Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 1. G protein G protein lần đầu tiên được phát hiện và mô tả bởi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cứu tác động của adrenaline đối với tế bào. Với công trình này, hai ông đã giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [4]. G protein một nhóm protein lớn có bản chất là enzyme GTPases [46].
Dựa vào kích thước người ta chia chúng thành hai họ: GTPases dạng monomer kích thước nhỏ và G protein dạng trimer kích thước lớn. G protein kích thước lớn được tạo thành từ các tiểu đơn vị alpha (Gα), beta (Gβ) và gamma (Gγ). Hai tiểu đơn vị beta (Gβ) và gamma (Gγ) hình thành phức dimer bền vững (Gβγ); phức này liên kết với tiểu đơn vị alpha (Gα) [29]. G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào.
Thụ thể liên kết với G protein Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine) [45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ tương đồng về trình tự acid amine, chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử. Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể liên kết với G protein ở người, trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức năng [52]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 1: Sự đa dạng của các họ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) [56]. Họ GPCR được phân chia thành ba lớp chính: lớp A, B và C.
Lớp A hay còn gọi là lớp Rhodopsin đông đảo nhất về số lượng thụ thể trong họ GPCR với 19 phân lớp (Hình 1). Lớp A cho phép nhận tín hiệu từ các monoamine, purine, opioid, chemokine, một số hormone có bản chất peptide hoặc glycoprotein,. trong đó đặc biệt là truyền dẫn các tín hiệu có liên quan tới mùi hương. Lớp B còn được gọi là lớp Secretin với 34 phân lớp chủ yếu dẫn truyền tín hiệu liên quan tới các hormone có bản chất peptide như parathyroid, calcitonin, … Lớp C còn được gọi là lớp Glutamate với 8 phân lớp có vai trò thu nhận tín hiệu trong quá trình trao đổi dinh dưỡng của tế bào [3, 60].
Về cấu trúc, tất cả các thụ thể liên kết với G protein đều có đầu amino ở ngoài màng, 7 chuỗi xoắn xuyên màng, 3 vòng ở phía ngoài (exoloop), 3 vòng ở phía trong màng (cytoloop) và đầu carboxyl phân bố trong màng (Hình 2). Hầu hết LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com các thụ thể này đều được gắn thêm carbonhydrate vào đầu amino và palmityl hóa ở vị trí Cys ở đầu carboxyl. Mỗi chuỗi xuyên màng chứa 20-27 acid amine, đầu amino chứa 7-595 acid amine, các vòng xoắn chứa 5-230 acid amine, đầu carboxyl chứa 12-359 acid amine. Điều này cho thấy cấu trúc của GPCR rất đa dạng.
Người ta đã tìm ra mối liên hệ yếu giữa chiều dài của đầu amino với kích thước của cấu tử gắn tương ứng [51]. Ngoài tế bào tế bào Trong tế bào tế bào Hình 2: Cấu trúc chung của thụ thể xuyên màng 7 lần liên kết với G protein [60]. Vùng xuyên màng với 7 chuỗi xoắn alpha tạo nên hình dạng đặc trưng cho thụ thể GPCR. Trong đó vùng xuyên màng 1, 4, 7 chỉ chứa duy nhất một acid amine kỵ nước là asparagine hoặc serine.
Điều này khiến cho chúng có tính kỵ nước cao hơn các vùng xuyên màng còn lại. Trên cấu trúc của các vùng xuyên màng thường chứa cysteine tham gia vào tạo cầu disulfit [51]. GPCR đều có chung một cơ chế hoạt động. Khi một cấu tử mang tín hiệu (hormone, photon, .) liên kết với vùng đặc hiệu trong thụ thể trên bề mặt tế bào sẽ làm thay đổi cấu hình của GPCR.
Sự thay đổi đó kích hoạt G protein chuyển từ trạng thái “tắt” – đang liên kết với GDP sang trạng thái “bật” – liên kết với GTP ở tiểu đơn vị Gα. Ở trạng thái “bật”, phức Gα-GTP tách khỏi phức dimer Gβγ, khi đó chúng sẽ kích hoạt các enzyme hình thành lên chất truyền tin thứ hai là cAMP hoặc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com inositol triphosphate/diacetyl glycerol (IP3/DAG). Điều này phụ thuộc vào loại tiểu đơn vị alpha trong G protein, từ đó tạo ra một dòng thác những tín hiệu được truyền dẫn, kết quả cuối cùng là làm thay đổi hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào [29, 38]. Về chức năng, GPCR và G protein cùng phối hợp với nhau để thực hiện vai trò truyền dẫn các tín hiệu hormone, chất dẫn truyền thần kinh, hạt photon ánh sáng, các phân tử mùi hương, các loại peptide, một số ion,.
từ môi trường bên ngoài vào bên trong tế bào [51, 60]. Do có nhiều chức năng rất quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu của tế bào nên hiện nay G protein và các thụ thể liên kết với chúng đang là đích tách động cho nhiều liệu pháp chữa bệnh. Theo ước tính có khoảng hơn một nửa số thuốc hiện nay có đích tác động là GPCRs [3, 4].2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ Tachykinin là một trong những họ neuropeptide lớn nhất được tìm thấy trong cơ thể của tất cả các loài động vật. Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ các nhóm động vật không xương và có xương sống [15, 45].
Trong họ tachykinin, chất P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi Euler và Gaddum khi hai ông nghiên cứu dịch chiết não và ruột ngựa trong cồn. Dịch chiết này có tác dụng kích thích hiệu quả hoạt động của ruột và gây giảm huyết áp ở thỏ [21]. Tuy nhiên, rất nhiều thí nghiệm nhằm phân lập và tinh sạch SP có hoạt tính từ các mẫu ruột ngựa đã không thành công. Năm 1983, Kangawa và Kimura đã phân lập được thêm hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với SP là neurokinin A (NKA) và neurokinin B (NKB) từ vùng thần kinh trung ương và ngoại vi [31, 33].
Hiện nay, tachykinin trong mô động vật có vú đã được xác định gồm có chất P (hay SP), neurokinin A (hay neuromedin L hoặc chất K) và neurokinin B (hay neuromedin K). Riêng NKA được mở rộng thêm 2 dạng là neuropeptide K và neuropeptide γ (Bảng 1). LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 1: Trình tự amino acid đầu carboxyl của các tachykinin ở động vật có vú [61] Peptide/Nguồn Trình tự amino acid đầu C Tài liệu trích dẫn SP Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln- Chang và cộng sự, Vùng dưới đồi của Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 1971 bò NKA His-Lys-Thr-Asp-Ser- Kimura và cộng sự, Tủy sống của lợn Phe- Val-Gly-Leu-Met-NH2 1983 NKB Asp-Met-His-Asp-Phe- Kangawa và cộng sự, Tủy sống của lợn Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 1983 Neuropeptide-γ Asp-Ala-Gly-His-Gly-Gln-Ile-Ser- His-Lys-Arg-Lys-Asp-Ser- Kage và cộng sự, 1988 Ruột thỏ Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 Asp-Ala-Asp-Ser-Ser-Ile-Glu- Neuropeptide K Lys-Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Lys- Tatemoto và cộng sự, Ala-Leu-Tyr-Gly-His-Gly-Gln- 1985 Ile-Ser-His-Lys-Arg-His-Gly- Não lợn Gln-Ile-Ser-His-Lys-Arg-Lys-Asp-Ser – Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 Các tachykinin ở động vật có vú đều được đặc trưng bởi trình tự đầu carboxyl với cấu trúc bảo thủ: Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2, trong đó X là một amino acid béo (Val hoặc Ile) hoặc thơm (Phe hoặc Tyr) [20]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Gen PPT-A Quá trình phiên mã Dịch mã và tổng Dịch mã và tổng hợp protein hợp protein Dịch mã và tổng hợp protein Quá trình biến đổi sau dịch mã Quá trình biến đổi sau dịch mã Quá trình biến đổi sau dịch mã Hình 3: Sơ đồ cắt-nối gen mã hóa cho tachykinin ở động vật có vú [37].
Các gen mã cho tachykinin ở người gồm TAC1 (hay PPT-A) định vị trên NST số 7 và TAC3 (hay PPT-B) định vị trên NST số 12. Các gen này tương ứng với gen Tac1 và Tac2 ở chuột. Gen TAC1 mã hóa cho SP, NKA, neuropeptide K, neuropeptide- γ [3, 7]. Sở dĩ gene này mã hóa được cho một loạt sản phẩm là do mRNA tổng hợp từ gen TAC1 đã trải qua quá trình cắt nối luân phiên để tổng hợp các dạng preprotachykinin khác nhau: alpha (α-PPT), beta (β-PPT) và gamma (γ- PPT) [34].
Sau quá trình dịch mã, từ các tiền chất protein này sẽ tiếp tục được cắt nối để tạo thành tachykinin SP, NKA, NKB. Chi tiết sơ đồ quá trình cắt nối được trình bày trong Hình 3. Trong đó, dạng α-PPT-A mARN thiếu exon 6 được tìm thấy chủ yếu ở trong não. Dạng γ-PPT-A mARN thiếu exon 4 và dạng β-PPT-A mARN đủ cả 7 exon được tìm thấy chủ yếu ở các hạch thần kinh ngoại biên [36, 37].
Các LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đoạn peptide tiền thân được nhận biết nhờ 6 nhóm enzyme thủy phân gọi là convertase và cắt đặc hiệu tại các vị trí Lys-Arg, Arg-Arg hoặc Arg-Lys để tạo thành các dạng tachykinin tương ứng [34, 47]. Trong đó cả ba dạng preprotachykinin đều được sử dụng để tạo thành chất P còn dạng preprotachykinin beta và gamma mới được sử dụng để hình thành lên các dạng peptide khác (NKA, neuropeptide γ, neuropeptide K). Ở một số mô trong cơ thể, neuropeptide K và γ thường có đầu amino dài hơn so với NKA [12]. Trong khi đó gen TAC3 (PPT-B) mã hóa cho neurokinin B biểu hiện chủ yếu trong vùng dưới đồi và ruột [7].
Từ năm 2000, nhóm của Yu Zhang và cộng sự tiến hành nghiên cứu ở tế bào lympho B ở chuột đã phát hiện dạng tachykinin thứ tư là hemokinin. Ở người, hemokinin được mã hóa bởi gen TAC4 (PPT-C) định vị trên NST số 17 [39, 54]. Gen này có được cắt nối theo nhiều cách khác nhau để từ đó hình thành nên nhiều dạng hemokinin và endokinin khác nhau trong cơ thể. Tachykinin được tổng hợp trong các tế bào thần kinh (trung ương và ngoại vi) và cả các tế bào không phải tế bào thần kinh.
Sự phân bố này phụ thuộc vào từng loài và rất khó tìm ra quy luật phân bố của chất này. Có nhiều vị trí biểu hiện tachykinin đến nay vẫn chưa biết chức năng. Khi phân bố ở tế bào thần kinh, tachykinin hoạt động như một chất truyền dẫn tín hiệu thần kinh, trong khi ở các tế bào không phải tế bào thần kinh, chúng có vai trò như những chất nội tiết, cận nội tiết hoặc điều chỉnh hoạt động hệ nội tiết [27]. Ở động vật có vú, tachykinin chú yếu được biểu hiện ở tế bào không phải tế bào thần kinh dưới dạng SP.
Sau khi được giải phóng vào máu, SP cùng với serotonin hoạt động như một chất cận nội tiết hoặc một chất nội tiết tố thực sự. Khi đó chúng đóng vai trò như một tác nhân gián tiếp gây giải phóng chất gây giãn mạch máu hoặc trực tiếp gây co cơ trơn [8, 21].