vitamin, muối khoáng, giảm độ nhớt và sự thủy phân của các chất (Bajpai & Pratima. Chính vì những ứng dụng có tính cấp thiết hiện tại, đề tài “Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase của các chủng vi khuẩn Bacillus sp.” đƣợc thực hiện.
Mục đích - Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của một số chủng Bacillus sp. - Đánh giá hoạt tính xylanase sinh tổng hợp từ các chủng Bacillus sp. - Đặc điểm hình thái và sinh hoá của các chủng Bacillus sp. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát khả năng sinh trƣởng của một số chủng vi khuẩn - Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanse: Thời gian nuôi Các giá trị pH khác nhau Nồng độ cơ chất khác nhau Nguồn nitơ khác nhau Đặc điểm hình thái, sinh hoá 3 PHẦN II.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về xylanase 2. Định nghĩa Xylanase là một enzym phức tạp, bao gồm endoxylanase (E.55) và acetylxylan esterase (E. Endo-1,4-β-xylanase (EC 3.8, tên hệ thống 4-β-D-xylan xylanohydrolase) là một loại enzyme phân hủy polysacarit xylan tuyến tính thành xyloza.
Enzyme này phá vỡ hemicellulose, một trong những thành phần chính của thành tế bào thực vật (Contributors, 2022). Xylanase đóng một vai trò quan trọng đối với vi sinh vật phát triển mạnh trên các nguồn thực vật để phân hủy chất thực vật thành các chất dinh dƣỡng có thể sử dụng đƣợc. Xylanase đƣợc tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, nấm men, tảo biển, động vật nguyên sinh, ốc sên, động vật giáp xác, côn trùng (Polizeli & cs. Xylanase có khả năng hấp thụ và phân hủy xylan, một loại glucan nằm trong bột gạo và các sản phẩm gạo.
Xylanase có tính chất của lysozyme, giúp sản xuất bột có độ bền cao, giảm độ pH của bột gạo. Xylanase đƣợc sử dụng trong sản xuất bột gạo vì nó có thể hấp thụ và phân hủy các loại xylan trong bột, giảm đƣợc thời gian pha trộn, giảm đƣợc nồng độ pH của bột. Cấu trúc, phân loại và cơ chế xúc tác của xylanase 2. Cấu trúc và phân bố của xylan Cơ chất của enzyme xylanase là xylan.
Xylan là polysacarit phong phú thứ hai trong tự nhiên, chiếm khoảng một phần ba lƣợng carbon hữu cơ tái tạo trên trái đất (Collins & cs. Xylan chủ yếu hiện diện trong thành tế bào thứ cấp cùng với cellulose (1,4-β-glucan) và lignin (một hợp chất 4 polyphenolic phức tạp) tạo thành các thành phần polyme chính của thành tế bào thực vật. Trong cấu trúc thành tế bào, cả ba thành phần tƣơng tác thông qua các liên kết cộng hóa trị và không cộng hóa trị (Motta & cs. Dựa trên các nhóm thế phổ biến đƣợc tìm thấy trên bộ khung của phân tử xylan, xylan đƣợc phân loại thành homoxylan tuyến tính, arabinoxylan, glucuronoxylan hoặc glucuronoarabinoxylan.
Cấu trúc của xylan và các enzyme thủy phân xylan (Sunna & Antranikian, 1997). - Arabinoxylans, chỉ có chuỗi bên của các đơn vị đầu cuối đơn lẻ của các nhóm thế α-L-arabinofuranosyl. Trong trƣờng hợp cụ thể của ngũ cốc, arabinoxylan khác nhau về mức độ thay thế arabinosyl, với gốc 2-O- và 3-O- đƣợc thế đơn hoặc kép (2-O-, 3-O-) đƣợc thế xylosyl. - Glucuronoxylans, trong đó axit α-D-glucuronic hoặc dẫn xuất 4-O- metyl ete của nó là nhóm thế duy nhất.
- Glucuronoarabinoxylan, trong đó axit α-D-glucuronic (và 4-O- metyl-α-D-glucuronic) và α-L-arabinose đều có mặt. - Galactoglucuronoarabinoxylans, đƣợc đặc trƣng bởi sự hiện diện của gốc β-D-galactopyranosyl cuối cùng trên chuỗi bên oligosacarit phức tạp 5 của xylan và thƣờng đƣợc tìm thấy trong thực vật lâu năm. Xylan đƣợc phân bố trong một số loại mô và tế bào, hiện diện trong nhiều loài thực vật đƣợc tìm thấy với số lƣợng lớn trong gỗ cứng từ thực vật hạt kín (15–30% thành phần vách tế bào) và gỗ mềm từ thực vật hạt trần (7– 10%), cũng nhƣ trong cây hàng năm (<30%). Xylan gỗ tồn tại dƣới dạng O- acetyl-4-O-methylglucuronoxylan trong gỗ cứng và arabino-4-O- methylglucuronoxylan trong gỗ mềm, trong khi xylan trong cỏ và cây hàng năm thƣờng là arabinoxylan.
Xylan không thay thế tuyến tính cũng đã đƣợc báo cáo trong cỏ esparto, thuốc lá và một số loại tảo biển, với loại sau có chứa gốc xylopyranosyl đƣợc liên kết bởi cả hai liên kết 1,3-β và 1,4-β (Motta & cs. Cấu trúc của enzyme xylanase Cấu trúc không gian của xylanase đƣợc tìm thấy ở nhiều vi khuẩn và nấm thuộc họ 10 và 11. Có nhiều enzyme của họ 10 đáng chú ý: gồm một module gắn kết carbohydrate đƣợc gắn bằng một cầu nối linh động. Các xylanase của họ 11 thƣờng có các domain xúc tác cao từ 180-200 cấu tử gấp cuộn thành một motif β-sheet đƣợc gọi là gấp β-jelly-roll.
Chúng đặc hiệu với xylan hơn bình thƣờng và không có các domain phụ. Cấu trúc không gian 3D của enzyme xylanase (Heinen & cs. 6 So với các xylanase khác, các thành viên của họ 11 thể hiện một số tính chất hấp dẫn, chẳng hạn nhƣ tính chọn lọc cơ chất cao và khả năng xúc tác cao hiệu quả, kích thƣớc nhỏ và phạm vi pH tối ƣu và các giá trị nhiệt độ, làm cho chúng phù hợp trong các điều kiện khác nhau và trong nhiều ứng dụng. Cấu trúc không gian 3D của họ 11 xylanase có hình dạng tổng thể của bàn tay phải.
Nó bao gồm gồm hai tấm gấp nếp b lớn và một chuỗi xoắn đơn tạo thành một cấu trúc tƣơng tự nhƣ một bàn tay phải (Walia & cs. Phân loại Enzyme xylanase là glycoside hydrolase (GH) đƣợc phân loại trên cơ sở tƣơng đồng trong các yếu tố cấu trúc và nhóm kỵ nƣớc thành một số họ, tức là 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 26, 30, 43, 44, 51 và 62, có thể thủy phân liên kết b-1,4 glycosid của xyloside từ đó đƣờng hemiacet và aglycone không đƣờng có nguồn gốc. Các trình tự đƣợc phân loại trong các họ 16, 51 và 62 dƣờng nhƣ là các enzyme nhị phân chứa hai miền xúc tác, không giống nhƣ các họ 5, 7, 8, 10, 11 và 43, có sự khác biệt thực sự miền xúc tác với hoạt tính endo-1,4-b-xylanase (Collins & cs. Dựa vào cấu trúc phân tử mà xylanase đƣợc phân thành 2 nhóm: nhóm enzyme có 1 domain và nhóm có nhiều domain.
Các domain gắn kết với cellulose, hầu hết là các domain không có chức năng xúc tác ở xylanse, chúng thúc đẩy việc gắn kết các dạng cellulose crystalline hoặc amorphous khác nhau và có thể bẻ gãy vì sợi cellulose để cellulase phân giải dễ dàng hơn. Phân loại dựa theo tính chất lý hoá: - Nhóm có phân tử khối thấp (<30 kDa) và pI (điểm đẳng điện) trung tính. - Nhóm có phân tử khối cao (>30 kDa) và pI axit 2. Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase Cơ chế hoạt động của xylanase bao gồm các bƣớc sau Bƣớc 1: Enzyme xylanase nhận biết xylan và liên kết với nó bằng cách thay đổi cấu hình ở phần cánh trái cuộn xoắn lại 3 lần.
7 Bƣớc 2: Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác, liên kết glycoside bị kéo căng và bị bẻ gãy và tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị enzyme - cơ chất. Bƣớc 3: Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nƣớc hoạt động. Phân tử nƣớc này tách thành ion H+ và OH‒. Ion H+ gắn vào gốc glycosyl vừa đƣợc tách ra trong khi ion OH‒ gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo ra theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm đƣợc giải phóng, đồng thời enzyme tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác.
Sơ đồ tóm tắt của quá trình nhƣ sau: Xylanase + xylan xylan-xylanase xylanase + sản phẩm Đầu tiên cơ chất xylan xoắn ốc đƣợc đặt vào vị trí đối diện với khe giữ Tyr 65 và Tyr 69. Axit glutamic 172 là chất xúc tác axit/bazơ và axit Glutamic 78 là chất cho điện tử (nucleophile). Cơ chất bám vào vị trí Glutamic 78 tạo thành dạng sản phẩm trung gian và đƣợc giữ vững trong suốt quá trình phản ứng chuyển glycosylate. Một phân tử nƣớc thay thế vị trí của chất cho điện tử (nucleophile).
Có sự phân tách và phân tán các đƣờng (xylobiose) cho phép enzyme di chuyển đến một vị trí mới trên cơ chất. Các nguồn enzyme xylanase Enzyme xylanase có thể đƣợc lấy từ nhiều nguồn nhƣ: nấm, vi khuẩn, nấm men, sinh vật biển tảo, hạt, giáp xác, ốc,… nhƣng 2 nguồn chính đó là từ nấm và vi khuẩn. Nguồn enzyme xylanase từ vi khuẩn Xylanase đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn và xạ khuẩn (Bacillus sp.) có hiệu quả ở độ pH rộng hơn phạm vi 5-9, với nhiệt độ tối ƣu cho hoạt tính xylanase trong khoảng 35ºC đến 60ºC. Các nghiên cứu về Bacillus sp.
cho thấy hoạt tính của xylanase cao hơn ở pH kiềm và nhiệt độ cao. Do đó, xylanase của vi khuẩn đã đƣợc sử dụng 8 trong ứng dụng công nghiệp do tính kiềm của khả năng chịu đựng và khả năng chịu nhiệt (Mandal, 2015).