Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về levan 1. Giới thiệu về levan Levan là thuộc một trong hai loại fructans (là các cacbohydrate thường tìm thấy trong thực vật, tảo, vi khuẩn). Fructans gồm có hai loại chính là levan và inulins được phân biệt bởi các loại liên kết.
Các đơn phân trong phân tử levan liên kết với nhau bằng liên kết ß (2 - 6) còn trong phân tử inulins là liên kết ß (2 - 1) (Han và cs, 1990). Theo phân loại levan thuộc nhóm thứ hai của fructans. Levan là polymer của fructose được tạo ra bởi liên kết β - (2 - 6) fructo - furanosidic (Ki- Hyo và cs, 2001; Mardo và cs, 2014). Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp levan gồm: Lactobacillus gasseri, B.
amylovora, Seraria sp., Acetobacter xylinum NCI 1005, Z. Levan là polysaccharide ngoại bào được tổng hợp từ vi khuẩn trên môi trường có thành phần chính là sucrose. Do các vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp levansucrose để chuyển hóa sucrose thành levan (Mardo và cs, 2014). Năm 2012, một nghiên cứu được thực hiện bởi Esawy và cs cho thấy vi khuẩn Bacillus spp được tách chiết từ mật ong có khả năng sinh tổng hợp levan.
Mặc dù cấu trúc của levan được đặc trưng bởi một mạch thẳng của liên kết ß (2 - 6) nhưng có nhiều levan được tổng hợp từ vi khuẩn có cấu trúc phân nhánh với liên kết ß (2 - 1). Các mạch nhánh thường ngắn và đôi khi chỉ có môt đơn phân fructose. Fructans ngắn nhất là 6 - ketose và đây cũng chính là fructan ngắn nhất trong các loại levan. Levan là một trong số ít các polyme tự nhiên của carbohydrate tồn tại dưới dạng furanose.
Cấu trúc hóa học của levan 4 Levan được sản xuất từ các sinh vật khác nhau sẽ có sự khác biệt về trong lượng phân tử và mức độ phân nhánh. Levan được tổng hợp từ vi khuẩn có khối lượng phân tử lớn hơn levan thu được từ thực vật khoảng 2 - 100 kDa (Pontis và Campillo, 1985; Keith và cs, 1991). Levan được sản xuất từ thực vật có trong lượng phân tử khoảng 2 - 33 kDa (Rhee và cs, 2002). Levan được sản xuất từ quá trình lên men bởi vi khuẩn Zymomonas mobilis có khối lượng phân tử khoảng 107 Da, tương ứng với 60000 đơn phân của fructose (Viikari và cs, 1986).
Bên cạnh đó, levan được sản xuất từ vi khuẩn B. subtilis Natto có hai loại trọng lượng phân tử khác nhau, levan có khối lượng phân tử cao 1794 kDa và levan có khối lượng phân tử thấp 11 kDa. Levan có trọng lượng phân tử khác nhau sẽ cần thiết cho từng mục đích cụ thể (Shin và cs, 2005). subtilis có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả với 40 g/l trên môi trường có chứa 200 g/l sucrose (Shih và cs 2005).
Trong nghiên cứu của Jothi và cs (2019) cho thấy levan được tổng hợp bởi B. subtilis MTCC 441 sử dụng sucrose làm nguồn carbon. Chiết xuất nấm men (YE) là nguồn nitơ tốt nhất. Nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, nồng độ YE 2 g/l, tốc độ lắc 150 vòng/phút là giá trị tối ưu cho sản xuất levan.
Kết quả cho thấy năng suất levan thu được tương ứng là 0,395 g/g sucrose. Các nghiên cứu chỉ ra levan có khả năng chống ung thư (Calazans cs, 2000; Yoo và cs, 2004). Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis và Zymomonas mobilis có khả năng chống lại tám dòng khác nhau của tế bào ung thư (El-Safty và cs, 2012). Nhiều nghiên cứu về levan đã được thúc đẩy bởi vai trò của chúng trong điều trị sâu răng (Aridson và cs, 2006) và làm giảm cholesterol (Yamamoto và cs, 1999), điều hòa các hoạt động miễn dịch trong cơ thể (Calazans và cs, 1997; Yamamoto và cs, 1999).
Levan có thể được sử dụng để sản xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 - dianhydride) với độ ngọt bằng một nửa độ ngọt của sucrose và có tính ổn định. Vì vậy, levan được ứng dụng như một chất làm ngọt trong các sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho và cs, 5 2001). Trong vài thập kỷ qua, một số nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn để tăng cường khả năng tổng hợp levan đã được thực hiện. Oliveira và cs (2007) tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy Zymomonas mobilis bằng phương pháp đáp ứng bề mặt với 2 nhân tố thay đổi, thu được hàm lượng levan cao nhất 21,68 g/l.
Santos và cs (2013), cũng tối ưu điều kiện nuôi cấy B.subtilis Natto bằng phương pháp này cho hàm lượng levan đạt 111,6 g/l với nồng độ sucrose (400 g/l) và thời gian nuôi 16 giờ. Hiện nay, levan đang được rất nhiều nhà khoa học và sản xuất quan tâm bởi các đặc tính vượt trội như: khả năng hòa tan tốt trong dầu và nước, độ kết dính mạnh, khả năng tương thích sinh học tốt, chống ung thư và khả năng tạo màng (Santos và cs, 2013). Vì vậy, levan được ứng dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm (Jaecho và cs, 2001; Santos và cs, 2013). Levan được sử dụng trong chăm sóc cá nhân, y tế, công nghệ nanno (Gupta và cs, 2010), nuôi trồng thủy sản và các ứng dụng thực phẩm (Oner và cs, 2016).
Natural Polymers Inc. (Hoa Kỳ); Real Biotech Co., (Hàn Quốc) và Advance Co., (Nhật Bản) là những nhà sản xuất chính của levan ở quy mô thương mại. Hai ví dụ phổ biến của các sản phẩm thương mại dựa trên levan có sẵn trên thị trường là Proteolea® và Slimexir® (Oner và cs, 2016). Sản phẩm dưỡng da mặt Hình 1.
Sản phẩm dưỡng thể với Proteolea® với Slimexir® Bên cạnh đó, một số các sản phẩm thực phẩm chức năng đã được bày bán tại các hệ thống siêu thị tại Hàn Quốc, Nhật Bản của công ty RealBiotech (www. Các sản phẩm levan trên thị trường (www. Tính chất Levan là một loại bột tinh thể màu trắng có tính chất như một chất kết dính mạnh mẽ. Các hạt có dạng hình cầu đường kính 75 - 200 nm.
Các thành phần và tính chất của levan phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp levan (Khadiga và cs, 2015). Không giống như polysaccharides được sử dụng như chất nhũ hóa và chất làm đặc, levan không trương lên trong nước và độ nhớt thấp 0,38 dl/gm ở 250C (In Young Bae và cs, 2007). Levan rất dễ tan trong nước nóng và gần như không hòa tan (< 0,5%) trong nước ở nhiệt độ phòng. Khả năng hòa tan trong nước nóng của levan cao hơn inulin được đặc trưng bởi liên kết ß (2 - 6) so với liên kết ß (2 - 1) và cấu trúc mạch nhánh có thể chỉ là một yếu tố hỗ trợ (Justin và cs, 2007).
Levan là một homopolymer của fructose không hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ như (Ashton và cs, 2012): - Methanol, ethanol, isopropanol, n - propanol; - Acetone, methylethylketone, toluene; - Ethyl lactate; - N, N - dimethyloctanamide, N, N - dimethyl - decanamide; 7 - Methyl caprylate/caprate, methylpalmitate/ oleate; - D - limonene; - Propylene carbonate, methoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol; - Dimethyl formamid; - Ethoxyethyl acetate, anhydride acetic; - Furfuryl alcohol; - Dầu hỏa, xăng. Levan không bị phân cắt và thủy phân bởi enzyme invertase và amylase, nhưng rất dễ bị thủy phân bởi acid tạo thành fructose. Levan bị thủy phân hoàn toàn thành các đơn phân fructose trong HCl 1N ở 700C (Kang và Cottrell, 1979). Levan cũng được thủy phân bởi axit oxalic 0,5% (Shin và cs, 2005).
Theo Szwengiel và cs (2004) sản phẩm của quá trình thủy phân levan bởi axit yếu là các fructo - oligosaccharides (FOS) ngắn và các đơn phân fructose. Độ kết dính của levan rất mạnh. So với các polymer tự nhiên, levan có độ kết dính mạnh hơn rất nhiều, được thể hiện qua bảng 1. Độ kết dính của một số polymer tự nhiên Polymer tự nhiên Độ kết dính (psi) Levan 991 Carboxymethylcellulose 193 Inulin 124 Guargum 63 Xanthan gum 33 Levan có một số đặc tính sinh học như: ức chế khối u, kích thích và tăng tính thấm tế bào (Leibovici và Stark, 1984).
Hơn nữa, levan còn có khả năng tương thích sinh học tốt và khả năng tạo màng. Vì vậy, levan được ứng dụng nhiều trong y học (Shin và cs, 2005). Nguồn thu nhận levan Levan là một cacbohydrate có thể được sản xuất bởi cả thực vật, nấm men, nấm và vi khuẩn (Jang và cs, 2002). Levan được tìm thấy trong một số loại cỏ như: 8 Dactylis glomerata, Poa secunda và Agropyron cristatum.
Levan cũng được chứa trong lúa mì và lúa mạch (Hordeum vulgare), nấm (Aspergillus sydawi và A. Levan được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật như: Zymomonas mobilis (Muro và cs, 2000), Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp (Oseguera và cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim và cs, 2000), Pseudomonas syringae (Hettwer và cs, 1995) và Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima và cs, 1998). Levan được sản xuất từ các sinh vật khác nhau sẽ có sự khác biệt về trọng lượng phân tử và mức độ phân nhánh. Levan được sản xuất từ vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có thành phần chính là sucrose.
Dựa trên chất nền bằng phản ứng chuyển gốc fructose của sucrose trong levan β - 2, 6 - fructan bởi enzyme D - glucose - fructosyl transferare bởi một số vi sinh vật. Nhưng nguồn vi sinh vật để sản xuất levan ở quy mô công nghiệp cho năng suất cao rất hiếm. Gần đây các nhà khoa học đã tìm ra vi khuẩn B. subtilis Natto có khả năng sản xuất ra một hỗn hợp poly acid glutamic và levan.
Khi chúng được nuôi cấy trong môi trường có thành phần chính gồm đường sucrose và axit amin L - Glutamic. Tuy nhiên, hỗn hợp poly acid - - glutamic chủ yếu được sản xuất trong môi trường có chứa acid - - glutamic và không có đường sucrose. Ngược lại, levan chỉ được sản xuất khi vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có tới 20% (w/w) đường sucrose nhưng không có glutamate. Các nhà khoa học cho rằng B.
subtilis Natto có tiềm năng sản xuất lượng lớn levan và sản phẩm dễ dàng tinh sạch (Shin và cs, 2005). Một số môi trường nuôi cấy kích thích B. subtilis sinh levan Levan sản xuất từ vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có thành phần chính là đường cacbonhydrate như sucrose. Năm 2004, Szwengiel và cs, đã nuôi cấy B.
subtilis DSM 347 trên môi trường có thành phần như sau: sucrose (150 g/l), acid citric (11,7 g/l), natri sulfat (4,0 g/l), ammonium hydrogen phosphate (4,2 g/l), cao nấm men (5,0 g/l) và 100 ml/l của dung dịch muối (với các thành phần: KCl (7,62 g/l), MgCl2 (4,18 g/l), MnCl2 (5,43 g/l), FeCl3 (0,49 g/l), ZnCl2 (0,21 g/l)). Độ pH của môi trường nuôi cấy đã được điều 9 chỉnh tới 6,8 bằng dung dịch amoniac 25%. Môi trường được khử trùng ở 121oC trong 20 phút.
