Khóa luận: Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và polyphenol của hạt bí ngô - HV Nông nghiệp Việt Nam 2023

Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và hàm lượng polyphenol trong hạt bí ngô, khám phá tiềm năng chống oxy hóa và lợi ích sức khỏe.

• Tác giả: Lê Thị Phương Oanh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thanh Hải
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của hạt bí ngô
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu về hạt bí ngô
• 2.2. Thành phần hóa học
• 2.3. Nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên trên thế giới
• 2.4. Tình hình các nghiên cứu tác dụng của dịch chiết hạt bí ngô
• 2.4.1. Nghiên cứu ở nước ngoài
• 2.4.2. Nghiên cứu trong nước
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.3. Đối tượng nghiên cứu
• 3.4. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu
• 3.5.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết dược liệu trên vi khuẩn
• 3.5.3. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol
• 3.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
• 3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả đường kính vòng vô khuẩn của các loại dịch chiết hạt bí ngô trước và sau khi tác dụng nhiệt
• 4.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số của các dịch chiết dược liệu
• 4.3. Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết hạt bí ngô
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn hạt bí ngô

Hạt bí ngô, hay còn gọi là hạt bí đỏ, đã được biết đến với nhiều tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hạt bí ngô không chỉ giàu dinh dưỡng mà còn có khả năng kháng khuẩn đáng kể. Việc tìm hiểu về tác dụng kháng khuẩn của hạt bí ngô và hàm lượng polyphenol trong thực phẩm này là rất cần thiết để phát triển các sản phẩm tự nhiên an toàn và hiệu quả.

1.1. Hạt bí ngô và thành phần hóa học của nó

Hạt bí ngô chứa nhiều thành phần hóa học có lợi như acid linoleic, vitamin E và các hợp chất phenolic. Những thành phần này không chỉ cung cấp dinh dưỡng mà còn có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do.

1.2. Tình hình nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của hạt bí ngô

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết từ hạt bí ngô có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Các nghiên cứu này đã khẳng định rằng hạt bí ngô có thể là một nguồn nguyên liệu quý giá trong việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu hạt bí ngô

Mặc dù hạt bí ngô có nhiều lợi ích, nhưng việc nghiên cứu và ứng dụng chúng trong thực tiễn vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như sự biến đổi chất lượng do điều kiện bảo quản và phương pháp chiết xuất chưa tối ưu cần được giải quyết.

2.1. Thách thức trong việc chiết xuất hoạt chất từ hạt bí ngô

Phương pháp chiết xuất hiện tại chưa tối ưu, dẫn đến việc thu được hàm lượng polyphenol thấp. Cần nghiên cứu và phát triển các phương pháp chiết xuất hiệu quả hơn để tối đa hóa lợi ích từ hạt bí ngô.

2.2. Vấn đề bảo quản và ổn định hoạt chất

Hoạt chất trong hạt bí ngô có thể bị phân hủy nếu không được bảo quản đúng cách. Việc tìm ra các phương pháp bảo quản hiệu quả là rất quan trọng để duy trì hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của hạt bí ngô.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của hạt bí ngô

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để đánh giá tác dụng kháng khuẩn và hàm lượng polyphenol trong hạt bí ngô. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất bằng dung môi và xác định hoạt tính kháng khuẩn qua thử nghiệm trên đĩa thạch.

3.1. Phương pháp chiết xuất hạt bí ngô

Chiết xuất hạt bí ngô được thực hiện bằng hệ thống cô quay chân không, giúp thu được dịch chiết có hàm lượng hoạt chất cao. Phương pháp này cho phép loại bỏ dung môi một cách hiệu quả, giữ lại các hợp chất có lợi.

3.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết hạt bí ngô được xác định thông qua phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch. Kết quả cho thấy dịch chiết có khả năng ức chế nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, đặc biệt là Staphylococcus aureus.

IV. Kết quả nghiên cứu về hàm lượng polyphenol trong hạt bí ngô

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol trong hạt bí ngô có sự khác biệt rõ rệt tùy thuộc vào phương pháp chiết xuất. Dịch chiết từ hạt bí ngô không chỉ có tác dụng kháng khuẩn mà còn chứa nhiều hợp chất chống oxy hóa.

4.1. Hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết

Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu. Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol có hàm lượng polyphenol cao nhất, cho thấy khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ.

4.2. Tác dụng chống oxy hóa của hạt bí ngô

Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hạt bí ngô được xác định qua thử nghiệm DPPH. Kết quả cho thấy dịch chiết này có khả năng loại bỏ gốc tự do hiệu quả, góp phần bảo vệ sức khỏe.

V. Ứng dụng thực tiễn của hạt bí ngô trong y học

Hạt bí ngô không chỉ được sử dụng trong ẩm thực mà còn có tiềm năng lớn trong y học. Các sản phẩm chiết xuất từ hạt bí ngô có thể được phát triển thành thuốc kháng khuẩn tự nhiên, giúp giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh tổng hợp.

5.1. Tiềm năng ứng dụng trong sản phẩm thực phẩm

Hạt bí ngô có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng, giúp tăng cường sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật. Việc bổ sung hạt bí ngô vào chế độ ăn uống hàng ngày có thể mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

5.2. Phát triển sản phẩm dược phẩm từ hạt bí ngô

Nghiên cứu về hạt bí ngô mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm dược phẩm tự nhiên, an toàn và hiệu quả. Các sản phẩm này có thể giúp điều trị các bệnh lý liên quan đến vi khuẩn và oxy hóa.

VI. Kết luận và triển vọng nghiên cứu hạt bí ngô

Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn và hàm lượng polyphenol trong hạt bí ngô đã chỉ ra rằng đây là một nguồn nguyên liệu quý giá. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ hạt bí ngô sẽ mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người.

6.1. Kết luận về tác dụng kháng khuẩn

Hạt bí ngô có tác dụng kháng khuẩn rõ rệt, đặc biệt là đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên từ hạt bí ngô.

6.2. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tối ưu hóa phương pháp chiết xuất và bảo quản hạt bí ngô. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả sử dụng và phát triển các sản phẩm mới từ hạt bí ngô.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Kháng kháng sinh hiện đang là một trong những thách thức y tế và thú y nghiêm trọng trên toàn cầu, thúc đẩy xu hướng nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học tự nhiên từ thực vật nhằm tìm kiếm giải pháp thay thế hoặc hỗ trợ giảm thiểu sự phụ thuộc vào các chất kháng sinh và chất chống oxy hóa tổng hợp. Theo thống kê của Tổ chức Thực vật Quốc tế (FBI, 2014), trong số khoảng 265.000 loài thực vật đã được định danh, có ít nhất 6.000 loài được ứng dụng làm thuốc, nhưng mới chỉ có khoảng 1.300 loài được nghiên cứu thành phần hóa học một cách có hệ thống. Các hợp chất tự nhiên như polyphenol, flavonoid, lipid phân cực và các peptide kháng khuẩn có ưu điểm dễ phân hủy sinh học, ít tác dụng phụ và giảm thiểu nguy cơ tích tụ độc tính trong môi trường sống cũng như chuỗi thực phẩm.

Hạt bí ngô (Cucurbita moschata Duchesne) từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền với công dụng trị giun sán, hỗ trợ tiêu hóa, làm lành vết thương ngoài da và tăng cường miễn dịch. Các nghiên cứu hiện đại trên thế giới cho thấy chiết xuất hạt bí ngô chứa hàm lượng dầu béo cao (30–53%), giàu acid béo không bão hòa (acid linoleic 35–68%, acid oleic 15–48%), squalen (39–46%), phytosterol, các hợp chất lignan (lariciresinol, medioresinol, pinoresinol) cùng các protein kháng khuẩn. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu so sánh tác dụng kháng khuẩn của hạt bí ngô trên nhiều hệ dung môi chiết xuất khác nhau cũng như đánh giá sự biến đổi của hoạt tính sinh học dưới tác động của nhiệt độ sao thô dược liệu vẫn còn hạn chế. Do đó, đề tài "Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của hạt bí ngô" được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc khai thác và chế biến nguồn dược liệu này.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài được xác định gồm 4 nội dung cụ thể:

1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt bí ngô trên một số chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Geobacillus stearothermophilus.
2. Đánh giá hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết hạt bí ngô.
3. Tìm ra dung môi thích hợp để thu được dịch chiết hạt bí ngô có khả năng kháng khuẩn mạnh, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao.
4. Đánh giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ (quá trình sao thô) đến khả năng kháng khuẩn, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hạt bí ngô.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Bột hạt bí ngô (Cucurbita moschata Duchesne) dạng bột mịn (kích thước hạt < 0,05 mm) ở hai trạng thái: nguyên bản (chưa xử lý nhiệt) và đã qua xử lý nhiệt (sao thô). Đối tượng vi sinh vật khảo sát gồm 9 chủng vi khuẩn kiểm định: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 85922, Escherichia coli ATCC 35218, Bacillus subtilis ATCC 6633, Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 25023 và Salmonella ATCC 13311 (cung cấp bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội).
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 8/2022 đến tháng 12/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết về hóa học thực vật và vi sinh vật học thực nghiệm. Quy trình xử lý nhiệt đối với dược liệu được thực hiện theo nguyên tắc sao thô quy định tại Thông tư số 30/2017/TT-BYT ngày 11/07/2017 của Bộ Y tế, nhằm biến đổi tính chất cảm quan và khảo sát độ bền nhiệt của các hoạt chất sinh học.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm các quy trình chuẩn hóa:

• Phương pháp chiết xuất dược liệu: Sử dụng 6 dung môi có độ phân cực khác nhau gồm methanol, ethanol 96%, aceton, ethyl acetat, hexan và nước cất 2 lần (DW). Tỉ lệ ngâm chiết là 1:30 (10 g bột dược liệu khô trong 300 ml dung môi). Với dung môi hữu cơ, quá trình ngâm chiết diễn ra trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ sau khi khuấy từ 10 phút. Với dung môi nước cất 2 lần, dược liệu được đun sôi ở 100°C và khuấy từ trong 30 phút. Dịch chiết sau khi ly tâm (3500 vòng/phút trong 10 phút) và lọc qua giấy lọc được cô quay hút chân không trên máy cô quay RE-501 ở nhiệt độ ≤ 45°C để thu cao chiết.
• Phương pháp hòa tan và chuẩn bị dịch thử nghiệm: Cao chiết sau cô quay được hòa loãng lại bằng Dimethyl Sulfoxide (DMSO) theo tỷ lệ 10 g bột dược liệu khô ban đầu trên 5 ml DMSO. Dịch chiết gốc nồng độ 2 g/ml được tách loại lớp dầu nổi hoặc cặn lắng, sau đó pha loãng theo dãy nồng độ thử nghiệm: 2 g/ml; 1 g/ml; 0,5 g/ml; 0,25 g/ml. Dung môi DMSO được sử dụng làm đối chứng âm.
• Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn: Đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) trên môi trường Mueller Hinton Agar (MHA) và Tryptone Soya Agar (TSA). Canh khuẩn được chuẩn hóa mật độ đạt 9×10⁸ CFU/ml (tương đương chuẩn độ đục McFarland 3.0 pha từ BaCl₂ 1% và H₂SO₄ 1%). Dung dịch thử được nạp vào các giếng thạch có đường kính d = 10 mm với thể tích 100 µl/giếng, ủ ở 37°C trong 24 giờ. Đường kính vòng vô khuẩn được xác định theo công thức: Đường kính vòng vô khuẩn = D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng ức chế đo bằng thước đo điện tử. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
• Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số: Dựa trên phương pháp Folin-Ciocalteu (Suda et al., 2005), đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 750 nm trên máy quang phổ so màu 722 UV-Vis (Jinghua, Trung Quốc). Đường chuẩn được thiết lập bằng acid chlorogenic (Merck, Đức) với phương trình tương quan đạt R² = 0,9969 (p < 0,001). Hàm lượng polyphenol được quy đổi sang mg acid chlorogenic tương đương trên 100 mg dược liệu.
• Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa:
  • Thử nghiệm dập tắt gốc tự do DPPH (Marsden Blois, 1958): Đo độ giảm hấp thụ quang tại bước sóng 515 nm, sử dụng Vitamin E (alpha-tocopherol, Merck) làm chất chuẩn (đường chuẩn có phương trình y = 201,02x + 10,065, R² = 0,9935, p < 0,001).
  • Thử nghiệm bắt gốc tự do ABTS•+ (Re et al., 1999): Gốc tự do ABTS•+ được tạo ra từ phản ứng giữa dung dịch ABTS 7 mM và K₂S₂O₈ 4,9 mM (tỉ lệ 1:1, ủ tối 16 giờ ở 37°C), đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 734 nm, sử dụng Trolox làm chất chuẩn (đường chuẩn có phương trình y = 463,83x + 13,887, R² = 0,9776, p < 0,001).
• Phương pháp xử lý số liệu: Tính toán các giá trị thống kê trung bình (Mean) và độ lệch chuẩn (SD) bằng phần mềm Microsoft Excel.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu thay thế kháng sinh tổng hợp bằng các hợp chất tự nhiên nhằm hạn chế nguy cơ kháng thuốc trong y học và chăn nuôi thú y. Hạt bí ngô được xác định là nguồn nguyên liệu sẵn có, giàu tiềm năng sinh học nhưng chưa được đánh giá toàn diện về phổ kháng khuẩn trên nhiều dung môi và sự biến đổi hoạt tính khi qua xử lý nhiệt. Phần mở đầu thiết lập 4 mục tiêu nghiên cứu và nêu rõ ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn trong việc định hướng bảo quản và tuyển chọn dung môi chiết xuất dược liệu.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các tài liệu khoa học về đặc tính thực vật học của loài Cucurbita moschata Duchesne, phân bố sinh thái tại Việt Nam và trên thế giới. Về hóa thực vật, tác giả phân tích chi tiết các nhóm thành phần chính gồm dầu béo (chiếm 30–53%, ưu thế bởi acid linoleic 35–68% và acid oleic 15–48%), squalen (39–46%), sterol thực vật, amino acid đặc trưng (cucurbitin, citrullin) và các dẫn xuất lignan. Chương tổng quan cũng phân tích các công trình nghiên cứu quốc tế về hoạt tính ức chế vi sinh vật, chống oxy hóa, kháng viêm và ức chế tế bào ung thư của dầu hạt bí ngô (như nghiên cứu của CS Vidhya et al., 2022; Ziaul Amin & Uddin, 2020; Rriyanka Dash & Ghosh, 2017; Fatos Rexhepi et al., 2022) cùng thực trạng sử dụng phương pháp sao thô dược liệu trong y học cổ truyền Việt Nam.

Phần III: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu

Tác giả mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu hạt bí ngô từ làng nghề dược liệu Nghĩa Trai (Hưng Yên), thông số thiết bị và hóa chất phân tích chuẩn quốc tế. Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa qua 5 bước chính: (1) Sơ chế và sao thô dược liệu ở 100–160°C trong 20 phút; (2) Ngâm chiết với 6 hệ dung môi và cô quay chân không ở nhiệt độ ≤ 45°C; (3) Hòa cao bằng DMSO và tạo dãy nồng độ 0,25–2 g/ml; (4) Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng khuếch tán giếng thạch trên 9 chủng vi khuẩn; (5) Đo quang phổ xác định polyphenol (thuốc thử Folin-Ciocalteu) và hoạt tính chống oxy hóa (thuốc thử DPPH, ABTS). Tác giả cũng tiến hành thẩm định tính trơ của dung môi DMSO ở các nồng độ từ 10% đến 100% và dải pH từ 2 đến 13, chứng minh DMSO không tạo vòng vô khuẩn và không gây ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm sinh học.

Phần IV: Kết quả và Thảo luận

Tác giả trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ các phép đo vòng vô khuẩn, đo mật độ quang polyphenol và khả năng dập tắt gốc tự do. Các kết quả được phân tích theo từng nhóm dung môi và so sánh trực tiếp giữa trạng thái chưa xử lý nhiệt với trạng thái đã xử lý nhiệt.

Dung môi chiết xuất	Số chủng vi khuẩn bị ức chế (Chưa xử lý nhiệt)	Đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất khi chưa xử lý nhiệt (mm)	Số chủng vi khuẩn bị ức chế (Đã xử lý nhiệt)	Đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất khi đã xử lý nhiệt (mm)
Ethanol 96%	9/9	16,54 ± 0,74 (S. aureus ATCC 25923, tại 2 g/ml)	5/9	6,30 (B. subtilis, tại 2 g/ml)
Aceton	5/9	12,85 ± 0,13 (P. aeruginosa ATCC 9027, tại 2 g/ml)	5/9	6,58 (B. subtilis, tại 2 g/ml)
Ethyl acetat	4/9	4,95 (B. subtilis, tại 0,5 g/ml)	5/9	Vòng kháng khuẩn nhỏ (< 5 mm)
Methanol	4/9	5,39 ± 0,09 (B. subtilis, tại 0,5 g/ml)	5/9	Vòng kháng khuẩn nhỏ (< 5 mm)
Hexan	4/9	5,92 ± 0,25 (G. stearothermophilus, tại 2 g/ml)	5/9	Vòng kháng khuẩn nhỏ (< 5 mm)
Nước cất 2 lần (DW)	2/9	3,14 ± 0,04 (G. stearothermophilus, tại 2 g/ml)	5/9	Hoạt tính kháng khuẩn thấp nhất

Các phát hiện chính trong chương gồm:

• Dịch chiết ethanol thể hiện phổ ức chế rộng nhất và mạnh nhất khi chưa xử lý nhiệt, tạo vòng vô khuẩn 16,54 ± 0,74 mm trên S. aureus ATCC 25923 và 13,0 ± 1,58 mm trên Salmonella ATCC 13311 tại nồng độ 2 g/ml.
• Dịch chiết aceton không ức chế 3 chủng E. coli và Salmonella, nhưng thể hiện hoạt tính mạnh trên P. aeruginosa (12,85 ± 0,13 mm tại 2 g/ml).
• Tác động nhiệt (sao thô) làm mất hoàn toàn hoạt tính kháng khuẩn của tất cả các dịch chiết đối với 4 chủng vi khuẩn Gram âm (E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 85922, E. coli ATCC 35218, P. aeruginosa ATCC 9027 và Salmonella ATCC 13311), đồng thời làm suy giảm kích thước vòng vô khuẩn trên 5 chủng vi khuẩn Gram dương.
• Đối với định lượng polyphenol, phương pháp thử nghiệm chưa ghi nhận được kết quả định lượng cụ thể do sự không phù hợp giữa quy trình phân tích và nền mẫu cao chiết.
• Đối với hoạt tính chống oxy hóa, các mẫu chưa xử lý nhiệt ở nồng độ 200 mg/ml không làm đổi màu thuốc thử DPPH. Ngược lại, mẫu hạt bí ngô đã qua xử lý nhiệt thể hiện hoạt tính bắt gốc tự do rõ rệt, trong đó dịch chiết ethanol đạt giá trị cao nhất là 0,122 mg Vitamin E tương đương trên 100 mg dược liệu.

Phần V: Kết luận và Kiến nghị

Khóa luận tổng kết lại các kết quả cốt lõi về sự phụ thuộc của hoạt tính kháng khuẩn vào dung môi chiết, nồng độ dịch chiết và loại vi khuẩn; khẳng định ethanol là dung môi tối ưu nhất; đồng thời khuyến nghị các điều kiện chế biến, bảo quản thích hợp nhằm duy trì hoạt tính sinh học của hạt bí ngô.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã đạt được các kết quả thực nghiệm định lượng cụ thể sau:

1. Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt bí ngô chưa qua xử lý nhiệt:
   • Dịch chiết ethanol 96% có hiệu quả cao nhất khi ức chế được toàn bộ 9/9 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Hoạt tính ức chế mạnh nhất ghi nhận trên S. aureus ATCC 25923 với đường kính vòng vô khuẩn 16,54 ± 0,74 mm (ở nồng độ 2 g/ml), Salmonella ATCC 13311 đạt 13,0 ± 1,58 mm (ở 2 g/ml), và E. coli ATCC 25922 đạt 11,04 ± 0,34 mm (ở 2 g/ml).
   • Dịch chiết aceton có hoạt tính đặc hiệu mạnh trên P. aeruginosa ATCC 9027 đạt đường kính 12,85 ± 0,13 mm ở nồng độ 2 g/ml, nhưng không thể hiện tác dụng trên các chủng E. coli và Salmonella.
   • Dịch chiết hexan ức chế tốt nhất trên chủng vi khuẩn chịu nhiệt G. stearothermophilus ATCC 7953 với đường kính vòng vô khuẩn 5,92 ± 0,25 mm ở nồng độ 2 g/ml.
   • Dịch chiết nước cất 2 lần (DW) cho hoạt tính kháng khuẩn kém nhất trong 6 dung môi khảo sát, chỉ ức chế yếu trên 2 chủng B. subtilis và G. stearothermophilus với đường kính vòng vô khuẩn dao động từ 2,21 đến 3,14 mm.
2. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt (sao thô ở 100–160°C trong 20 phút):
   • Quá trình sao thô làm mất hoàn toàn hoạt tính kháng khuẩn trên toàn bộ các chủng vi khuẩn Gram âm (E. coli, Salmonella, P. aeruginosa).
   • Trên các chủng vi khuẩn Gram dương, kích thước vòng vô khuẩn bị suy giảm đáng kể: giá trị đường kính lớn nhất sau nhiệt chỉ đạt 6,58 mm (dịch chiết aceton trên B. subtilis ở 2 g/ml) và 6,30 mm (dịch chiết ethanol trên B. subtilis ở 2 g/ml).
3. Đánh giá hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa:
   • Chưa xác định được hàm lượng polyphenol tổng số do phương pháp phân tích áp dụng chưa phù hợp với thành phần dịch chiết hạt bí ngô trong điều kiện thực nghiệm.
   • Quá trình xử lý nhiệt kích hoạt khả năng chống oxy hóa đối với thuốc thử DPPH (mẫu chưa nhiệt ở nồng độ 200 mg/ml không làm đổi màu DPPH, trong khi mẫu sau nhiệt làm đổi màu rõ rệt). Dịch chiết ethanol sau xử lý nhiệt đạt hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, tương đương 0,122 mg Vitamin E / 100 mg dược liệu.

Kiến nghị của tác giả:

• Cần tiếp tục nghiên cứu, tối ưu hóa lại phương pháp xác định hàm lượng polyphenol phù hợp hơn với đặc tính của dịch chiết hạt bí ngô.
• Cần khảo sát thêm các thang nhiệt độ và khoảng thời gian sao thô khác nhau nhằm tìm ra ngưỡng nhiệt tối ưu giúp giữ lại hoạt tính kháng khuẩn đồng thời giải phóng tối đa các chất có khả năng chống oxy hóa.
• Khuyến cáo việc sử dụng dung môi ethanol 96% trong các quy trình chiết xuất hoạt chất từ hạt bí ngô để phục vụ ứng dụng bào chế dược liệu và sản phẩm bảo vệ sức khỏe.

Đóng góp của đề tài:

• Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm có hệ thống so sánh tác dụng kháng khuẩn của hạt bí ngô trên 6 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau đối với 9 chủng vi khuẩn kiểm định.
• Chứng minh rõ nét tác động tiêu cực của nhiệt độ sao thô (100–160°C) đối với hoạt tính kháng khuẩn, đồng thời ghi nhận sự gia tăng khả năng dập tắt gốc tự do DPPH sau khi xử lý nhiệt.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên nội dung văn bản và phạm vi thực nghiệm của đề tài, các hạn chế và hướng mở được xác định như sau:

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Phương pháp Folin-Ciocalteu trong điều kiện thí nghiệm của đề tài chưa định lượng được hàm lượng polyphenol tổng số do quy trình chiết tách và nền mẫu dầu béo cao của hạt bí ngô gây cản trở phép đo quang phổ.
  • Thử nghiệm mới dừng lại ở việc đánh giá cao chiết thô, chưa tiến hành phân lập, tinh sạch và định danh chính xác các đơn chất chịu trách nhiệm cho hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa.
  • Nghiên cứu chỉ khảo sát một chế độ nhiệt sao thô cố định (100–160°C trong 20 phút) và thử nghiệm in vitro trên các chủng vi khuẩn chuẩn phòng thí nghiệm, chưa đánh giá trên các chủng vi khuẩn phân lập thực tế từ lâm sàng hoặc vật nuôi bệnh.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Tinh chỉnh và chuẩn hóa quy trình phân tích polyphenol bằng cách loại bỏ triệt để pha dầu béo hoặc áp dụng các kỹ thuật sắc ký phân tích (HPLC/LC-MS).
  • Khảo sát chi tiết động học tác động của nhiệt độ ở các dải nhiệt độ hẹp hơn (như 80°C, 90°C, 110°C, 130°C) và thời gian xử lý khác nhau để xác định điểm cân bằng giữa độ bền của hoạt chất kháng khuẩn và sự hình thành các chất chống oxy hóa.
  • Mở rộng thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) và thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật.

Giá trị tham khảo

Khóa luận tốt nghiệp này mang lại giá trị tham khảo chuyên môn hữu ích cho các đối tượng sau:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ sinh học, Dược học, Hóa dược và Thú y: Tài liệu cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về kỹ thuật chiết xuất đa dung môi, phương pháp xử lý cao chiết có hàm lượng lipid cao bằng DMSO, và phương pháp khuếch tán giếng thạch chuẩn hóa trên đĩa thạch.
• Nghiên cứu viên lĩnh vực Dược liệu và Hóa thực vật: Khóa luận cung cấp số liệu thực nghiệm đối chứng về sự biến đổi hoạt tính sinh học giữa dược liệu tươi thô và dược liệu qua chế biến nhiệt (sao thô), hỗ trợ định hướng quy trình chiết xuất và bảo quản các hợp chất thiên nhiên.
• Các phần nội dung có giá trị tham khảo cao nhất:
  • Quy trình loại bỏ dầu béo và hòa tan cao chiết trong dung môi DMSO (Mục 3.2.1).
  • Thử nghiệm kiểm chứng tính trơ sinh học của DMSO ở các dải pH và nồng độ khác nhau đối với sự phát triển của vi khuẩn (Mục 4.1.1).
  • Dữ liệu đối sánh đường kính vòng vô khuẩn của 6 hệ dung môi trên 9 chủng vi sinh vật trước và sau khi xử lý nhiệt (Mục 4.1).

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao tác giả sử dụng DMSO để hòa tan cao dược liệu và dung môi này có làm ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm vi sinh vật không?
Tác giả sử dụng DMSO (Dimethyl Sulfoxide) vì đây là dung môi có khả năng hòa tan rất tốt các hợp chất hữu cơ khó tan trong nước có trong cao chiết hạt bí ngô. Tác giả đã thực hiện thí nghiệm đối chứng âm với DMSO ở các nồng độ từ 10% đến 100% và dải pH từ 2 đến 13; kết quả cho thấy DMSO hoàn toàn không tạo vòng vô khuẩn và không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của 9 chủng vi khuẩn thử nghiệm, chứng minh hoạt tính ức chế vi khuẩn hoàn toàn bắt nguồn từ hoạt chất của dược liệu.

2. Dung môi nào cho hiệu quả chiết xuất hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính chống oxy hóa cao nhất trong nghiên cứu?
Dung môi ethanol 96% cho hiệu quả chiết xuất vượt trội nhất. Dịch chiết ethanol khi chưa qua xử lý nhiệt ức chế được toàn bộ 9/9 chủng vi khuẩn thử nghiệm (đạt đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là 16,54 ± 0,74 mm trên S. aureus ATCC 25923 tại nồng độ 2 g/ml). Đồng thời, sau khi xử lý nhiệt, dịch chiết ethanol cũng thể hiện hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH cao nhất, đạt giá trị tương đương 0,122 mg Vitamin E trên 100 mg dược liệu.

3. Quá trình xử lý nhiệt (sao thô ở 100–160°C trong 20 phút) tác động như thế nào đến khả năng kháng khuẩn của hạt bí ngô?
Quá trình xử lý nhiệt làm suy giảm nghiêm trọng hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết hạt bí ngô: làm mất hoàn toàn khả năng ức chế đối với 4 chủng vi khuẩn Gram âm (E. coli các chủng, P. aeruginosa, Salmonella), và làm giảm rõ rệt đường kính vòng vô khuẩn trên 5 chủng vi khuẩn Gram dương còn lại (vòng vô khuẩn lớn nhất sau nhiệt chỉ đạt 6,58 mm trên B. subtilis với dịch chiết aceton ở nồng độ 2 g/ml).

4. Nguyên nhân nào khiến tác giả chưa xác định được hàm lượng polyphenol tổng số trong khóa luận này?
Theo trình bày trong tóm tắt và thảo luận của khóa luận, phương pháp phân tích sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu chưa tương thích với nền mẫu cao chiết hạt bí ngô trong điều kiện thực nghiệm của đề tài (do hàm lượng chất béo cao hoặc nồng độ hoạt chất chưa đạt ngưỡng phát hiện tối ưu của quy trình đo quang), dẫn đến việc chưa xác định được số liệu định lượng polyphenol tổng số.

5. Hoạt tính chống oxy hóa của hạt bí ngô có biểu hiện như thế nào trước và sau khi xử lý nhiệt?
Ở mẫu hạt bí ngô chưa qua xử lý nhiệt (nồng độ 200 mg/ml), dịch chiết không làm đổi màu thuốc thử DPPH (không biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt). Tuy nhiên, sau khi được xử lý nhiệt bằng phương pháp sao thô, các dịch chiết làm đổi màu thuốc thử DPPH rõ rệt, trong đó dịch chiết ethanol đạt hoạt tính cao nhất với 0,122 mg Vitamin E tương đương / 100 mg dược liệu.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thị Phương Oanh đã thực hiện khảo sát toàn diện tác dụng kháng khuẩn, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của hạt bí ngô (Cucurbita moschata Duchesne) chiết xuất qua 6 hệ dung môi khác nhau. Kết quả thực nghiệm khẳng định dịch chiết ethanol 96% có hiệu quả ức chế vi khuẩn rộng nhất trên cả 9 chủng vi khuẩn thử nghiệm và mang lại hoạt tính chống oxy hóa DPPH cao nhất sau khi sao thô. Công trình cũng chỉ ra rằng quá trình sao thô ở nhiệt độ 100–160°C làm triệt tiêu hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng vi khuẩn Gram âm nhưng lại kích hoạt khả năng chống oxy hóa của dược liệu. Đây là tài liệu thực nghiệm có giá trị tham khảo khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng và chế biến các chế phẩm sinh học từ hạt bí ngô.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ngày nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật đang ngày càng được ưa chuộng. Theo tổ chức Thực vật Quốc tế (FBI, 2014), trên thế giới đã phát hiện được 265.000 loài thực vật, chứa khoảng 5 triệu hợp chất hoá học. Trong số đó có ít nhất 6.000 loài được dùng làm thuốc. Cho tới nay đã có khoảng 1.300 cây được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và mang lại giá trị to lớn.

Tuy nhiên, nó chỉ chiếm 0,5% so với số lượng các loài thực vật sẵn có. Để đáp ứng nhu cầu và xu thế của thị trường, việc tìm ra các hoạt chất mới có nguồn gốc từ thực vật là vấn đề cấp thiết đặt ra cho các nhà nghiên cứu. Đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về các hoạt chất trong thảo dược chứng minh được hiệu quả đối với các vi khuẩn như: các hợp chất phenolic có trong cây hương thảo như carnosol, axit carnosoic, rosmanol, rosmadial, epirosmanol, rosmadiphenol, axit rosmarinic. có khả năng chống oxy hoá (B.

Bozin và cộng sự, 2007)), tinh dầu hương thảo có thể chống lại tất cả các chủng vi khuẩn gram âm (đặc biệt là E. coli) và một số chủng gram dương (O. Celiktas và cộng sự, 2007); allicin có trong tỏi có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn, trị bệnh sán lãi, giun kim, một số bệnh nấm ngoài da (Sarkar và cộng sự, 2006); flavonoid trong hành tây giúp kích thích sản xuất các chất chống oxy hóa, do đó có đặc tính kháng khuẩn và tăng cường miễn dịch mạnh mẽ (suckhoedoisong.vn); rau diếp cá chứa decanoyl-acetaldehyd có tác dụng kháng khuẩn như: ức chế tụ cầu vàng, phế cầu, liên cầu, E. coli, trực khuẩn bạch hầu gây các bệnh lý nhiễm khuẩn nguy hiểm,… (Phạm Ngọc Khôi và Phùng Thanh Sơn, 2017), dân gian thường dùng để thanh nhiệt, giải độc, kháng viêm, tăng cường sức đề kháng của cơ thể.

Sử dụng các loại thảo dược có tác dụng kháng khuẩn thay thế thuốc kháng sinh là sự lựa chọn thông minh vì chúng có nguồn gốc từ thiên nhiên và giúp hạn chế hiện tượng kháng kháng sinh. Theo đó, nó 1 liên quan tới một loạt các lợi ích như: sẵn có trong tự nhiên, dễ phân huỷ sinh học, ít tác dụng phụ, hạn chế việc ảnh hưởng tới môi trường, an toàn vệ sinh cho người và vật nuôi, mang lại các lợi ích kinh tế,… Một số nghiên cứu khoa học hiện đại đã chứng minh rằng cơ thể động vật hay con người thường lưu giữ các hợp chất có tính chống oxy hóa cao như gluthathione, vitamin E, vitamin C,. Khi hàm lượng các chất chống oxy hóa trong cơ thể giảm xuống sẽ làm tăng nguy cơ hủy hoại các tế bào. Tuy nhiên, những ảnh hưởng bất lợi của các tác nhân có liên quan đến gây chết tế bào này có thể được ngăn ngừa bằng cách bổ sung chế độ ăn giàu thực phẩm có chứa chất chống oxy hóa (các loại đậu, rau và trái cây tươi.) với tác dụng có lợi cho sức khỏe con người.

Các chất chống oxy hóa tự nhiên như các hợp chất polyphenol có khả năng loại bỏ gốc tự do, ngăn chặn quá trình oxy hóa rất hiệu quả. Ngoài ra, so với việc sử dụng các chất chống oxy hóa tổng hợp, các hợp chất chiết suất từ tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa còn mang lại lợi ích an toàn, không gây tác dụng phụ không mong muốn, không độc hại đến môi trường cũng như con người và có thể được sử dụng trong y học, thực phẩm, dược phẩm. Với những ưu điểm trên, các sản phẩm được chiết xuất từ thảo dược thiên nhiên ngày càng khẳng định được vị thế của nó - là sự lựa chọn hàng đầu vì sự an toàn sức khoẻ.