MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh cúm A/H5N1 là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở ngƣời và gia cầm, do virus cúm A subtype H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Nhóm virus cúm A đƣợc phân thành nhiều subtype khác nhau dựa trên protein kháng nguyên Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) với 18 subtype HA (H1- H18) và 11 subtype NA (N1 - N11). Trong nhóm virus cúm A, virus A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI H5N1) thƣờng gây chết gia cầm hàng loạt, có thể lây nhiễm sang ngƣời nên luôn là mối nguy hiểm tiềm ẩn trong chăn nuôi gia cầm và sức khỏe cộng đồng.
Biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm hiệu quả nhất là tiêm phòng vaccine. Trong quá trình sản xuất vaccine phòng chống virus A/H5N1 (thuộc nhóm virus có hệ gen dễ biến đổi do đột biến và tái tổ hợp gen), yếu tố chủng virus gốc bảo đảm tính an toàn và có khả năng bảo hộ cao với chủng lƣu hành là rất cần thiết. Để tái tạo đƣợc chủng virus đáp ứng tiêu chí của chủng ứng viên vaccine cúm A, kỹ thuật di truyền ngƣợc (reverse genetics) thƣờng đƣợc các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng với ƣu điểm: Cho phép thao tác với genome virus, tạo một hoặc một số biến đổi trong gen để loại bỏ các yếu tố tạo nên độc lực của chủng virus, giúp tạo chủng virus tái tổ hợp an toàn (có độc lực thấp) và mang các đặc tính mong muốn trong thời gian ngắn. Ở Việt Nam, công tác sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm từ năm 2003 (dịch cúm do virus HPAI H5N1 lần đầu xuất hiện) đến nay vẫn chủ yếu sử dụng chủng virus gốc tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngƣợc có nguồn gốc từ nƣớc ngoài.
Sự phụ thuộc vào chủng giống nhập ngoại khiến công tác sản xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt Nam thiếu tính chủ động và gặp nhiều khó khăn, đặc biệt khi các chủng cúm lƣu hành trong nƣớc có thể mang tính kháng nguyên chuyên biệt, hệ gen luôn biến đổi dẫn đến vaccine tạo ra trƣớc đó có thể không đạt hiệu quả bảo hộ cao với biến chủng virus mới xuất hiện. Do vậy, để chủ động đối phó với những diễn biến phức tạp của các dịch cúm gia cầm có khả năng bùng phát, Việt Nam cần 2 xây dựng và làm chủ qui trình ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc (Reverse Genetics - RG) để chủ động tạo ra các chủng virus vaccine có hiệu quả bảo hộ cao với những chủng virus đang lƣu hành. Hƣớng dẫn của WHO cho phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 bằng di truyền ngƣợc là tạo chủng virus tái tổ hợp có sự sắp xếp nguồn gen theo công thức 6 + 2 gồm: 6 phân đoạn gen khung nguồn gốc từ chủng A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8); 2 phân đoạn gen mã hóa kháng nguyên H5 và N1 của chủng virus hoang dại đang lƣu hành (chủng dự tuyển vaccine). Hiện nay, ở Việt Nam, trong số các clade virus cúm HPAI H5N1 đã và đang lƣu hành, clade 1.1c có tính tƣơng đồng kháng nguyên và đặc tính di truyền với nhiều clade khác nên đáp ứng yêu cầu của chủng dự tuyển vaccine phòng chống cúm A/H5N1.
Do vậy, việc nghiên cứu tạo chủng virus A/H5N1 clade 1.1 đáp ứng yêu cầu làm chủng ứng viên cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm HPAI H5N1 ở gia cầm là cần thiết. Đặc biệt, việc nghiên cứu để ứng dụng thành công và làm chủ công nghệ di truyền ngƣợc trong chủ động tạo ra chủng virus vaccine là rất có ý nghĩa. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn, luận án tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược”. Mục tiêu nghiên cứu Tạo đƣợc chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc.
Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập cDNA của 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa các protein khung của virus cúm A/PR/8/34 và tách dòng riêng rẽ từng gen vào plasmid pHW2000. Thiết kế và tách dòng hai gen H5 HA (đã đƣợc loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc và tránh lại độc) và hai gen N1 NA của chủng A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Viet Nam/HT- 3 02/2014(H5N1) (clade 2.1c) vào plasmid pHW2000. Chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen (6 plasmid mang phân đoạn gen khung + 2 plasmid mang gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 clade 1.1c) vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rg- A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.
Phân lập và tuyển chọn chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.1c đáp ứng yêu cầu của chủng ứng viên vaccine: Có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền. Xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu của hai chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.1c ở gà sạch 3 ngày tuổi. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn Kế t quả đa ̣t đƣơ ̣c của luâ ̣n án có ý nghĩa về lý luận và thƣ̣c tiễn vì đã làm chủ đƣợc công nghệ di truyền ngƣợc để tái tạo chủng virus tái tổ hợp làm ứng viên cho sản xuất vaccine đáp ứng nhanh, đặc hiệu với chủng virus đang lƣu hành. Ý nghĩa lý luận Kế t quả nghiên cƣ́u của luận án cung cấp cơ sở khoa học cho nghiên cứu và ứng dụng công nghệ di truyền ngƣợc để lắp ráp nhân tạo chủng giống gốc cho sản xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn 1. Tạo đƣ ợc bộ plasmid đơn gen mang 6 phân đoạn cDNA mã hóa các protein khung của virus cúm A/PR/8/34 (H1N1) - nguồn cung cấp gen khung đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo nên sử dụng trong nghiên cứu tái tạo chủng cúm tái tổ hợp ứng viên cho sản xuất vaccine cúm vô hoạt. Bộ plasmid mang các gen phân đoạn gen khung là nguồn vật liệu đƣợc chuẩn bị sẵn sàng cho sự kết hợp với các plasmid mang 2 phân đoạn gen kháng nguyên - HA và NA - của các chủng cúm A đang lƣu hành hay trong tƣơng lai sẽ xuất hiện để kịp thời lắp ráp nhân tạo chủng virus cúm tái tổ hợp làm ứng viên cho sản xuất vaccine. Thiết kế đƣợc sơ đồ cấu trúc gen kháng nguyên HA và NA thích hợp làm ứng viên gen kháng nguyên cho tạo chủng virus vaccine.
Trên cơ sở các cấu trúc gen đã thiết kế, trong tƣơng lai khi có các chủng cúm HPAI HxNy mới xuất hiện, dựa trên trình tự nucleotide đã đƣợc xác định của các gen kháng nguyên của virus mới, có thể nhanh chóng sinh tổng hợp nhân tạo các gen HA và NA làm ứng viên gen kháng nguyên cho lặp ráp chủng virus ứng viên vaccine phòng chống virus HPAI HxNy bằng công nghệ di truyền ngƣợc. Tái tạo và chọn lọc đƣợc hai chủng virus vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-clade 2.1c phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus HPAI H5N1 clade 1. Hai chủng virus tái tổ hợp có khả năng thích ứng nhân giống trong trứng gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024), có tính ổn định di truyền về gen kháng nguyên và kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (HI ≥ 4 log2) ở gà sạch 3 ngày tuổi. Đóng góp mới của luận án 1.
Là công trình khoa học đầu tiên chứng minh Việt Nam đã làm chủ công nghệ di truyền ngƣợc để tái tạo hiệu quả chủng virus ứng viên vaccine cúm A. Đã tối ƣu một số yếu tố công nghệ trong qui trình chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen vào tế bào 293T cho tái tạo chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp: Công thức chuyển nhiễm thích hợp là sử dụng hóa chất chuyển nhiễm Lipofectamine-2000 trong thời gian 30 phút, nồng độ plasmid thích hợp cho chuyển nhiễm là 1,0 µg/ 1 plasmid. Tạo hai chủng virus ứng viên vaccine (rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg- A/H5N1 clade 2.1c) có bộ genome gồm 6 phân đoạn gen của virus A/PR/8/34 và 2 phân đoạn gen kháng nguyên HA (đã đƣợc loại bỏ vùng độc, tránh lại độc) và NA của virus HPAI H5N1 clade 1. Các chủng virus ứng viên có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024 ở thế hệ P1 - P5), có tính ổn định di truyền gen kháng nguyên và kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể ở gà sạch 3 ngày tuổi (100% gà tiêm kháng nguyên virus có hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ 4 log2 ở tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phòng).
5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÖM A/H5N1 1. Vị trí phân loại Virus cúm A/H5N1 là một subtype (phân type) của chi Influenza A (virus cúm A), thuộc họ Orthomyxoviridae. Họ Orthomyxoviridae gồm 5 chi: Influenzavirus A (virus cúm A), Influenzavirus B (virus cúm B), Influenzavirus C (virus cúm C), Isavirus và Thogotovirus.
Trong số các chi thuộc họ Orthomyxoviridae, virus cúm A là nguy hiểm nhất với mức độ lây lan nhanh, có thể gây bệnh nặng và bùng phát thành dịch ở ngƣời và động vật. Dựa trên sự khác biệt về trình tự amino acid (ít nhất 30%) của hai loại protein kháng nguyên vỏ HA và NA, virus cúm A đƣợc phân thành các subtype với 18 subtype HA (H1- H18) và 11 subtype NA (N1 - N11) (Chen et al. Các subtype HA đƣợc phân thành hai nhóm dựa vào đặc điểm cấu trúc và đặc tính kháng nguyên của glycoprotein HA: Nhóm 1 gồm 12 subtype là H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 và H18; nhóm 2 có 6 subtype H3, H4, H7, H10, H14 và H15 (Hình 1. Phân loại virus cúm A dựa vào sự khác biệt về trình tự amino acid của protein HA (Nguồn: https://veteriankey.com/prevention-and-control-of-influenza-viruses) 6 Căn cứ vào khả năng gây bệnh, virus cúm A đƣợc phân thành 2 nhóm là nhóm có độc lực cao (Highly pathogenic avian influenza - HPAI) và nhóm có độc lực thấp (Lowpathogenic avian influenza - LPAI).
Nhóm LPAI thƣờng chỉ gây bệnh nhẹ ở đƣờng hô hấp, làm giảm sức đẻ và/hoặc làm giảm trọng lƣợng ở gia cầm, nhóm HPAI có khả năng lây lan nhanh, gây chết gia cầm với tỷ lệ cao (ít nhất 75% gia cầm nhiễm bị chết). Theo thống kê của Pantin-Jackwood và đtg (2016), hầu hết các chủng HPAI đã xuất hiện đều thuộc subtype H5 hoặc H7.
