Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase của các chủng vi khuẩn bacillus sp

Enzyme xylanase là một trong những enzyme quan trọng trong quá trình phân giải xylan, một thành phần chính… 73 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2023.

• Tác giả: Nguyễn Thị Kiều Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Giang
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ vi sinh
• Đề tài: Tác Động Của Điều Kiện Nuôi Cấy Đến Khả Năng Sản Xuất Enzyme Xylanase Của Vi Khuẩn Bacillus
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Nội dung nghiên cứu
• 2. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về xylanase
• 2.1.1. Định nghĩa
• 2.1.2. Cấu trúc, phân loại và cơ chế xúc tác của xylanase
• 2.1.2.1. Cấu trúc và phân bố của xylan
• 2.1.2.2. Cấu trúc của enzyme xylanase
• 2.1.2.3. Phân loại
• 2.1.2.4. Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase
• 2.1.3. Các nguồn enzyme xylanase
• 2.1.3.1. Nguồn enzyme xylanase từ vi khuẩn
• 2.1.3.2. Nguồn enzyme xylanase từ nấm
• 2.1.3.3. Các loài nấm sinh tổng hợp enzyme xylanase
• 2.1.4. Ứng dụng của enzyme xylanase
• 2.1.4.1. Thức ăn chăn nuôi
• 2.1.4.2. Công nghiệp thực phẩm
• 2.2. Tổng quan về Bacillus sp.
• 2.2.1. Phân loại khoa học
• 2.2.2. Cấu trúc và hình thái của Bacillus sp.
• 2.2.3. Tình hình nghiên cứu các chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp enzyme trên thế giới và trong nước
• 2.2.3.1. Tình hình nghiên cứu các chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp enzyme tại Việt Nam
• 2.2.3.2. Tình hình nghiên cứu các chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp enzyme trên thế giới
• 3. PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.3. Đối tượng nghiên cứu
• 3.4. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 3.5. Môi trường và hoá chất sử dụng trong nghiên cứu
• 3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Xác định hoạt tính enzyme xylanase bằng phƣơng pháp khuếch tán thạch
• 3.6.2. Xác định hoạt độ xylanase của các chủng vi khuẩn
• 3.6.3. Khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh trƣởng và hoạt tính xylanase của các chủng Bacillus
• 3.6.4. Khảo sát đặc điểm sinh học và phản ứng hóa sinh của các chủng Bacillus tuyển chọn
• 3.6.4.1. Phƣơng pháp nhuộm gram
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Xác định hoạt tính enzyme xylanase bằng phƣơng pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch
• 4.2. Xác định hoạt độ xylanase
• 4.2.1. Phƣơng pháp DNS
• 4.2.2. Xác định hoat độ xylanase
• 4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh trƣởng và hoạt tính xylanase của các chủng Bacillus
• 4.3.1. Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp
• 4.3.2. Ảnh hƣởng của các giá trị pH khác nhau đến hoạt độ xylanase của các chủng vi khuẩn
• 4.3.3. Nguồn nitơ khác nhau
• 4.3.4. Nồng độ cơ chất khác nhau
• 4.4. Khảo sát đặc điểm sinh học và phản ứng hóa sinh của các chủng Bacillus tuyển chọn
• 4.4.1. Khả năng di động
• 4.4.2. Phản ứng catalase
• 4.4.3. Phản ứng MR (Methyl red)
• 4.4.4. Phản ứng VP (Voges-Proskauer)
• 4.4.5. Khả năng biến dƣỡng citrate
• 4.4.6. Khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và protease)
• 4.4.7. Kết quả nhuộm gram
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác động của điều kiện nuôi cấy đến enzyme xylanase

Enzyme xylanase là một trong những enzyme quan trọng trong quá trình phân giải xylan, một thành phần chính của hemicellulose. Vi khuẩn Bacillus được biết đến với khả năng sản xuất enzyme này. Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và chất dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến khả năng sản xuất enzyme xylanase. Nghiên cứu này sẽ phân tích các yếu tố này để tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme xylanase từ vi khuẩn Bacillus.

1.1. Định nghĩa và vai trò của enzyme xylanase

Enzyme xylanase là glycoside hydrolase, có khả năng phân hủy xylan thành xylose. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa chất hữu cơ, giúp vi khuẩn phát triển và cung cấp dinh dưỡng cho thực vật.

1.2. Tại sao Bacillus là nguồn enzyme xylanase tiềm năng

Bacillus sp. có khả năng sinh sản nhanh, chịu nhiệt và pH kiềm, làm cho chúng trở thành nguồn enzyme xylanase lý tưởng cho các ứng dụng công nghiệp.

II. Vấn đề và thách thức trong sản xuất enzyme xylanase

Mặc dù enzyme xylanase có nhiều ứng dụng, nhưng việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để tăng năng suất enzyme vẫn là một thách thức lớn. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy cần được nghiên cứu kỹ lưỡng để đạt được hiệu quả tối ưu trong sản xuất enzyme xylanase từ vi khuẩn Bacillus.

2.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động enzyme xylanase

pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme xylanase. Nghiên cứu cho thấy enzyme này hoạt động tốt nhất trong khoảng pH từ 6 đến 8.

2.2. Nhiệt độ tối ưu cho sản xuất enzyme xylanase

Nhiệt độ cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sản xuất enzyme. Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme xylanase từ Bacillus là khoảng 50-60°C.

III. Phương pháp tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy enzyme xylanase

Để tối ưu hóa khả năng sản xuất enzyme xylanase, cần áp dụng các phương pháp nghiên cứu khoa học. Việc khảo sát các điều kiện nuôi cấy như thời gian, pH, nguồn nitơ và nồng độ cơ chất là rất cần thiết.

3.1. Khảo sát thời gian nuôi cấy tối ưu

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và sản xuất enzyme. Nghiên cứu cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu cho Bacillus sp. là 24 giờ.

3.2. Nguồn nitơ ảnh hưởng đến hoạt động enzyme

Nguồn nitơ là yếu tố quan trọng trong môi trường nuôi cấy. Việc sử dụng peptone làm nguồn nitơ đã cho thấy hiệu quả cao trong việc tăng cường hoạt động enzyme xylanase.

IV. Ứng dụng thực tiễn của enzyme xylanase trong công nghiệp

Enzyme xylanase có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, dệt may và sản xuất giấy. Việc tối ưu hóa sản xuất enzyme từ Bacillus không chỉ giúp tăng năng suất mà còn giảm chi phí sản xuất.

4.1. Ứng dụng trong ngành thực phẩm

Xylanase được sử dụng trong sản xuất bánh mì, giúp cải thiện cấu trúc và độ ẩm của sản phẩm. Điều này làm tăng chất lượng và thời gian bảo quản bánh.

4.2. Ứng dụng trong ngành sản xuất giấy

Enzyme xylanase giúp giảm lượng hóa chất cần thiết trong quá trình tẩy trắng giấy, từ đó giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của enzyme xylanase

Nghiên cứu về enzyme xylanase từ vi khuẩn Bacillus cho thấy tiềm năng lớn trong việc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho sản xuất enzyme này trong tương lai.

5.1. Tương lai của nghiên cứu enzyme xylanase

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các chủng Bacillus mới có khả năng sản xuất enzyme xylanase với hiệu suất cao hơn.

5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất enzyme

Công nghệ sinh học có thể giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme xylanase, từ đó nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Xylan là thành phần cấu trúc chính của hemicellulose, chiếm khoảng 20% đến 35% tổng khối lượng chất khô của sinh khối thực vật. Cấu tạo của xylan gồm mạch chính là các gốc D-xylopyranose liên kết với nhau qua cầu nối $\beta$-1,4-glycoside cùng các chuỗi nhánh phụ như $O$-acetyl, $\alpha$-L-arabinofuranosyl và $\alpha$-D-glucuronosyl. Để phân cắt hoàn toàn cấu trúc phức tạp này thành các phân tử đường đơn hoặc đường ngắn, cần sự xúc tác đồng bộ của hệ enzyme xylanase.

Trong công nghệ sinh học ứng dụng, enzyme xylanase giữ vai trò trọng yếu trong nhiều ngành sản xuất:

• Công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy: Xylanase hỗ trợ quá trình tẩy trắng sinh học bột giấy kraft, làm giảm lượng hóa chất chứa clo ($\text{Cl}_2$, $\text{ClO}_2$) cần sử dụng, từ đó hạn chế phát thải độc hại ra môi trường.
• Chăn nuôi và sản xuất thức ăn gia súc: Bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn giúp phân giải arabinoxylan khó tiêu, làm giảm độ nhớt dịch tiêu hóa trong đường ruột gia cầm, nâng cao khả năng hấp thu chất dinh dưỡng và cải thiện hệ số chuyển đổi thức ăn.
• Công nghiệp chế biến thực phẩm và đồ uống: Kết hợp xylanase cùng cellulase và amylase giúp làm tăng hiệu suất trích ly và làm trong nước ép trái cây, cải thiện độ đàn hồi của mạng lưới gluten trong bột nhào làm bánh mì, cũng như hỗ trợ quá trình lọc trong công nghệ sản xuất bia và cồn sinh học.
• Công nghiệp hóa chất: Chuyển hóa sinh khối chứa xylan thành xylose để tổng hợp xylitol và các hợp chất có giá trị kinh tế.

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus sở hữu nhiều ưu điểm vượt trội so với vi nấm và xạ khuẩn: tốc độ sinh trưởng nhanh, chu kỳ nuôi cấy ngắn, chi phí sản xuất thấp, khả năng thích nghi cao và enzyme ngoại bào thường có độ bền nhiệt cũng như hoạt động tốt ở dải pH kiềm. Nhằm khai thác nguồn vi sinh vật phục vụ sản xuất enzyme, đề tài "Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase của các chủng vi khuẩn Bacillus sp." được thực hiện với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

Mục tiêu nghiên cứu

1. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme xylanase của một số chủng Bacillus sp.
2. Đánh giá hoạt tính và xác định hoạt độ enzyme xylanase sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn Bacillus sp. tuyển chọn.
3. Khảo sát đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh hóa đặc trưng của các chủng Bacillus sp. tuyển chọn.

Nhiệm vụ nghiên cứu

1. Khảo sát khả năng sinh trưởng và phân giải xylan của tập hợp chủng vi khuẩn thí nghiệm.
2. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đơn biến đến khả năng sinh tổng hợp xylanase:
   • Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy (6h, 12h, 18h, 24h, 30h).
   • Ảnh hưởng của các giá trị pH môi trường (pH 6, 7, 8, 9, 10).
   • Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau ($\text{NH}_4\text{NO}_3$, $\text{NH}_4\text{H}_2\text{PO}_4$, chiết xuất thịt bò, peptone).
   • Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất xylan (1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L).
3. Đánh giá đặc điểm hình thái tế bào và các chỉ tiêu sinh hóa (khả năng di động, phản ứng catalase, phản ứng Methyl Red, phản ứng Voges-Proskauer, khả năng biến dưỡng citrate, hoạt tính cellulase và protease ngoại bào).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: 24 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus sp. lưu trữ tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 08/2022 đến tháng 02/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm chuyên ngành

• Bản chất enzyme xylanase: Endo-1,4-$\beta$-xylanase (EC 3.2.1.8; tên hệ thống: 4-$\beta$-D-xylan xylanohydrolase) thuộc họ Glycoside Hydrolase (chủ yếu là họ GH10 và GH11). Enzyme xúc tác phản ứng cắt đứt ngẫu nhiên các liên kết nội mạch $\beta$-1,4-glycoside của phân tử xylan, giải phóng các đoạn oligomer ngắn và đường D-xylose.
• Cơ chế xúc tác: Phản ứng thủy phân diễn ra qua cơ chế thế nucleophile với sự tham gia của hai gốc acid glutamic tại trung tâm hoạt động (một gốc đóng vai trò chất xúc tác acid/base, một gốc đóng vai trò tác nhân nucleophile), tạo thành phức hệ trung gian enzyme - cơ chất trước khi phân tử nước tấn công để giải phóng sản phẩm đường khử.
• Đặc điểm vi sinh vật học chi Bacillus: Là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, thuộc họ Bacillaceae, ngành Firmicutes. Tế bào có khả năng tạo nội bào tử chịu đựng được các điều kiện môi trường bất lợi (nhiệt độ cao, khô hạn, hóa chất). Đa số các loài phát triển tối ưu ở pH trung tính ($\text{pH} \approx 7,0$) và nhiệt độ từ 30°C đến 45°C.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp vi sinh vật học và hóa sinh thực nghiệm định lượng:

1. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Sàng lọc sơ bộ):

   • Môi trường thử nghiệm bổ sung 0,5% xylan. Tạo các giếng thạch có đường kính $d = 0,7\text{ cm}$.
   • Nhỏ $100\ \mu\text{L}$ dịch chiết enzyme thô vào giếng, ủ ở 4°C trong 2 giờ để khuếch tán, sau đó ủ ở 30°C trong 6 giờ.
   • Nhuộm bề mặt đĩa bằng dung dịch thuốc thử Lugol. Hoạt tính phân giải xylan ($VPG$) được xác định thông qua hiệu số giữa đường kính vòng phân giải ($D$) và đường kính giếng thạch ($d$): $$VPG = D - d\text{ (cm)}$$

2. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme bằng thuốc thử DNS:

   • Hoạt độ xylanase được đo lường dựa trên phản ứng so màu giữa đường khử giải phóng (xylose) và acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS).
   • Xây dựng đường chuẩn xylose ở dải nồng độ từ 0,2 đến 2,0 mg/L, đo mật độ quang ở bước sóng $\lambda = 540\text{ nm}$ (blank là nước cất).
   • Tiến hành phản ứng enzyme: $0,2\text{ mL}$ dịch nuôi cấy phối trộn cùng $1\text{ mL}$ cơ chất xylan 1% (pha trong đệm phosphate, pH 7,0), ủ ở 45°C trong 30 phút. Bổ sung $1\text{ mL}$ thuốc thử DNS, đun sôi cách thủy 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh và đo $\text{OD}_{540}$.
   • Một đơn vị hoạt độ ($1\text{ U/mL}$) được định nghĩa là lượng enzyme giải phóng được $1\ \mu\text{mol}$ đường khử tương đương xylose trong thời gian 1 phút ở điều kiện thí nghiệm.

3. Phương pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh tổng hợp:

   • Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường khoáng tối thiểu (MSM) bổ sung xylan, lắc ở tốc độ 120–121 vòng/phút, nhiệt độ 30°C.
   • Khảo sát động học thời gian nuôi: Thu mẫu định kỳ mỗi 6 giờ trong vòng 30 giờ (6h, 12h, 18h, 24h, 30h).
   • Khảo sát dải pH ban đầu: Điều chỉnh môi trường đạt các mức pH 6, 7, 8, 9, 10.
   • Khảo sát nguồn nitơ: Bổ sung lần lượt $\text{NH}_4\text{NO}_3$, $\text{NH}_4\text{H}_2\text{PO}_4$, chiết xuất thịt bò và peptone.
   • Khảo sát nồng độ cơ chất: Bổ sung xylan với các nồng độ 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L và 4 g/L.

4. Phương pháp khảo sát đặc tính sinh học và phản ứng hóa sinh:

   • Nhuộm Gram: Nhuộm tế bào với tím gentian, dung dịch Lugol, tẩy màu bằng cồn 96° và nhuộm bổ sung bằng fuchsin; quan sát kính hiển vi quang học ở độ phóng đại $\times 100$ với dầu soi kính.
   • Khả năng di động: Cấy đâm sâu vào môi trường thạch mềm LB chứa 0,5% agar, ủ ở 30°C trong 24 giờ.
   • Thử nghiệm catalase: Nhỏ dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2\ 3%$ lên sinh khối vi khuẩn trên lam kính, quan sát hiện tượng sủi bọt khí oxy.
   • Phản ứng Methyl Red (MR) và Voges-Proskauer (VP): Nuôi cấy trong môi trường MR-VP broth trong 2–3 ngày; nhỏ thuốc thử methyl red kiểm tra sản phẩm acid bền, hoặc phối trộn dung dịch $\alpha$-naphthol 5% và NaOH 16% (hoặc 40%) để phát hiện sản phẩm acetoin.
   • Khả năng biến dưỡng citrate: Cấy vi khuẩn lên môi trường thạch nghiêng Simmons Citrate Agar (SCA), ủ 30°C trong 24–48 giờ; ghi nhận sự chuyển màu chỉ thị từ xanh lục sang xanh dương do kiềm hóa môi trường.
   • Khả năng sinh enzyme ngoại bào khác: Nhỏ dịch chiết lên đĩa thạch chứa 1% gelatin (thử protease, nhuộm thuốc thử amido đen) và 1% carboxymethylcellulose - CMC (thử cellulase, nhuộm Lugol).

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Phần mở đầu nêu rõ vai trò của sinh khối hemicellulose trong tự nhiên, ý nghĩa kinh tế - kỹ thuật của việc ứng dụng xylanase trong công nghiệp giấy, chế biến thức ăn chăn nuôi và xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp. Tác giả xác định tính cấp thiết của việc tìm kiếm, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính cao và tối ưu hóa các thông số nuôi cấy nhằm nâng cao năng suất sinh tổng hợp enzyme.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước:

• Phân tích cấu trúc phân tử xylan (arabinoxylan, glucuronoxylan, glucuronoarabinoxylan), phân loại xylanase thuộc các họ Glycoside Hydrolase (đặc biệt là đặc điểm cấu trúc không gian dạng "bàn tay phải" của họ GH11) và cơ chế xúc tác phân cắt liên kết glycoside.
• So sánh nguồn sinh tổng hợp xylanase: Enzyme từ nấm sợi (Aspergillus, Trichoderma) thường có hoạt tính cao nhưng thích hợp ở pH acid (pH 4–6) và kém bền nhiệt; trong khi xylanase từ vi khuẩn Bacillus sp. hoạt động ở dải pH rộng hơn (pH 5–9, chịu được môi trường kiềm) và bền nhiệt hơn (35°C–60°C).
• Tổng thuật tình hình nghiên cứu: Các nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhiên (2011) về chủng Bacillus subtilis $\text{B}_2\text{H}_2$; Đặng Tất Thành và CS (2016) trên Aspergillus brunneoviolaceus FEC 156; cùng các công bố quốc tế của Gaur và CS (2015) trên Bacillus vallismortis RSPP-15, Kumar và CS (2018), Nagar và CS (2012).

Phần III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục thiết bị (máy đo quang phổ mật độ quang, máy ly tâm lạnh, nồi hấp vô trùng, máy lắc ủ vi sinh), thành phần các môi trường hóa chất (MSM, LB, MR-VP, SCA, đệm phosphate, dung dịch DNS, thuốc thử nhuộm Gram) và chuẩn hóa các bước thao tác thực nghiệm từ khâu tạo giống khởi động, nuôi lắc, thu enzyme thô đến các phản ứng định lượng hóa sinh.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả tập trung vào 4 nhóm nội dung thực nghiệm chính:

1. Sàng lọc khả năng phân giải xylan của 24 chủng vi khuẩn ban đầu, xác định 16 chủng cho vòng phân giải thạch rõ rệt với đường kính $VPG$ từ 0,6 cm đến 1,2 cm (chủng GA4.2 đạt cực đại 1,2 cm).
2. Xây dựng đường chuẩn xylose theo phương pháp DNS đạt hệ số tương quan tuyến tính cao: $y = 0,614x - 0,0047$ ($R^2 = 0,9977$). Xác định hoạt độ xylanase của 16 chủng dao động trong khoảng 141,33 – 196,00 U/mL (chủng B1.5 đạt cao nhất 196,00 U/mL).
3. Đánh giá động học sinh tổng hợp enzyme qua các điều kiện nuôi cấy:
   • Thời gian: Hoạt độ enzyme tăng dần từ 6h đến 24h và bắt đầu suy giảm ở mốc 30h. Mốc 24h cho hoạt độ trung bình cao nhất đạt 182,42 U/mL.
   • pH môi trường: pH = 7,0 là giá trị tối ưu, cho hoạt độ trung bình 174,04 U/mL (giảm dần khi đưa về pH 6 hoặc nâng lên pH 8–10).
   • Nguồn nitơ: Peptone cho kết quả sinh tổng hợp vượt trội so với $\text{NH}_4\text{NO}_3$, $\text{NH}_4\text{H}_2\text{PO}_4$ và chiết xuất thịt bò (hàm lượng xylose trung bình đạt trên 3,0 mg/mL).
   • Nồng độ cơ chất: Nồng độ xylan 3 g/L là mức thích hợp nhất để kích ứng sinh tổng hợp xylanase.
4. Xác định đặc tính sinh học: 16 chủng tuyển chọn đều là trực khuẩn Gram dương, có khả năng di động, cho phản ứng catalase (+), Methyl Red (+), biến dưỡng citrate (+), đồng thời có khả năng tiết protease và cellulase ngoại bào.

Phần V: Kết luận và kiến nghị

Tóm lược các kết quả đạt được về chủng vi khuẩn triển vọng nhất và bộ thông số nuôi cấy tối ưu; đồng thời đề xuất tiếp tục nghiên cứu định danh phân tử và thử nghiệm sản xuất ở quy mô lớn hơn.

---

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm chính

Quá trình nghiên cứu thực nghiệm đã ghi nhận các kết quả định lượng cụ thể:

STT	Tên chủng vi khuẩn tuyển chọn	Đường kính vòng phân giải $VPG$ (cm)	Hàm lượng Xylose giải phóng (mg/mL)	Hoạt độ Xylanase ở điều kiện cơ bản (U/mL)
1	B1.5	1,1	2,94	196,00
2	GA4.2	1,2	2,85	190,00
3	G1.4	1,0	2,88	192,00
4	G1.7	0,9	2,75	183,33
5	G1.9	1,0	2,80	186,67
6	G1.6	0,6	2,12	141,33
7	B11.2	0,8	2,64	176,00
8	L1.4	0,9	2,78	185,33

Bảng: Trích xuất một số chỉ tiêu hoạt tính của các chủng Bacillus sp. tiêu biểu trong nghiên cứu.

Bộ thông số nuôi cấy tối ưu xác định từ thực nghiệm:

• Thời gian nuôi cấy tối ưu: 24 giờ (hoạt độ trung bình đạt đỉnh 182,42 U/mL; tại mốc 6h chỉ đạt 1,33 U/mL, mốc 12h đạt 166,00 U/mL, mốc 18h đạt 167,00 U/mL và giảm xuống 100,00 U/mL ở 30h).
• pH môi trường tối ưu: $\text{pH} = 7,0$ (hoạt độ xylanase trung bình đạt 174,04 U/mL; tại pH 6 đạt 85,04 U/mL, tại pH 8 đạt 159,00 U/mL, tại pH 10 giảm còn 128,00 U/mL).
• Nguồn dinh dưỡng nitơ tối ưu: Peptone (hàm lượng xylose trung bình đạt trên 3,0 mg/mL; chủng G1.7 đạt cực đại 3,7 mg/mL). Hiệu quả phân giải giảm dần theo thứ tự: Peptone > $\text{NH}_4\text{NO}_3$ (2,49 mg/mL) > $\text{NH}_4\text{H}_2\text{PO}_4$ (2,11 mg/mL) > Chiết xuất thịt bò (1,19 mg/mL).
• Nồng độ cơ chất cảm ứng tối ưu: Xylan ở mức 3 g/L.

Đóng góp học thuật và so sánh nghiên cứu

• Đóng góp khoa học: Nghiên cứu đã sàng lọc thành công tập hợp 16 chủng Bacillus sp. nội địa có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase ngoại bào với hoạt tính phân giải cao (141,33 – 196,00 U/mL). Đồng thời, đề tài đã thiết lập được bộ thông số môi trường tối ưu (thời gian, pH, nguồn nitơ, nồng độ cơ chất) phục vụ quá trình nuôi cấy thu hồi enzyme.
• So sánh với các công bố:
  • Hoạt độ xylanase của chủng B1.5 (196,00 U/mL) cao hơn đáng kể so với hoạt độ của chủng Bacillus subtilis trong nghiên cứu lên men chìm của Irfan Muhammad (2016) (chỉ đạt 50 U/mL) và chủng Bacillus haynesii K6 của Bakry & Salem (2022) (đạt 26,27 U/mL sau 24h).
  • Kết quả hoạt độ xylanase của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu tương đương với hoạt tính hệ enzyme từ vi nấm Aspergillus brunneoviolaceus FEC 156 của Đặng Tất Thành & Nguyễn Thanh Thủy (2016) (đạt 187,1 U/mL).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Thí nghiệm khảo sát điều kiện nuôi cấy mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác thể tích 200 mL, chứa 50 mL môi trường nuôi cấy lỏng), chưa được thử nghiệm trên các hệ thống lên men pilot hoặc quy mô bán công nghiệp có kiểm soát liên tục nồng độ oxy hòa tan và tốc độ khuấy.
• Việc phân loại các chủng vi sinh vật tuyển chọn chỉ mới dựa trên đặc điểm hình thái tế bào và các phản ứng sinh hóa thông thường, chưa tiến hành giải trình tự gen 16S rRNA để định danh chính xác đến mức loài.
• Chưa đi sâu vào quy trình tinh sạch enzyme chuyên sâu (sắc ký cột, lọc gel) và chưa đánh giá đầy đủ các đặc tính động học của enzyme (nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt, ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính xúc tác).

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiến hành tách chiết DNA tổng số, khuếch đại và giải trình tự gen 16S rDNA để định danh phân loại chính xác các chủng có hoạt tính cao (đặc biệt là chủng B1.5, GA4.2, G1.4).
• Khảo sát khả năng tận dụng các nguồn cơ chất phế phụ phẩm nông nghiệp giàu hemicellulose có chi phí thấp (cám mì, bã mía, rơm rạ, lõi ngô) thay thế cho xylan tinh khiết trong quá trình lên men.
• Tinh chế enzyme xylanase thô và nghiên cứu ứng dụng thực tế của chế phẩm enzyme trong xử lý bột giấy hoặc làm phụ gia thức ăn chăn nuôi gia cầm.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực đối với:

• Sinh viên và học viên cao học: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Vi sinh, Vi sinh vật học ứng dụng, Hóa sinh học và Công nghệ Thực phẩm.
• Nghiên cứu viên và kỹ thuật viên phòng thí nghiệm: Những người đang thực hiện các đề tài liên quan đến sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào, tối ưu hóa môi trường lên men hoặc đánh giá hoạt tính sinh học.

Các nội dung có giá trị tham khảo cao trong khóa luận:

• Quy trình chuẩn hóa phương pháp định lượng đường khử bằng thuốc thử DNS và phương pháp dựng đường chuẩn xylose tuyến tính.
• Hệ thống quy trình thực nghiệm các phản ứng hóa sinh chẩn đoán vi khuẩn chi Bacillus (nhuộm Gram, di động, catalase, MR-VP, citrate, phân giải gelatin và CMC).
• Phương pháp luận thiết kế thí nghiệm đơn yếu tố nhằm khảo sát các điều kiện nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn nào đạt hoạt độ xylanase cao nhất trong nghiên cứu và giá trị đạt được là bao nhiêu?

Trong số 16 chủng Bacillus sp. được tuyển chọn, chủng B1.5 đạt hoạt độ enzyme xylanase cao nhất với giá trị 196,00 U/mL, tương ứng với hàm lượng đường xylose giải phóng là 2,94 mg/mL.

2. Các thông số nuôi cấy tối ưu được xác định cho các chủng Bacillus sp. sinh xylanase là gì?

Các điều kiện nuôi cấy tối ưu bao gồm:

• Thời gian nuôi cấy: 24 giờ (hoạt độ trung bình đạt 182,42 U/mL).
• Giá trị pH môi trường: $\text{pH} = 7,0$ (hoạt độ trung bình đạt 174,04 U/mL).
• Nguồn nitơ bổ sung: Peptone (cho hàm lượng xylose giải phóng trung bình cao nhất đạt trên 3,0 mg/mL).
• Nồng độ cơ chất xylan: 3 g/L.

3. Tác giả đã sử dụng phương pháp nào để xác định hoạt độ enzyme xylanase và đường chuẩn có thông số ra sao?

Tác giả sử dụng phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5-dinitrosalicylic) đo độ hấp thụ quang ở bước sóng $\lambda = 540\text{ nm}$. Đường chuẩn xylose được thiết lập trên dải nồng độ 0,2 – 2,0 mg/L với phương trình hồi quy tuyến tính: $$y = 0,614x - 0,0047$$ Hệ số tương quan đạt $R^2 = 0,9977$.

4. Kết quả kiểm tra đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh hóa của 16 chủng Bacillus sp. tuyển chọn cho thấy những gì?

Tất cả 16 chủng tuyển chọn đều là trực khuẩn Gram dương, có khả năng di động, và đều cho kết quả dương tính (+) với các phản ứng sinh hóa: thử nghiệm catalase, phản ứng Methyl Red (MR), khả năng biến dưỡng citrate trên môi trường SCA, đồng thời có khả năng tiết các enzyme ngoại bào khác gồm protease (phân giải gelatin) và cellulase (phân giải CMC).

5. Nguồn nitơ nào cho hiệu quả sinh tổng hợp enzyme xylanase cao nhất và thứ tự suy giảm giữa các nguồn nitơ được khảo sát như thế nào?

Peptone là nguồn nitơ thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp xylanase (chủng G1.7 đạt hàm lượng xylose lên tới 3,7 mg/mL). Hiệu quả sinh tổng hợp giảm dần theo thứ tự: Peptone > $\text{NH}_4\text{NO}_3$ > $\text{NH}_4\text{H}_2\text{PO}_4$ > Chiết xuất thịt bò.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Kiều Anh đã sàng lọc thành công 16 chủng vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase ngoại bào từ 24 chủng ban đầu, trong đó chủng B1.5 thể hiện hoạt độ cao nhất đạt 196,00 U/mL. Nghiên cứu đã xác lập được hệ thống điều kiện nuôi cấy tối ưu ở quy mô phòng thí nghiệm gồm: thời gian nuôi 24 giờ, pH môi trường bằng 7,0, nguồn nitơ peptone và nồng độ xylan 3 g/L. Toàn bộ các chủng tuyển chọn đều mang đặc điểm hình thái trực khuẩn Gram dương, có khả năng di động và dương tính với các phản ứng sinh hóa đặc trưng của chi Bacillus. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho các nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase trong công nghiệp giấy, chế biến thực phẩm và sản xuất thức ăn chăn nuôi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Xylan là thành phần chính của hemicellulose, chiếm 20-35% khối lƣợng chất khô. Thành phần của xylan bao gồm mạch chính đƣợc cấu tạo bởi đƣờng D-xylopyranose thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên Oacetyl, α-L- arabinofuranosyl, α-D-glucuronosyl. Để thủy phân hoàn toàn xylan cần có sự tham gia hoạt động của tổ hợp xylanase (Nascimento & cs. Đến nay, xylanase từ vi sinh vật đƣợc quan tâm chú ý mạnh mẽ bởi khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ bột giấy, thức ăn chăn nuôi, chuyển hóa lignocellulose, cồn sinh học và công nghiệp đồ uống (Vũ Văn Lợi & cs.

Vi khuẩn có nhiều đặc điểm vƣợt trội hơn so với các sinh vật khác, biểu hiện ở khả năng sinh sản nhanh, vòng đời ngắn và chi phí nghiên cứu thấp nên rất phù hợp cho việc nghiên cứu các sản phẩm thứ cấp nói chung và enzyme xylanase nói riêng. Xylanase đƣợc sinh tổng hợp bởi rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau nhƣ vi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn (Fusarium oxysporum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger,…). Trong đó, xylanase từ xạ khuẩn đƣợc công bố có khả năng chịu nhiệt, chịu kiềm và không có hoạt tính cellulase (Rifaat, 2006). Hiện nay, enzyme xylanase đƣợc ứng dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực nhƣ: nghành chăn nuôi, nông nghiệp, công nghiệp, sản xuất giấy và hoá chất.

Sử dụng xylanase trong tẩy trắng bột giấy giúp làm giảm lƣợng chlorine (Cl2) và hypochlorine (ClO2) dùng trong tẩy trắng, đồng thời giảm lƣợng hóa chất thải ra môi trƣờng. Xylanase bổ sung vào chế độ ăn dựa trên lúa mạch đen của gà thịt dẫn đến giảm độ nhớt đƣờng ruột, do đó cải thiện cả tăng trọng của gà con và hiệu quả chuyển đổi thức ăn của chúng (Bedford & Classen, 1992). Xylanase kết hợp với cellulase và amylase, dẫn đến năng suất nƣớc trái cây đƣợc cải thiện bằng phƣơng pháp hóa lỏng trái cây và rau quả, tăng thu hồi hƣơng liệu, tinh 2 dầu, vitamin, muối khoáng, giảm độ nhớt và sự thủy phân của các chất (Bajpai & Pratima. Chính vì những ứng dụng có tính cấp thiết hiện tại, đề tài “Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase của các chủng vi khuẩn Bacillus sp.” đƣợc thực hiện.

Mục đích - Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của một số chủng Bacillus sp. - Đánh giá hoạt tính xylanase sinh tổng hợp từ các chủng Bacillus sp. - Đặc điểm hình thái và sinh hoá của các chủng Bacillus sp. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát khả năng sinh trƣởng của một số chủng vi khuẩn - Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanse:  Thời gian nuôi  Các giá trị pH khác nhau  Nồng độ cơ chất khác nhau  Nguồn nitơ khác nhau  Đặc điểm hình thái, sinh hoá 3 PHẦN II.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về xylanase 2. Định nghĩa Xylanase là một enzym phức tạp, bao gồm endoxylanase (E.55) và acetylxylan esterase (E. Endo-1,4-β-xylanase (EC 3.8, tên hệ thống 4-β-D-xylan xylanohydrolase) là một loại enzyme phân hủy polysacarit xylan tuyến tính thành xyloza.

Enzyme này phá vỡ hemicellulose, một trong những thành phần chính của thành tế bào thực vật (Contributors, 2022). Xylanase đóng một vai trò quan trọng đối với vi sinh vật phát triển mạnh trên các nguồn thực vật để phân hủy chất thực vật thành các chất dinh dƣỡng có thể sử dụng đƣợc. Xylanase đƣợc tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, nấm men, tảo biển, động vật nguyên sinh, ốc sên, động vật giáp xác, côn trùng (Polizeli & cs. Xylanase có khả năng hấp thụ và phân hủy xylan, một loại glucan nằm trong bột gạo và các sản phẩm gạo.

Xylanase có tính chất của lysozyme, giúp sản xuất bột có độ bền cao, giảm độ pH của bột gạo. Xylanase đƣợc sử dụng trong sản xuất bột gạo vì nó có thể hấp thụ và phân hủy các loại xylan trong bột, giảm đƣợc thời gian pha trộn, giảm đƣợc nồng độ pH của bột. Cấu trúc, phân loại và cơ chế xúc tác của xylanase 2. Cấu trúc và phân bố của xylan Cơ chất của enzyme xylanase là xylan.

Xylan là polysacarit phong phú thứ hai trong tự nhiên, chiếm khoảng một phần ba lƣợng carbon hữu cơ tái tạo trên trái đất (Collins & cs. Xylan chủ yếu hiện diện trong thành tế bào thứ cấp cùng với cellulose (1,4-β-glucan) và lignin (một hợp chất 4 polyphenolic phức tạp) tạo thành các thành phần polyme chính của thành tế bào thực vật. Trong cấu trúc thành tế bào, cả ba thành phần tƣơng tác thông qua các liên kết cộng hóa trị và không cộng hóa trị (Motta & cs. Dựa trên các nhóm thế phổ biến đƣợc tìm thấy trên bộ khung của phân tử xylan, xylan đƣợc phân loại thành homoxylan tuyến tính, arabinoxylan, glucuronoxylan hoặc glucuronoarabinoxylan.

Cấu trúc của xylan và các enzyme thủy phân xylan (Sunna & Antranikian, 1997). - Arabinoxylans, chỉ có chuỗi bên của các đơn vị đầu cuối đơn lẻ của các nhóm thế α-L-arabinofuranosyl. Trong trƣờng hợp cụ thể của ngũ cốc, arabinoxylan khác nhau về mức độ thay thế arabinosyl, với gốc 2-O- và 3-O- đƣợc thế đơn hoặc kép (2-O-, 3-O-) đƣợc thế xylosyl. - Glucuronoxylans, trong đó axit α-D-glucuronic hoặc dẫn xuất 4-O- metyl ete của nó là nhóm thế duy nhất.

- Glucuronoarabinoxylan, trong đó axit α-D-glucuronic (và 4-O- metyl-α-D-glucuronic) và α-L-arabinose đều có mặt. - Galactoglucuronoarabinoxylans, đƣợc đặc trƣng bởi sự hiện diện của gốc β-D-galactopyranosyl cuối cùng trên chuỗi bên oligosacarit phức tạp 5 của xylan và thƣờng đƣợc tìm thấy trong thực vật lâu năm. Xylan đƣợc phân bố trong một số loại mô và tế bào, hiện diện trong nhiều loài thực vật đƣợc tìm thấy với số lƣợng lớn trong gỗ cứng từ thực vật hạt kín (15–30% thành phần vách tế bào) và gỗ mềm từ thực vật hạt trần (7– 10%), cũng nhƣ trong cây hàng năm (<30%). Xylan gỗ tồn tại dƣới dạng O- acetyl-4-O-methylglucuronoxylan trong gỗ cứng và arabino-4-O- methylglucuronoxylan trong gỗ mềm, trong khi xylan trong cỏ và cây hàng năm thƣờng là arabinoxylan.

Xylan không thay thế tuyến tính cũng đã đƣợc báo cáo trong cỏ esparto, thuốc lá và một số loại tảo biển, với loại sau có chứa gốc xylopyranosyl đƣợc liên kết bởi cả hai liên kết 1,3-β và 1,4-β (Motta & cs. Cấu trúc của enzyme xylanase Cấu trúc không gian của xylanase đƣợc tìm thấy ở nhiều vi khuẩn và nấm thuộc họ 10 và 11. Có nhiều enzyme của họ 10 đáng chú ý: gồm một module gắn kết carbohydrate đƣợc gắn bằng một cầu nối linh động. Các xylanase của họ 11 thƣờng có các domain xúc tác cao từ 180-200 cấu tử gấp cuộn thành một motif β-sheet đƣợc gọi là gấp β-jelly-roll.

Chúng đặc hiệu với xylan hơn bình thƣờng và không có các domain phụ. Cấu trúc không gian 3D của enzyme xylanase (Heinen & cs. 6 So với các xylanase khác, các thành viên của họ 11 thể hiện một số tính chất hấp dẫn, chẳng hạn nhƣ tính chọn lọc cơ chất cao và khả năng xúc tác cao hiệu quả, kích thƣớc nhỏ và phạm vi pH tối ƣu và các giá trị nhiệt độ, làm cho chúng phù hợp trong các điều kiện khác nhau và trong nhiều ứng dụng. Cấu trúc không gian 3D của họ 11 xylanase có hình dạng tổng thể của bàn tay phải.

Nó bao gồm gồm hai tấm gấp nếp b lớn và một chuỗi xoắn đơn tạo thành một cấu trúc tƣơng tự nhƣ một bàn tay phải (Walia & cs. Phân loại Enzyme xylanase là glycoside hydrolase (GH) đƣợc phân loại trên cơ sở tƣơng đồng trong các yếu tố cấu trúc và nhóm kỵ nƣớc thành một số họ, tức là 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 26, 30, 43, 44, 51 và 62, có thể thủy phân liên kết b-1,4 glycosid của xyloside từ đó đƣờng hemiacet và aglycone không đƣờng có nguồn gốc. Các trình tự đƣợc phân loại trong các họ 16, 51 và 62 dƣờng nhƣ là các enzyme nhị phân chứa hai miền xúc tác, không giống nhƣ các họ 5, 7, 8, 10, 11 và 43, có sự khác biệt thực sự miền xúc tác với hoạt tính endo-1,4-b-xylanase (Collins & cs. Dựa vào cấu trúc phân tử mà xylanase đƣợc phân thành 2 nhóm: nhóm enzyme có 1 domain và nhóm có nhiều domain.

Các domain gắn kết với cellulose, hầu hết là các domain không có chức năng xúc tác ở xylanse, chúng thúc đẩy việc gắn kết các dạng cellulose crystalline hoặc amorphous khác nhau và có thể bẻ gãy vì sợi cellulose để cellulase phân giải dễ dàng hơn. Phân loại dựa theo tính chất lý hoá: - Nhóm có phân tử khối thấp (<30 kDa) và pI (điểm đẳng điện) trung tính. - Nhóm có phân tử khối cao (>30 kDa) và pI axit 2. Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase Cơ chế hoạt động của xylanase bao gồm các bƣớc sau Bƣớc 1: Enzyme xylanase nhận biết xylan và liên kết với nó bằng cách thay đổi cấu hình ở phần cánh trái cuộn xoắn lại 3 lần.

7 Bƣớc 2: Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác, liên kết glycoside bị kéo căng và bị bẻ gãy và tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị enzyme - cơ chất. Bƣớc 3: Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nƣớc hoạt động. Phân tử nƣớc này tách thành ion H+ và OH‒. Ion H+ gắn vào gốc glycosyl vừa đƣợc tách ra trong khi ion OH‒ gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo ra theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm đƣợc giải phóng, đồng thời enzyme tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác.

Sơ đồ tóm tắt của quá trình nhƣ sau: Xylanase + xylan xylan-xylanase xylanase + sản phẩm Đầu tiên cơ chất xylan xoắn ốc đƣợc đặt vào vị trí đối diện với khe giữ Tyr 65 và Tyr 69. Axit glutamic 172 là chất xúc tác axit/bazơ và axit Glutamic 78 là chất cho điện tử (nucleophile). Cơ chất bám vào vị trí Glutamic 78 tạo thành dạng sản phẩm trung gian và đƣợc giữ vững trong suốt quá trình phản ứng chuyển glycosylate. Một phân tử nƣớc thay thế vị trí của chất cho điện tử (nucleophile).

Có sự phân tách và phân tán các đƣờng (xylobiose) cho phép enzyme di chuyển đến một vị trí mới trên cơ chất. Các nguồn enzyme xylanase Enzyme xylanase có thể đƣợc lấy từ nhiều nguồn nhƣ: nấm, vi khuẩn, nấm men, sinh vật biển tảo, hạt, giáp xác, ốc,… nhƣng 2 nguồn chính đó là từ nấm và vi khuẩn. Nguồn enzyme xylanase từ vi khuẩn Xylanase đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn và xạ khuẩn (Bacillus sp.) có hiệu quả ở độ pH rộng hơn phạm vi 5-9, với nhiệt độ tối ƣu cho hoạt tính xylanase trong khoảng 35ºC đến 60ºC. Các nghiên cứu về Bacillus sp.

cho thấy hoạt tính của xylanase cao hơn ở pH kiềm và nhiệt độ cao. Do đó, xylanase của vi khuẩn đã đƣợc sử dụng 8 trong ứng dụng công nghiệp do tính kiềm của khả năng chịu đựng và khả năng chịu nhiệt (Mandal, 2015).