Tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết vi khuẩn bacillus sp rd26 nội sinh cây diệp hạ châu đắng phyllanthus amarus

Chuyên khảo phân tích Tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết vi khuẩn bacillus sp rd26 nội sinh cây diệp hạ, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Nguyễn Quốc Khang
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tinh Chế Hợp Chất Sinh Học Từ Vi Khuẩn Bacillus Sp. RD26 Và Cây Diệp Hạ Châu Đắng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. VI KHUẨN BACILLUS
• 1.2. Phân loại khoa học
• 1.3. Ứng dụng của Bacillus
• 1.4. NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC LÝ
• 1.5. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
• 1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
• 1.6.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
• 1.6.2. Phương pháp sắc ký cột cổ điển (CC)
• 1.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 1.7.1. Phương pháp tự sinh đồ
• 1.7.2. Phương pháp pha loãng
• 1.7.3. Phương pháp khuếch tán
• 1.7.4. Các phương pháp thử độc tính tế bào
• 1.8. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT
• 1.8.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
• 1.8.2. Phương pháp phân tích sắc ký khí – khối phổ (GC-MS)
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 2.2. Chủng vi sinh vật nghiên cứu
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
• 2.4.2. Phương pháp nhuộm bào tử
• 2.4.3. Phương pháp phân lập hợp chất
• 2.4.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất
• 2.4.5. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CHẤT TINH
• 3.2. Phương pháp lên men thu nhận sinh khối
• 3.3. Phương pháp thu cao chiết methanol
• 3.4. Điều chế các phân đoạn từ cao methanol
• 3.5. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN MRSA CỦA CAO TỔNG VÀ CAO PHÂN ĐOẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐĨA GIẤY
• 3.5.1. Khảo sát khả năng kháng MRSA của cao tổng
• 3.5.2. Khảo sát khả năng kháng MRSA của các cao phân đoạn
• 3.6. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HỢP CHẤT
• 3.6.1. Xác định cấu trúc hợp chất BR04
• 3.6.2. Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất BR04
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ vi khuẩn Bacillus sp. RD26 và cây diệp hạ châu đắng đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực dược phẩm. Bacillus sp. là một trong những nguồn tài nguyên phong phú cho việc phát triển các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) cũng được biết đến với nhiều tác dụng dược lý. Việc kết hợp giữa hai nguồn tài nguyên này hứa hẹn sẽ mang lại những kết quả nghiên cứu đầy tiềm năng.

1.1. Tìm Hiểu Về Bacillus Sp. Và Tác Dụng Của Chúng

Vi khuẩn Bacillus có khả năng sản xuất nhiều hợp chất sinh học có giá trị. Chúng được biết đến với khả năng kháng khuẩn và kháng nấm, giúp bảo vệ cây trồng và con người khỏi các bệnh lý. Nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất này có thể được sử dụng trong điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm cả ung thư.

1.2. Cây Diệp Hạ Châu Đắng Một Nguồn Tài Nguyên Dược Liệu

Cây diệp hạ châu đắng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, như flavonoid và alkaloid, có tác dụng chống oxy hóa và kháng viêm. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất này có thể hỗ trợ trong việc điều trị các bệnh lý như tiểu đường và ung thư.

II. Vấn Đề Trong Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc nghiên cứu và phát triển hợp chất sinh học từ Bacillus sp. và cây diệp hạ châu đắng vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như sự biến đổi gen của vi khuẩn, khả năng sản xuất hợp chất và tính ổn định của chúng trong môi trường tự nhiên là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.1. Thách Thức Trong Việc Tinh Chế Hợp Chất

Quá trình tinh chế hợp chất từ vi khuẩn Bacillus thường gặp khó khăn do sự đa dạng của các hợp chất được sản xuất. Việc xác định và tách biệt các hợp chất có hoạt tính sinh học cao là một thách thức lớn trong nghiên cứu.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học

Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất từ Bacillus sp. và diệp hạ châu đắng cần phải được thực hiện qua nhiều phương pháp khác nhau. Điều này đòi hỏi sự đầu tư về thời gian và nguồn lực, cũng như sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Để nghiên cứu và tinh chế hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26, nhiều phương pháp hiện đại đã được áp dụng. Các phương pháp này không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất mà còn nâng cao hiệu quả của việc chiết xuất và phân tích các hợp chất.

3.1. Phương Pháp Chiết Xuất Hợp Chất Từ Bacillus

Phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi như methanol và ethanol đã được chứng minh là hiệu quả trong việc thu nhận các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. Các nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa điều kiện chiết xuất có thể tăng cường đáng kể lượng hợp chất thu được.

3.2. Phân Tích Cấu Trúc Hợp Chất Sinh Học

Sử dụng các kỹ thuật phân tích như NMR và GC-MS giúp xác định cấu trúc của các hợp chất sinh học. Những phương pháp này cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc hóa học, từ đó hỗ trợ trong việc đánh giá hoạt tính sinh học của chúng.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. và cây diệp hạ châu đắng có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học và nông nghiệp. Chúng không chỉ giúp điều trị bệnh mà còn có thể được sử dụng như một biện pháp bảo vệ cây trồng khỏi sâu bệnh.

4.1. Ứng Dụng Trong Y Học

Hợp chất từ Bacillus sp. đã được nghiên cứu và chứng minh có khả năng kháng vi khuẩn và kháng nấm. Chúng có thể được phát triển thành các loại thuốc mới, giúp điều trị hiệu quả các bệnh lý khó chữa.

4.2. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp

Việc sử dụng các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. trong nông nghiệp giúp tăng cường sức đề kháng cho cây trồng. Điều này không chỉ giảm thiểu việc sử dụng hóa chất mà còn bảo vệ môi trường.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus Sp

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 và cây diệp hạ châu đắng mở ra nhiều triển vọng trong lĩnh vực dược phẩm và nông nghiệp. Những kết quả đạt được từ nghiên cứu này không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, nghiên cứu về các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. sẽ tiếp tục được mở rộng. Các nghiên cứu sâu hơn sẽ giúp phát hiện ra nhiều hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Cần tiếp tục nghiên cứu về cơ chế hoạt động của các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. và diệp hạ châu đắng. Điều này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và nâng cao hiệu quả điều trị trong y học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Trong những năm gần đây, các hợp chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng nhiều trong dược phẩm và bệnh lý tự nhiên, do lợi ích sức khỏe của chúng đối với con người và thực vật như chống ung thư, tim mạch, chống lipid máu, hạ huyết áp, chống đường huyết, chống huyết khối, chống xơ vữa và chống tiểu đường (Puri và cs., 2005; Chang và cs., 2013; Atanasov và cs., 2015; Villaescusa và cs. Hiện nay, stress oxy hóa vẫn đang là mối quan tâm hàng đầu với các nhà khoa học.

Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa hoạt động của các chất kháng oxy hóa và việc sản xuất các gốc tự do. Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm trong đó có ung thư các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và lão hóa sớm (Lại Thị Ngọc Hà và cs. Trong đó các hợp chất chống oxy hóa tổng hợp như hydroxyanisole butylated (BHA), hydroxytoluene butylated (BHT) và tertiary hydroquinone (TBHQ) thường được sử dụng làm chất bảo quản bởi các công ty dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm. Tuy nhiên các hợp chất này gây tổn thương gan, gây ung thư (Whysner và cs., 1994) và gây độc (Moure và cs., 2001) cho con người.

Do đó, ngày càng có nhiều nhu cầu thay thế các chất chống oxy hóa tổng hợp bằng các hợp chất tự nhiên, an toàn hơn. Mặt khác, các trường hợp mắc bệnh ung thư mỗi năm diễn ra ngày càng cao là nguyên nhân chính dẫn đến tử vong, do đó chúng đặt ra vấn đề lớn trên toàn thế giới về sức khỏe cộng đồng. Các hợp chất chống ung thư hiệu quả không được biết đến nhiều. Tuy nhiên, các hợp chất dựa trên thực vật là các hợp chất chữa bệnh tốt hơn các hợp chất được tổng hợp.

Đặc biệt, vi sinh vật nội sinh ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm cung cấp các loại thuốc có hiệu quả cao, và cũng giúp bảo tồn đa dạng sinh học (Swarnalatha và cs. Hơn nữa, những biến chứng vốn có của hóa trị liệu trong điều trị ung thư, bao gồm cơ chế kháng thuốc của các tế bào gây ra bởi hóa trị đã khiến các nhà khoa học tập trung vào việc kiểm tra tiềm năng của việc sử dụng vi khuẩn và các hợp chất của chúng để điều trị chống ung thư. Bởi vì vi khuẩn là chất gây ung thư và chất kích thích khối u, tạo ra độc tố phá vỡ tín hiệu tế bào do đó gây nhiễu sự điều hòa sự phát triển của tế bào, thúc đẩy khối u tiềm năng SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG Trang 9 ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT thông qua việc gây viêm. Ngoài ra, các enzyme do vi khuẩn sản xuất là các chất gây ung thư tiềm năng, chẳng hạn như enzyme peptidylarginine deaminase (PAD) được tìm thấy trong vi khuẩn miệng và liên quan đến ung thư tuyến tụy. Do đó, vi khuẩn đã cho thấy tiềm năng lớn trong điều trị ung thư (Song và cs. Vi sinh vật có thể tự tổng hợp các hợp chất tự nhiên hay một số enzyme hoặc cộng sinh với thực vật.

Các vi khuẩn cư trú bên trong các mô thực vật, được gọi là vi khuẩn nội sinh, cũng tạo ra một loạt các hợp chất này. Theo nghiên cứu của Arasu và cộng sự (2013) vi khuẩn thuộc chi Streptomyces và Bacillus có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn (Arasu và cs. Các chất chuyển hóa kháng khuẩn được tạo ra giữa các vi khuẩn thuộc chi Streptomyces và Bacillus (Arasu và cs. Đặc biệt, các chủng Bacillus có mặt khắp nơi trong môi trường, chúng đã được phân lập trên toàn thế giới từ đất, đại dương và thực vật,.

Bacillus là nguồn hợp chất hoạt tính sinh học tốt, đáng chú ý là kháng sinh, protein, thuốc ức chế enzyme và các hoạt chất dược lý (Huang và cs. Chúng tạo ra một số lượng lớn các chất chuyển hóa kháng khuẩn và peptide sinh học với các cấu trúc hóa học và sự đa dạng khác nhau. Mặc dù hầu hết các chất này hoạt động chống lại vi khuẩn gram dương, một số có hoạt tính sinh học rộng đối với vi khuẩn gram âm và nấm sợi (Sirtori và cs. Trong số các hợp chất chống nấm, lipopeptide được xác định có vai trò chính trong việc ức chế (Romero và cs.

Các loại lipopeptide khác nhau được tạo ra bởi một số chủng B. Đặc biệt, một số lipopeptide như surfactin, iturin và fengycin đã được thu nhận từ các loài Bacillus và được xem đặc trưng (Arebola và cs., 2010; Kim và cs. Hiện nay con người có xu hướng chữa bệnh bằng cách sử dụng các bài thuốc từ tự nhiên hơn là thuốc có nguồn gốc từ hóa học. Chúng có trong tự nhiên, dễ kiếm lại ít có những tác dụng phụ cho con người.

Với những công dụng và tiềm năng đã được đề cập ở trên, các cây dược liệu và đặc biệt là hệ vi sinh vật nội sinh cây dược liệu nên được tập trung nghiên cứu nhằm đưa ra nhiều loại kháng sinh hơn, thân thiện hơn cho các vấn đề sức khoẻ của con người, động vật và có tiềm năng đối phó với các vi khuẩn kháng kháng sinh như MRSA là một trong các vấn đề rất cần được SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG Trang 10 ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. NGUYỄN TẤN PHÁT nghiên cứu. Chính vì sự cần thiết và ý nghĩa thực tiễn đã nêu ở trên, thừa kế từ công trình nghiên cứu trước chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT VI KHUẨN Bacillus sp.

RD26 NỘI SINH CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus)”. SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG Trang 11 ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Mục tiêu: Cô lập và tinh chế các hợp chất từ vi khuẩn nội sinh Bacillus sp.

RD26 có một số hoạt tính sinh học: + Kháng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh ở người. + Chống oxy hóa + Gây độc tế bào Nội dung thực hiện: - Cô lập và tinh chế hợp chất từ phân đoạn có khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm gây bệnh. - Xác định cấu trúc hợp chất. - Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, gây độc tế bào của hợp chất phân lập.

SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG Trang 12 ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. NGUYỄN TẤN PHÁT PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT 1. VI KHUẨN BACILLUS 1. Phân loại khoa học Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Hình 1. Vi khuẩn Bacillus Chi Bacillus bao gồm 51 loài đã được xác định chính xác và nhiều loài khác nhau được phân loài rõ ràng, Bacillus có mặt rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt trong đất, không khí, nước, trên cơ thể thực vật và động vật.

Hầu hết là các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí, tạo nội bào tử, các tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính nhau thành chuỗi ngắn (Fritze, 2000). mycoides, hầu hết các loài Bacillus đều di động, mặc dù có sự khác biệt rất lớn về khả năng di động trong mỗi loài, roi điển hình nằm hai bên. Hình thành nội bào tử chịu nhiệt, hầu hết cho catalase dương tính. Tế bào hình que thẳng hoặc gần thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước 0,5 - 1,2 x 2,5 - 10 𝜇m.

Sự tạo thành nội bào tử sau đó được chấp nhận như là một đặc tính căn bản để phân loại và xác định các loài của chi Bacillus (Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008). Phần lớn các loài Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt, có khả năng hô hấp trong khi sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino acid, acid hữu cơ). Trong một số trường hợp, chúng còn có thể lên men carbohydrate trong một phản ứng hỗn hợp tạo ra glycerol và butanediol. Phần lớn chúng là ưa nhiệt trung bình, khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25 - 75ºC, nhiệt độ tối ưu là 30 - 45oC, khoảng pH rộng 2 - 11, nồng độ muối từ dưới 2 - 25%.

SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG Trang 14 ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Trong môi trường nuôi cấy lỏng chúng tạo ván trên bề mặt. Trên môi trường thạch tạo khuẩn lạc to, tròn hay hình dạng bất thường, có màu xám ngả vàng nhạt, bề mặt khóm sần sùi, hơi nhăn hoặc tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch (Gibson và cs.

Ứng dụng của Bacillus Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có khả năng sinh các loại enzym như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextrin glucanotransferase, chitinase, glucanase, lipase, serine, protease,… Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid,… Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có tính kháng khuẩn, vừa có tính kháng virus (Toure và cs., 2004; Hong và cs. Một số chủng Bacillus như Bacillus laterosporus, Bacillus firmus và Bacillus cereus hiện nay đang được nghiên cứu trong sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxybutyrate). Bacillus pasteurii được đưa vào đất ướt đã tạo ra calcite - một chất xi măng liên kết đất, chuyển hóa đất thành đá làm vững nền móng các tòa nhà và giúp chúng chịu được động đất. Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được dùng làm thuốc trừ sâu vi sinh.

Bacillus thuringiensis sp. làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt lăng quăng. Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzym ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Shigella, Vibrio spp.,… nên Bacillus spp. được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai mũi họng ở người (Berkeley và cs.

Bacillus còn dùng làm vật chủ biểu hiện gen để sản xuất các loại enzym, acid amin, vitamin và polysaccharide. Các chủng Bacillus brevis có khả năng tiết nhiều protein nhưng không tiết protease vào môi trường nuôi cấy nên được sử dụng làm hệ thống vector chủ biểu hiện các protein tái tổ hợp của người, động vật hữu nhũ và các sinh vật khác như nhân tố tăng trưởng biểu mô, insulin, interleukin 1-β của bò, kháng SVTH: NGUYỄN QUỐC KHANG Trang 15 ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. NGUYỄN TẤN PHÁT nguyên virus viêm gan B, CGTase (Hong và cs., 2005; Nguyễn Đức Quỳnh Như và cs., 2009; Nguyễn Văn Thanh và cs.