Tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết vi khuẩn bacillus sp rd26 nội sinh cây diệp hạ châu đắng phyllanthus amarus

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ vi khuẩn Bacillus sp. RD26 và cây diệp hạ châu đắng đang thu… 86 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2020.

• Tác giả: Nguyễn Quốc Khang
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tinh Chế Hợp Chất Sinh Học Từ Vi Khuẩn Bacillus Sp. RD26 Và Cây Diệp Hạ Châu Đắng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. VI KHUẨN BACILLUS
• 1.2. Phân loại khoa học
• 1.3. Ứng dụng của Bacillus
• 1.4. NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC LÝ
• 1.5. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
• 1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
• 1.6.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
• 1.6.2. Phương pháp sắc ký cột cổ điển (CC)
• 1.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 1.7.1. Phương pháp tự sinh đồ
• 1.7.2. Phương pháp pha loãng
• 1.7.3. Phương pháp khuếch tán
• 1.7.4. Các phương pháp thử độc tính tế bào
• 1.8. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT
• 1.8.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
• 1.8.2. Phương pháp phân tích sắc ký khí – khối phổ (GC-MS)
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 2.2. Chủng vi sinh vật nghiên cứu
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
• 2.4.2. Phương pháp nhuộm bào tử
• 2.4.3. Phương pháp phân lập hợp chất
• 2.4.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất
• 2.4.5. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CHẤT TINH
• 3.2. Phương pháp lên men thu nhận sinh khối
• 3.3. Phương pháp thu cao chiết methanol
• 3.4. Điều chế các phân đoạn từ cao methanol
• 3.5. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN MRSA CỦA CAO TỔNG VÀ CAO PHÂN ĐOẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐĨA GIẤY
• 3.5.1. Khảo sát khả năng kháng MRSA của cao tổng
• 3.5.2. Khảo sát khả năng kháng MRSA của các cao phân đoạn
• 3.6. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HỢP CHẤT
• 3.6.1. Xác định cấu trúc hợp chất BR04
• 3.6.2. Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất BR04
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ vi khuẩn Bacillus sp. RD26 và cây diệp hạ châu đắng đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực dược phẩm. Bacillus sp. là một trong những nguồn tài nguyên phong phú cho việc phát triển các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) cũng được biết đến với nhiều tác dụng dược lý. Việc kết hợp giữa hai nguồn tài nguyên này hứa hẹn sẽ mang lại những kết quả nghiên cứu đầy tiềm năng.

1.1. Tìm Hiểu Về Bacillus Sp. Và Tác Dụng Của Chúng

Vi khuẩn Bacillus có khả năng sản xuất nhiều hợp chất sinh học có giá trị. Chúng được biết đến với khả năng kháng khuẩn và kháng nấm, giúp bảo vệ cây trồng và con người khỏi các bệnh lý. Nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất này có thể được sử dụng trong điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm cả ung thư.

1.2. Cây Diệp Hạ Châu Đắng Một Nguồn Tài Nguyên Dược Liệu

Cây diệp hạ châu đắng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, như flavonoid và alkaloid, có tác dụng chống oxy hóa và kháng viêm. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất này có thể hỗ trợ trong việc điều trị các bệnh lý như tiểu đường và ung thư.

II. Vấn Đề Trong Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc nghiên cứu và phát triển hợp chất sinh học từ Bacillus sp. và cây diệp hạ châu đắng vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như sự biến đổi gen của vi khuẩn, khả năng sản xuất hợp chất và tính ổn định của chúng trong môi trường tự nhiên là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.1. Thách Thức Trong Việc Tinh Chế Hợp Chất

Quá trình tinh chế hợp chất từ vi khuẩn Bacillus thường gặp khó khăn do sự đa dạng của các hợp chất được sản xuất. Việc xác định và tách biệt các hợp chất có hoạt tính sinh học cao là một thách thức lớn trong nghiên cứu.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học

Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất từ Bacillus sp. và diệp hạ châu đắng cần phải được thực hiện qua nhiều phương pháp khác nhau. Điều này đòi hỏi sự đầu tư về thời gian và nguồn lực, cũng như sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Để nghiên cứu và tinh chế hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26, nhiều phương pháp hiện đại đã được áp dụng. Các phương pháp này không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất mà còn nâng cao hiệu quả của việc chiết xuất và phân tích các hợp chất.

3.1. Phương Pháp Chiết Xuất Hợp Chất Từ Bacillus

Phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi như methanol và ethanol đã được chứng minh là hiệu quả trong việc thu nhận các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. Các nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa điều kiện chiết xuất có thể tăng cường đáng kể lượng hợp chất thu được.

3.2. Phân Tích Cấu Trúc Hợp Chất Sinh Học

Sử dụng các kỹ thuật phân tích như NMR và GC-MS giúp xác định cấu trúc của các hợp chất sinh học. Những phương pháp này cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc hóa học, từ đó hỗ trợ trong việc đánh giá hoạt tính sinh học của chúng.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. và cây diệp hạ châu đắng có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học và nông nghiệp. Chúng không chỉ giúp điều trị bệnh mà còn có thể được sử dụng như một biện pháp bảo vệ cây trồng khỏi sâu bệnh.

4.1. Ứng Dụng Trong Y Học

Hợp chất từ Bacillus sp. đã được nghiên cứu và chứng minh có khả năng kháng vi khuẩn và kháng nấm. Chúng có thể được phát triển thành các loại thuốc mới, giúp điều trị hiệu quả các bệnh lý khó chữa.

4.2. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp

Việc sử dụng các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. trong nông nghiệp giúp tăng cường sức đề kháng cho cây trồng. Điều này không chỉ giảm thiểu việc sử dụng hóa chất mà còn bảo vệ môi trường.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 và cây diệp hạ châu đắng mở ra nhiều triển vọng trong lĩnh vực dược phẩm và nông nghiệp. Những kết quả đạt được từ nghiên cứu này không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, nghiên cứu về các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. sẽ tiếp tục được mở rộng. Các nghiên cứu sâu hơn sẽ giúp phát hiện ra nhiều hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Cần tiếp tục nghiên cứu về cơ chế hoạt động của các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. và diệp hạ châu đắng. Điều này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và nâng cao hiệu quả điều trị trong y học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên phục vụ cho y dược học ngày càng được chú trọng nhằm đối phó với hiện tượng stress oxy hóa, sự gia tăng của các bệnh nan y như ung thư và tình trạng kháng kháng sinh đáng báo động ở vi sinh vật gây bệnh. Hiện tượng stress oxy hóa sinh ra các gốc tự do là nguyên nhân khởi phát nhiều bệnh lý nguy hiểm như ung thư, tim mạch, suy giảm thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và lão hóa sớm. Mặc dù các chất chống oxy hóa tổng hợp như butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT) hay tertiary butylhydroquinone (TBHQ) được sử dụng phổ biến nhưng chúng tiềm ẩn nguy cơ gây độc tính, tổn thương gan và ung thư. Bên cạnh đó, các biến chứng và cơ chế kháng thuốc trong hóa trị liệu ung thư, cùng sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc như tụ cầu vàng kháng methicillin (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) đặt ra yêu cầu cấp thiết phải tìm kiếm các phân tử hoạt tính sinh học mới từ nguồn tự nhiên an toàn và hiệu quả hơn.

Vi sinh vật nội sinh trong các cây dược liệu là nguồn tài nguyên sinh học phong phú có khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng. Trong đó, chi vi khuẩn Bacillus nổi tiếng với khả năng sinh tổng hợp nhiều loại kháng sinh peptid, lipopeptid và các hợp chất chuyển hóa có hoạt tính dược lý mạnh. Nhằm kế thừa các nghiên cứu trước đây về hệ vi sinh vật nội sinh thực vật, đề tài "Tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết vi khuẩn Bacillus sp. RD26 nội sinh cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)" đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài gồm:

1. Cô lập và tinh chế các hợp chất từ vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 có một số hoạt tính sinh học: kháng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh ở người; chống oxy hóa; gây độc tế bào.
2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinh khiết phân lập được.
3. Thử nghiệm và đánh giá các hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, gây độc tế bào) của hợp chất đã làm sạch.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Nuôi cấy lên men thu nhận sinh khối và điều chế cao chiết thô từ chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26.
2. Phân đoạn cao chiết bằng các phương pháp sắc ký và sàng lọc các phân đoạn có hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định MRSA.
3. Tinh chế hợp chất tinh khiết từ phân đoạn tiềm năng và phân tích phổ để xác định cấu trúc hóa học.
4. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (MRSA, vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương, vi nấm da), hoạt tính bắt gốc tự do DPPH và hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư vú người MCF-7.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 được phân lập từ cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn).
• Chủng vi sinh vật thử nghiệm hoạt tính: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, cùng hai chủng vi nấm da Trichophyton mentagrophytes và Microsporum canis.
• Dòng tế bào khảo sát độc tính: Dòng tế bào ung thư vú người MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7).
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 12/2019 đến tháng 07/2020 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh (Trường Đại học Mở TP.HCM), Phòng Các chất có hoạt tính sinh học (Viện Công nghệ Hóa học TP.HCM), Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Di truyền (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM) và phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và đối tượng vi sinh vật

Theo hệ thống phân loại của Bergey, chi Bacillus thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae. Đây là nhóm vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt và tồn tại phổ biến trong đất, nước cũng như mô thực vật. Nhiều loài thuộc chi Bacillus đã được chứng minh có khả năng tạo ra các hợp chất thứ cấp có giá trị dược lý cao như macrolactin (A, S, V), difficidin, oxidifficidin, bacilysin, surfactin, fengycin, amicoumacins, bacillistatins, mixirins hay loloatin B với phổ hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và ức chế tế bào ung thư. Chủng vi khuẩn Bacillus sp. RD26 sử dụng trong đề tài là chủng nội sinh được phân lập từ cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus), một loài cây dược liệu quen thuộc trong y học cổ truyền.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng quy trình thực nghiệm tích hợp giữa công nghệ vi sinh, hóa hợp chất tự nhiên và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro:

Quy trình thực nghiệm	Phương pháp và điều kiện kỹ thuật	Chỉ tiêu / Thiết bị ghi nhận
Lên men thu nhận sinh khối	Lên men chìm 3 cấp: Hoạt hóa trên NA (37°C/24h), cấp 1 trong 50 mL NB (35°C/36h, 200 rpm), cấp 2 trong 500 mL môi trường tối ưu (35°C/36h, 200 rpm), lên men trong môi trường tối ưu (30°C/36h, pH = 7). Ly tâm lạnh 6000 rpm/30 phút ở 4°C.	Khối lượng sinh khối tươi (g).
Phá vỡ màng tế bào & chiết xuất	Tán siêu âm đầu dò trong 15 phút với hỗn hợp dung môi chloroform : methanol (tỷ lệ thể tích 1:2), ủ lạnh 10 phút, bổ sung 1500 mL nước cất, ly tâm 6000 rpm trong 30 phút ở 8°C.	Phân tách 3 pha theo tỷ trọng, thu hồi pha methanol-nước và cô quay chân không thành cao chiết methanol (BRM).
Sắc ký phân lập	Sắc ký cột cổ điển (CC) pha thường với chất hấp phụ silica gel 60 (kích thước hạt 0,040–0,063 mm, 230–400 mesh). Sắc ký lớp mỏng (TLC) pha thường trên bản nhôm tráng sẵn silica gel 60 $F_{254}$ (Merck).	Hiện vết dưới đèn soi UV (254 nm, 365 nm) và dung dịch thuốc thử $H_2SO_4$ 10%/EtOH hơ nóng.
Xác định cấu trúc hóa học	Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: $^{1}H\text{-NMR}$ (500 MHz) và $^{13}C\text{-NMR}$ (125 MHz) trên thiết bị Bruker Avance, sử dụng dung môi pha mẫu DMSO-$d_6$.	Độ chuyển dịch hóa học ($\delta$, ppm), độ bội (s, d, t, m) và hằng số ghép spin ($J$, Hz).
Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật	Phương pháp khuếch tán đĩa giấy, phương pháp tự sinh đồ trực tiếp (TLC-DB), phương pháp tự sinh đồ phun dịch khuẩn kết hợp chỉ thị muối tetrazolium, phương pháp pha loãng vi lượng trên phiến 96 giếng xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).	Đường kính vòng vô khuẩn (mm), nồng độ MIC ($\mu\text{g/mL}$), đo độ đục ở bước sóng 600 nm trên máy Bio-Rad.
Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa	Phương pháp dọn gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, $6 \times 10^{-4}\text{ M}$) ở dải nồng độ 10–100 $\mu\text{g/mL}$, ủ tối 60 phút ở nhiệt độ phòng. Chất đối chứng dương: Trolox; đối chứng âm: nước cất.	Đo độ hấp thụ quang phổ OD tại bước sóng 517 nm (máy Synergy HT Biotek), tính tỷ lệ % ức chế và giá trị $IC_{50}$.
Khảo sát độc tính tế bào ung thư	Phương pháp thử nghiệm MTT trên dòng tế bào ung thư vú người MCF-7 (ủ 48 giờ), đo sự hình thành tinh thể formazan. Chất đối chứng dương: Camptothecin; đối chứng âm: DMSO 0,25%.	Đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 nm (Synergy HT Biotek), tính tỷ lệ % ức chế tăng trưởng tế bào, xác định $IC_{50}$, chụp ảnh SEM.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết có hệ thống các kiến thức nền tảng và tài liệu khoa học liên quan đến đề tài:

• Trình bày đặc điểm phân loại học của chi Bacillus, hình thái tế bào hình que Gram dương, khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt (kích thước tế bào $0,5 - 1,2 \times 2,5 - 10\ \mu\text{m}$), đặc tính sinh lý sinh hóa và các ứng dụng thực tiễn trong công nghiệp enzyme (amylase, protease, cellulase), sản xuất kháng sinh peptid (surfactin), thuốc trừ sâu vi sinh (Bacillus thuringiensis), chất dẻo sinh học cũng như làm probiotic trong chăn nuôi và y học.
• Khái quát các công trình nghiên cứu dược lý về vi khuẩn nội sinh và thành phần hóa học của chi Bacillus. Tổng hợp danh mục các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học cao phân lập từ các loài Bacillus như Macrolactin A, S, V; Difficidin; Oxidifficidin; Bacilysin; Chlorotetaine; Surfactin; Halobacillins 1-2; Iso-$C_{16}$ fengycin B; Mojavensin A; Marihysin A; Basiliskamide A-B; Tupuseleiamide A-B; Ieodoglucomide A-B; Bacilosarcins A-B; Amicoumacins A-C; Bacillistatins 1-2; Loloatin B; Mixirins A-C; Neobacillamide A; Bacillamides A-C cùng cơ chế kháng khuẩn, kháng nấm và gây độc tế bào ung thư tương ứng.
• Phân tích nguyên lý của các phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột cổ điển (CC); các phương pháp thử hoạt tính sinh học gồm tự sinh đồ (trực tiếp TLC-DB và thạch phủ Agar-Overlay), phương pháp pha loãng xác định MIC, phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy/giếng thạch, phương pháp thử độc tính tế bào MTT dựa trên hoạt tính enzyme dehydrogenase ty thể; cùng các kỹ thuật phân tích cấu trúc hóa học như phổ hồng ngoại (IR), sắc ký khí khối phổ (GC-MS), khối phổ ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D ($^{1}H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT, COSY, NOESY, HSQC, HMBC).

Phần 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết vật liệu, môi trường, trang thiết bị và quy trình thực nghiệm:

• Nguồn gốc sinh phẩm: Chủng Bacillus sp. RD26 từ cây Diệp hạ châu đắng; các chủng vi khuẩn kiểm định gồm MRSA ATCC 43300, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa; các chủng nấm da Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis (từ Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM); dòng tế bào ung thư vú MCF-7.
• Hệ thống hóa chất và môi trường nuôi cấy: Môi trường Nutrient Broth (NB), Nutrient Agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA), Sabouraud Dextrose Agar (SDA); các dung môi hữu cơ tinh khiết (chloroform, ethyl acetate, methanol, ethanol); hóa chất DPPH, MTT, thuốc thử hiện màu $H_2SO_4$ 10%/EtOH; thuốc nhuộm lục malachite 5% và safranin O 0,5% dùng cho kỹ thuật nhuộm bào tử.
• Thiết lập sơ đồ bố trí thí nghiệm toàn diện từ khâu nuôi cấy lên men, phá vỡ tế bào bằng siêu âm, điều chế các phân đoạn sắc ký, sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn MRSA, tinh sạch hợp chất mục tiêu, phân tích cấu trúc phổ và kiểm tra hoạt tính sinh học đa mục tiêu.

Phần 3: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu và biện luận kết quả thực nghiệm đạt được:

• Lên men và thu nhận cao chiết: Áp dụng quy trình lên men 3 cấp từ môi trường tối ưu hóa kế thừa từ nghiên cứu trước, từ chủng Bacillus sp. RD26 đã thu được 105 g sinh khối tươi. Sau khi xử lý phá màng tế bào bằng phương pháp tán siêu âm đầu dò trong hỗn hợp chloroform : methanol (1:2) và bổ sung nước cất, hệ dung dịch tách thành 3 pha rõ rệt dựa trên sự khác biệt về tỷ trọng: pha dưới chứa chloroform ($d = 1,49\text{ g/cm}^3$) hòa tan các hợp chất kém phân cực; pha giữa là lớp sinh khối ngậm nước ($d = 0,99\text{ g/cm}^3$); pha trên cùng là hỗn hợp methanol-nước ($d = 0,79\text{ g/cm}^3$). Thu hồi và cô đuổi dung môi pha trên thu được 15,53 g cao chiết methanol thô (ký hiệu BRM).
• Khảo sát hoạt tính kháng MRSA và sắc ký phân đoạn: Đánh giá hoạt tính kháng MRSA ATCC 43300 của cao tổng BRM và các cao phân đoạn bằng phương pháp đĩa giấy. Tiến hành sắc ký cột cổ điển phân tách cao BRM thu được 6 phân đoạn chính. Trong đó, phân đoạn BRM4 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ nét và tiếp tục được sắc ký cột phân đoạn thành BRM41, sau đó là BRM413 để cô lập hợp chất tinh khiết có hoạt tính, ký hiệu là BR04.
• Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BR04: Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^{1}H\text{-NMR}$ (500 MHz, DMSO-$d_6$) và $^{13}C\text{-NMR}$ (125 MHz, DMSO-$d_6$) của chất BR04 cho thấy các tín hiệu đặc trưng của khung pyrimidine:
  • Tín hiệu proton: Xuất hiện hai mũi đôi ở vùng trường thấp tương ứng với các proton olefin tại $\delta_H\ 5,45\text{ ppm}$ ($1\text{H}, d, J = 7,5\text{ Hz}, \text{H-5}$) và $\delta_H\ 7,39\text{ ppm}$ ($1\text{H}, d, J = 7,5\text{ Hz}, \text{H-6}$), cùng hai mũi đơn giãn rộng của các nhóm NH tại $\delta_H\ 10,81\text{ ppm}$ ($1\text{H}, s, \text{NH-1}$) và $\delta_H\ 11,00\text{ ppm}$ ($1\text{H}, s, \text{NH-3}$).
  • Tín hiệu carbon: Phổ $^{13}C\text{-NMR}$ ghi nhận 4 tín hiệu carbon gồm hai carbon carbonyl tại $\delta_C\ 151,5\text{ ppm}$ (C-2) và $\delta_C\ 164,4\text{ ppm}$ (C-4); hai carbon liên kết đôi tại $\delta_C\ 100,3\text{ ppm}$ (C-5) và $\delta_C\ 142,2\text{ ppm}$ (C-6).
  • Đối chiếu với dữ liệu phổ chuẩn trong tài liệu tham khảo, cấu trúc hóa học của hợp chất BR04 được xác định chính xác là Uracil (pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione).
• Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất BR04 (Uracil):
  • Hoạt tính kháng vi sinh vật: Phương pháp tự sinh đồ trực tiếp (TLC-DB) và tự sinh đồ phun dịch khuẩn xác nhận vết BR04 có khả năng ức chế rõ rệt chủng vi khuẩn MRSA cũng như các vi khuẩn Gram âm, Gram dương và vi nấm thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm pha loãng xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với các chủng vi sinh vật kiểm định.
  • Hoạt tính chống oxy hóa: Hợp chất BR04 thể hiện khả năng bắt gốc tự do DPPH phụ thuộc nồng độ ở dải khảo sát từ 10 đến 100 $\mu\text{g/mL}$, xác định giá trị $IC_{50}$ so sánh với chất đối chứng dương Trolox.
  • Hoạt tính gây độc tế bào: Thử nghiệm MTT trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 sau 48 giờ cho thấy hợp chất BR04 có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư. Hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) ghi nhận sự thay đổi hình thái tế bào MCF-7 bị co cụm và tổn thương cấu trúc màng dưới tác động của hợp chất.

Phần 4: Kết luận và đề nghị

Tổng hợp các kết quả thực nghiệm chính của khóa luận và đề xuất các phương hướng nghiên cứu tiếp nối nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, phân lập và đánh giá sâu hơn về tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26.

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm chính

Hạng mục / Chỉ tiêu thực nghiệm	Kết quả định lượng và thông số kỹ thuật
Khối lượng sinh khối tươi thu nhận	105 g (từ quy trình lên men chìm 3 cấp tối ưu).
Khối lượng cao chiết thô methanol (BRM)	15,53 g (thu hồi từ pha trên của quá trình chiết tách siêu âm đầu dò).
Hợp chất tinh sạch phân lập (BR04)	Xác định là Uracil (pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione).
Dữ liệu phổ $^{1}H\text{-NMR}$ (500 MHz, DMSO-$d_6$)	$\delta_H\ 5,45$ ($d, J = 7,5\text{ Hz}, \text{H-5}$); $7,39$ ($d, J = 7,5\text{ Hz}, \text{H-6}$); $10,81$ ($s, \text{NH-1}$); $11,00$ ($s, \text{NH-3}$).
Dữ liệu phổ $^{13}C\text{-NMR}$ (125 MHz, DMSO-$d_6$)	$\delta_C\ 100,3$ (C-5); $142,2$ (C-6); $151,5$ (C-2); $164,4$ (C-4).
Hoạt tính kháng vi sinh vật	Ức chế vi khuẩn đa kháng MRSA ATCC 43300, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa, vi nấm da T. mentagrophytes, M. canis.
Hoạt tính chống oxy hóa	Bắt gốc tự do DPPH ở dải nồng độ 10–100 $\mu\text{g/mL}$.
Độc tính tế bào ung thư vú MCF-7	Ức chế sự phát triển tế bào ở thời điểm 48 giờ (phương pháp MTT, đối chứng Camptothecin, kiểm chứng qua ảnh SEM).

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Tác giả kiến nghị tiếp tục nghiên cứu tinh chế và định danh các hợp chất hoạt tính còn lại trong các phân đoạn sắc ký khác của cao BRM (như các phân đoạn bên cạnh BRM4).
• Khảo sát mở rộng hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất phân lập được trên các dòng tế bào ung thư người khác (như ung thư gan HepG2, ung thư phổi NCI-H460, ung thư đại tràng HCT-116).
• Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động phân tử và khảo sát độc tính in vivo trên mô hình động vật trước khi tiến tới các thử nghiệm tiền lâm sàng.

Đóng góp khoa học của đề tài

• Chứng minh chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 từ cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) là nguồn nguyên liệu sinh học có khả năng sản sinh các hợp chất có hoạt tính sinh học giá trị.
• Thiết lập hoàn chỉnh quy trình chiết xuất sinh khối bằng phương pháp tán siêu âm đầu dò kết hợp hệ ba pha dung môi (chloroform - methanol - nước), giúp thu hồi hiệu quả các hợp chất phân cực và bán phân cực.
• Cô lập và giải mã thành công cấu trúc hóa học của hợp chất dị vòng pyrimidine (Uracil) từ chủng RD26, đồng thời cung cấp đầy đủ dữ liệu thực nghiệm về phổ kháng vi sinh vật (đặc biệt là khả năng kháng tụ cầu vàng đa kháng MRSA), khả năng chống oxy hóa dọn gốc tự do DPPH và hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú MCF-7.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận được thực hiện với các hạn chế dựa trên phạm vi nghiên cứu thực nghiệm:

• Nghiên cứu chỉ mới tập trung phân lập và giải cấu trúc hoàn chỉnh của một hợp chất chính (BR04 - Uracil) từ phân đoạn BRM4; các phân đoạn còn lại chưa được phân lập triệt để do giới hạn về thời gian và khối lượng mẫu.
• Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng lại ở mức độ sàng lọc in vitro trên các chủng vi sinh vật tiêu chuẩn và một dòng tế bào ung thư vú MCF-7 duy nhất; chưa thực hiện khảo sát cơ chế tác động ở mức độ biểu hiện gen hay thử nghiệm trên mô hình sinh vật in vivo.
• Đề tài mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo về việc tối ưu hóa điều kiện lên men quy mô lớn, khai thác sâu các thành phần lipopeptid hoặc các phân tử hoạt tính khác trong cao chiết vi khuẩn nội sinh và nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên động vật thực nghiệm.

Giá trị tham khảo

Công trình là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Giảng viên, sinh viên và học viên cao học thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ sinh học Y – Dược, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Vi sinh vật học ứng dụng.
• Cung cấp tài liệu thực hành chi tiết về phương pháp phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng tán siêu âm đầu dò, phương pháp tách hệ ba pha dung môi dựa trên tỷ trọng, kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng pha thường.
• Cung cấp tài liệu tham khảo giá trị về kỹ thuật tự sinh đồ trực tiếp (TLC-DB) và tự sinh đồ phun dịch khuẩn kết hợp muối tetrazolium trong việc định hướng nhanh phân đoạn hoạt tính kháng khuẩn.
• Là nguồn tư liệu chuẩn xác về quy trình giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D ($^{1}H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$) để định danh các hợp chất nhân dị vòng pyrimidine.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn gốc của chủng vi khuẩn Bacillus sp. RD26 và mục tiêu nghiên cứu của đề tài là gì? Chủng vi khuẩn Bacillus sp. RD26 là chủng vi sinh vật nội sinh được phân lập từ mô cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn). Đề tài hướng tới việc lên men thu nhận sinh khối, chiết tách, cô lập hợp chất tinh khiết có hoạt tính sinh học, xác định cấu trúc hóa học và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh (đặc biệt là chủng vi khuẩn đa kháng MRSA), hoạt tính chống oxy hóa dọn gốc tự do DPPH và hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư vú MCF-7.

2. Quy trình chiết xuất và phá màng tế bào vi khuẩn RD26 được thực hiện như thế nào và thu được bao nhiêu cao chiết? Từ 105 g sinh khối tươi vi khuẩn Bacillus sp. RD26 thu được sau lên men chìm, tác giả sử dụng phương pháp tán siêu âm đầu dò trong 15 phút với hỗn hợp dung môi chloroform : methanol (tỷ lệ 1:2), ủ lạnh 10 phút, sau đó bổ sung 1500 mL nước cất và ly tâm 6000 rpm trong 30 phút ở 8°C. Dung dịch phân tách thành 3 lớp rõ rệt: lớp đáy là chloroform hòa tan chất kém phân cực ($d = 1,49\text{ g/cm}^3$), lớp giữa là sinh khối ($d = 0,99\text{ g/cm}^3$) và lớp trên cùng là methanol-nước ($d = 0,79\text{ g/cm}^3$). Cô thu hồi dung môi pha trên thu được 15,53 g cao chiết methanol thô (BRM).

3. Hợp chất tinh khiết BR04 được phân lập từ phân đoạn nào và có cấu trúc hóa học là gì? Hợp chất BR04 được phân lập và tinh sạch qua nhiều lần sắc ký cột cổ điển từ phân đoạn có hoạt tính kháng MRSA mạnh là BRM4 (qua các phân đoạn trung gian BRM41 và BRM413). Dựa trên phân tích dữ liệu phổ $^{1}H\text{-NMR}$ (500 MHz, DMSO-$d_6$) và $^{13}C\text{-NMR}$ (125 MHz, DMSO-$d_6$), hợp chất BR04 được xác định là Uracil (tên IUPAC: pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione).

4. Dữ liệu phổ NMR chính nào chứng minh hợp chất BR04 là Uracil? Phổ $^{1}H\text{-NMR}$ của BR04 trong DMSO-$d_6$ thể hiện hai tín hiệu proton olefin ở $\delta_H\ 5,45\text{ ppm}$ ($d, J = 7,5\text{ Hz}, \text{H-5}$) và $\delta_H\ 7,39\text{ ppm}$ ($d, J = 7,5\text{ Hz}, \text{H-6}$), cùng hai proton nhóm amin tại $\delta_H\ 10,81\text{ ppm}$ ($s, \text{NH-1}$) và $\delta_H\ 11,00\text{ ppm}$ ($s, \text{NH-3}$). Phổ $^{13}C\text{-NMR}$ ghi nhận đủ 4 tín hiệu carbon của khung pyrimidine gồm hai carbon carbonyl tại $\delta_C\ 151,5\text{ ppm}$ (C-2) và $164,4\text{ ppm}$ (C-4), cùng hai carbon liên kết đôi tại $\delta_C\ 100,3\text{ ppm}$ (C-5) và $142,2\text{ ppm}$ (C-6).

5. Hoạt tính sinh học của hợp chất BR04 được đánh giá qua những thử nghiệm thực nghiệm nào? Hợp chất BR04 được đánh giá qua: (1) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp tự sinh đồ trực tiếp, tự sinh đồ phun dịch khuẩn và xác định giá trị MIC trên vi khuẩn Gram âm (E. coli, P. aeruginosa), Gram dương (B. cereus, MRSA ATCC 43300) và vi nấm da (T. mentagrophytes, M. canis); (2) Hoạt tính chống oxy hóa bắt gốc tự do DPPH ở các nồng độ từ 10 đến 100 $\mu\text{g/mL}$ so với đối chứng dương Trolox; (3) Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú người MCF-7 ở thời điểm 48 giờ bằng phương pháp MTT so với đối chứng dương Camptothecin và kiểm chứng biến đổi vi thể bằng ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét SEM.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Quốc Khang đã thực hiện thành công quy trình lên men, chiết xuất và phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. RD26 nội sinh cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus). Công trình đã tinh chế và xác định chính xác cấu trúc hóa học của hợp chất BR04 là Uracil (pyrimidine-2,4-dione) thông qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^{1}H\text{-NMR}$ và $^{13}C\text{-NMR}$. Đồng thời, nghiên cứu đã cung cấp các bằng chứng thực nghiệm rõ ràng về khả năng kháng khuẩn (đặc biệt là ức chế vi khuẩn đa kháng MRSA ATCC 43300), kháng vi nấm da, chống oxy hóa dọn gốc tự do DPPH và gây độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hợp chất phân lập được. Kết quả này khẳng định tiềm năng ứng dụng to lớn của hệ vi sinh vật nội sinh cây dược liệu trong nghiên cứu và phát triển các sản phẩm y dược học tự nhiên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Trong những năm gần đây, các hợp chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng nhiều trong dược phẩm và bệnh lý tự nhiên, do lợi ích sức khỏe của chúng đối với con người và thực vật như chống ung thư, tim mạch, chống lipid máu, hạ huyết áp, chống đường huyết, chống huyết khối, chống xơ vữa và chống tiểu đường (Puri và cs., 2005; Chang và cs., 2013; Atanasov và cs., 2015; Villaescusa và cs. Hiện nay, stress oxy hóa vẫn đang là mối quan tâm hàng đầu với các nhà khoa học.

Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa hoạt động của các chất kháng oxy hóa và việc sản xuất các gốc tự do. Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm trong đó có ung thư các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và lão hóa sớm (Lại Thị Ngọc Hà và cs. Trong đó các hợp chất chống oxy hóa tổng hợp như hydroxyanisole butylated (BHA), hydroxytoluene butylated (BHT) và tertiary hydroquinone (TBHQ) thường được sử dụng làm chất bảo quản bởi các công ty dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm. Tuy nhiên các hợp chất này gây tổn thương gan, gây ung thư (Whysner và cs., 1994) và gây độc (Moure và cs., 2001) cho con người.

Do đó, ngày càng có nhiều nhu cầu thay thế các chất chống oxy hóa tổng hợp bằng các hợp chất tự nhiên, an toàn hơn. Mặt khác, các trường hợp mắc bệnh ung thư mỗi năm diễn ra ngày càng cao là nguyên nhân chính dẫn đến tử vong, do đó chúng đặt ra vấn đề lớn trên toàn thế giới về sức khỏe cộng đồng. Các hợp chất chống ung thư hiệu quả không được biết đến nhiều. Tuy nhiên, các hợp chất dựa trên thực vật là các hợp chất chữa bệnh tốt hơn các hợp chất được tổng hợp.

Đặc biệt, vi sinh vật nội sinh ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm cung cấp các loại thuốc có hiệu quả cao, và cũng giúp bảo tồn đa dạng sinh học (Swarnalatha và cs. Hơn nữa, những biến chứng vốn có của hóa trị liệu trong điều trị ung thư, bao gồm cơ chế kháng thuốc của các tế bào gây ra bởi hóa trị đã khiến các nhà khoa học tập trung vào việc kiểm tra tiềm năng của việc sử dụng vi khuẩn và các hợp chất của chúng để điều trị chống ung thư. Bởi vì vi khuẩn là chất gây ung thư và chất kích thích khối u, tạo ra độc tố phá vỡ tín hiệu tế bào do đó gây nhiễu sự điều hòa sự phát triển của tế bào, thúc đẩy khối u tiềm năng SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG Trang 9 ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT thông qua việc gây viêm. Ngoài ra, các enzyme do vi khuẩn sản xuất là các chất gây ung thư tiềm năng, chẳng hạn như enzyme peptidylarginine deaminase (PAD) được tìm thấy trong vi khuẩn miệng và liên quan đến ung thư tuyến tụy. Do đó, vi khuẩn đã cho thấy tiềm năng lớn trong điều trị ung thư (Song và cs. Vi sinh vật có thể tự tổng hợp các hợp chất tự nhiên hay một số enzyme hoặc cộng sinh với thực vật.

Các vi khuẩn cư trú bên trong các mô thực vật, được gọi là vi khuẩn nội sinh, cũng tạo ra một loạt các hợp chất này. Theo nghiên cứu của Arasu và cộng sự (2013) vi khuẩn thuộc chi Streptomyces và Bacillus có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn (Arasu và cs. Các chất chuyển hóa kháng khuẩn được tạo ra giữa các vi khuẩn thuộc chi Streptomyces và Bacillus (Arasu và cs.