Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn

Cây hoa hòe (Sophora japonica L. hay Styphnolobium japonicum L. Schott, họ Đậu - Fabaceae) là dược liệu phổ biến tại Việt Nam, đặc biệt ở các tỉnh phía Bắc (như Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình...) và Tây Nguyên. Thành phần hóa học chính trong nụ hoa hòe là rutin, chiếm tỷ lệ từ 6% đến 30% (ở Việt Nam có thể chiết xuất đạt tới 34%). Rutin sở hữu nhiều tác dụng dược lý giá trị như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm, bảo vệ thành mạch và hạ lipid máu. Tuy nhiên, do cấu trúc chứa nhiều gốc glycosid cồng kềnh, hoạt tính chống viêm và chống oxy hóa của rutin yếu hơn đáng kể so với dạng aglycon là quercetin. Các công nghệ bán tổng hợp và enzyme gần đây đã cho phép chuyển hóa rutin thành quercetin với hiệu suất cao trên 90%.

Quercetin (2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one) là một polyphenol thuộc phân nhóm flavonol có hoạt tính sinh học đa dạng: chống oxy hóa mạnh (nhờ 5 nhóm phenolic hydroxyl ở vị trí 3, 3', 4', 5, 7), dọn gốc tự do, chống viêm, hạ huyết áp, bảo vệ tim mạch, bảo vệ gan và ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) – một đích tác dụng quan trọng trong điều trị suy giảm nhận thức và bệnh Alzheimer.

Mặc dù có tiềm năng dược lý lớn, quercetin được xếp vào Nhóm II trong Hệ thống Phân loại Sinh dược học (BCS) với đặc tính thấm tốt nhưng độ tan trong nước rất kém (chỉ khoảng 0,01 mg/mL ở điều kiện thường), kém bền vững (nhạy cảm với pH, nhiệt độ, ion kim loại) và bị chuyển hóa qua gan nhanh, dẫn đến sinh khả dụng (SKD) đường uống rất thấp. Để giải quyết rào cản sinh dược học này, công nghệ phytosome – tạo phức hợp giữa hoạt chất thực vật và phospholipid (chủ yếu là phosphatidylcholin - PC) ở mức độ phân tử thông qua liên kết hydro – là giải pháp tối ưu giúp hình thành cấu trúc lưỡng tính (vừa tan trong nước vừa tan trong lipid), tăng cường tính thấm qua màng biểu mô ruột và cải thiện độ ổn định mà không đòi hỏi thiết bị phức tạp. Mặt khác, các chế phẩm chứa hoạt chất hướng thần/chống thoái hóa thần kinh trên thị trường hiện nay phần lớn nhập khẩu nguyên liệu từ nước ngoài (như cao bạch quả - CBQ) với giá thành cao. Nghiên cứu bào chế phytosome từ cao hoa hòe giàu quercetin mở ra hướng phát triển nguồn nguyên liệu dược phẩm chuẩn hóa nội địa.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Đề tài xác định 2 mục tiêu và 4 nội dung nghiên cứu cụ thể:

  1. Mục tiêu 1: Bào chế và đánh giá được một số đặc tính lý hóa của phytosome cao hòe giàu quercetin.
  2. Mục tiêu 2: Đánh giá được tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym acetylcholinesterase của phytosome cao hòe giàu quercetin in vitro.

Hệ thống 4 nội dung nghiên cứu:

  • Nội dung 1: Thẩm định phương pháp định lượng các flavonoid (rutin, quercetin, kaempferol, isorhamnetin) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  • Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình bào chế phytosome cao hòe giàu quercetin (khảo sát tỷ lệ mol, nhiệt độ và thời gian phản ứng).
  • Nội dung 3: Đánh giá đặc tính lý hóa của hệ phytosome thu được (kích thước tiểu phân, chỉ số PDI, thế Zeta, hiệu suất phytosome hóa, độ tan bão hòa, hệ số phân bố dầu-nước logD, tương tác phân tử qua FTIR, DSC, XRD).
  • Nội dung 4: Đánh giá tác dụng dược lý in vitro (hoạt tính dọn gốc tự do DPPH và hoạt tính ức chế enzym AChE so sánh với chất chuẩn, cao nguyên liệu và cao bạch quả).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu chính: Cao hoa hòe giàu quercetin được điều chế tại Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm – Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN (hàm lượng: quercetin 94,06%; rutin 0,56%; kaempferol 1,05%; isorhamnetin 5,22%).
  • Đối tượng đối chứng/so sánh: Quercetin chuẩn (độ tinh khiết 95%), Rutin chuẩn (98%), Kaempferol chuẩn (98%), Isorhamnetin chuẩn (98%), Cao bạch quả (chứa 23,6% flavonoid, 7,2% terpene lactones, 2,7% bilobalid, 4,5% tổng ginkgolide A, B, C) và chất ức chế chuẩn Donepezil HCl.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội; hoàn thành và nghiệm thu vào tháng 5 năm 2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình nghiên cứu

  • Cơ sở cấu trúc và sinh dược học của Quercetin: Phân tử C15H10O7 (khối lượng mol 302,23 g/mol), cấu trúc diphenylpropan C6-C3-C6 với 5 nhóm -OH phenolic và liên kết đôi tại vòng pyron trung tâm; phân ly theo 5 nấc pKa (pKa1 = 7,17; pKa2 = 8,26; pKa3 = 10,13; pKa4 = 12,30; pKa5 = 13,11). Dược chất ít tan trong nước lạnh, độ tan tăng nhẹ theo nhiệt độ và pH kiềm (tạo muối phenolat).
  • Lý thuyết hệ phân tán Phytosome: Phức hợp tạo thành từ phản ứng giữa nhóm đầu phân cực chứa nguyên tử có độ âm điện cao của phosphatidylcholin (nhóm phosphat mang điện âm hoặc amoni mang điện dương) với các hydro hoạt động (nhóm -OH tự do) của quercetin trong dung môi không phân cực hoặc phân cực bay hơi (ethanol). Phân tử phospholipid bao bọc hoạt chất tạo thành tiểu phân có phần đầu thân nước hướng ngoài và đuôi hydrocarbon thân dầu, giúp phân tử dễ dàng vượt qua lớp kép lipid màng tế bào.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
    • Thiết bị: Agilent Infinity 1260, Detector UV tại bước sóng 360 nm.
    • Cột sắc ký: Pha đảo Agilent C18 (4,6 x 250 mm; kích thước hạt 5 µm).
    • Pha động: Methanol (kênh A) và dung dịch acid formic 0,1% trong nước tinh khiết (kênh B) theo tỷ lệ 45:55 (v/v), chế độ đẳng dòng.
    • Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút; Thể tích tiêm mẫu: 10 µL; Nhiệt độ cột: 25 ± 0,5 °C; Thời gian phân tích: 20 phút.
    • Thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V: đánh giá tính tương hợp hệ thống (n=6), tính đặc hiệu, độ tuyến tính (khoảng 10 - 200 µg/mL), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) theo tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N).
  • Phương pháp bào chế Phytosome: Bốc hơi dung môi (Solvent Evaporation Method). Hòa tan cao hoa hòe giàu quercetin và PC trong 150 mL ethanol tuyệt đối, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm, đun hồi lưu có khuấy từ trong bình cầu 500 mL ở các điều kiện khảo sát (tỷ lệ mol 1:2, 1:1, 2:1; nhiệt độ 25 - 80 °C; thời gian 8 - 18 giờ), sau đó loại dung môi bằng hệ thống cô quay chân không Buchi R-210.
  • Phương pháp đánh giá đặc tính lý hóa:
    • Kích thước tiểu phân (KTTP), Chỉ số đa phân tán (PDI) và Thế Zeta: Đo bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) trên thiết bị Horiba Scientific nano partica SZ-100 sau khi hydrat hóa mẫu trong nước cất.
    • Hiệu suất phytosome hóa (EE%): Xác định quercetin tự do không liên kết bằng cách lọc qua giấy lọc Whatman sau hydrat hóa ở 50 °C trong 1 giờ và định lượng phần phức hợp bằng HPLC.
    • Độ tan bão hòa: Lắc cân bằng lượng dư phytosome và cao nguyên liệu trong 30 mL nước cất, đệm HCl pH 1,2, đệm phosphat pH 4,5 và pH 6,8 trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng, ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút, lọc màng 0,45 µm và định lượng qua HPLC.
    • Hệ số phân bố n-octanol/nước (logD): Phương pháp bình lắc (shake-flask method) ở 25 °C trong các môi trường pH 1,2; 4,5; 6,8.
    • Tương tác phân tử: Đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) trên máy Agilent Cary 630 (dải sóng 4000 - 600 cm⁻¹); Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) trên máy PT1000 LINSEIS (gia nhiệt 40 - 250 °C, tốc độ 10 °C/phút, khí bảo vệ Argon 40 mL/phút); Nhiễu xạ tia X bột (XRD) trên máy Bruker D8 Advance (quét góc 2θ từ 0,02° đến 60°, bước nhảy 0,02°, nguồn Cu-Kα).
  • Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học in vitro:
    • Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH: Phản ứng giữa 20 µL dịch mẫu với 180 µL dung dịch DPPH 0,1 mM trong methanol, ủ 30 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng, đo mật độ quang ở bước sóng 517 nm trên máy đọc phiến Epoch 2.
    • Thử nghiệm ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE): Phương pháp đo quang Ellman (1961) trên phiến 96 giếng; cơ chất acetylthiocholin iodid (ACTI), thuốc thử tạo màu DTNB (acid 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic) và enzym AChE 0,25 IU/mL trong đệm phosphat pH 7,5 chứa 1% DMSO, đo động học mật độ quang ở bước sóng 412 nm liên tục 10 phút (1 phút/lần).
  • Phương pháp xử lý số liệu: Thống kê mô tả bằng Microsoft Excel 2016 (trình bày dạng Trung bình ± Độ lệch chuẩn, TB ± SD, n=3). Tính toán giá trị IC50 và khoảng tin cậy 95% bằng mô hình hồi quy phi tuyến tính sigmoid trên phần mềm GraphPad Prism 9.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu và Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan hệ thống hóa các tư liệu khoa học về cây hoa hòe, dược chất quercetin và công nghệ phân phối thuốc phytosome:

  • Thực vật học và hóa học hoa hòe: Tổng hợp các đặc điểm thực vật phân biệt giữa hòe nếp và hòe tẻ, chu kỳ thu hái (tháng 5 - 10), quy trình chế biến sao vàng/sao cháy và thành phần hóa học (phân lập hơn 153 hợp chất, trong đó rutin phân bố ở nụ hoa 6-30%, lá 4,7%, vỏ quả 4,3%, hạt 0,5%).
  • Dược lý học và dược động học của Quercetin: Phân tích cơ chế chống oxy hóa dựa trên nhóm phenolic hydroxyl vòng B và nhóm 3-OH vòng C; cơ chế ức chế các cytokin tiền viêm (TNF-α, IL-8), enzym COX, LOX, phức hợp TLR4/MyD88/PI3K; tác dụng hạ huyết áp, bảo vệ gan và ức chế enzym acetylcholinesterase liên quan đến bệnh thoái hóa thần kinh Alzheimer. Nêu rõ nguyên nhân sinh khả dụng thấp: độ tan trong nước chỉ 0,01 mg/mL, thời gian bán thải ngắn (t1/2 ~ 3,5 giờ), chuyển hóa nhanh qua phản ứng liên hợp glucuronic/sulfat ở gan và ruột.
  • Hệ phân tán Phytosome: Phân tích ưu điểm vượt trội của phytosome so với cao chiết thông thường và liposome (tính ổn định cao hơn, hình thành liên kết phân tử 1:1 hoặc 1:2 giữa polyphenol và phospholipid, tăng tính thấm qua màng ruột và màng sinh học). Tổng quan các công trình nghiên cứu phytosome quercetin, rutin, curcumin, naringenin và cao bạch quả trong nước và quốc tế.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ hóa chất, tá dược, thiết bị phân tích và quy trình thực nghiệm:

  • Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào: Cao hoa hòe giàu quercetin (chuẩn cơ sở TCCS), các chất chuẩn phân tích (đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất từ ChemFaces và Viện Kiểm nghiệm ATVSTPQG), phospholipid đậu nành, enzym AChE, cơ chất ACTI, chỉ thị DTNB và chất ức chế chuẩn Donepezil HCl (Sigma Aldrich).
  • Chi tiết hóa điều kiện chạy HPLC và phương pháp xử lý mẫu cao chiết, mẫu phytosome, phương pháp lắc n-octanol/nước, quy trình phân tích nhiệt vi sai DSC, nhiễu xạ tia X và phổ hồng ngoại FTIR.
  • Thiết lập quy trình vi định lượng quang phổ đánh giá hoạt tính chống oxy hóa DPPH và hoạt tính kháng enzym AChE trên microplate 96 giếng.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

1. Kết quả thẩm định quy trình định lượng HPLC

Phương pháp HPLC pha đảo thể hiện độ tin cậy cao qua các thông số thẩm định:

  • Tính tương hợp hệ thống (n=6): Thời gian lưu trung bình của rutin (4,343 phút), quercetin (9,007 phút), kaempferol (14,784 phút), isorhamnetin (16,151 phút) đều có RSD < 1%; diện tích pic có RSD từ 0,915% đến 1,85% (đạt yêu cầu < 2%).
  • Tính đặc hiệu: Mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu tại thời gian lưu của 4 chất phân tích; sắc ký đồ mẫu thử tách biệt rõ ràng, không có hiện tượng chồng pic.
  • Tính tuyến tính: Hệ số tương quan R² đều đạt ≥ 0,9998 trong khoảng nồng độ khảo sát 10 - 200 µg/mL.
  • Giới hạn phát hiện và định lượng: Rutin có LOD = 0,15 µg/mL, LOQ = 0,5 µg/mL; Quercetin, Kaempferol và Isorhamnetin đều đạt LOD = 0,075 µg/mL, LOQ = 0,25 µg/mL.
Hợp chất Thời gian lưu (phút) RSD thời gian lưu (%) RSD diện tích pic (%) LOD (µg/mL) LOQ (µg/mL)
Rutin 4,343 0,04 1,59 0,150 0,500
Quercetin 9,007 0,05 0,915 0,075 0,250
Kaempferol 14,784 0,16 1,52 0,075 0,250
Isorhamnetin 16,151 0,18 1,85 0,075 0,250

2. Kết quả tối ưu hóa công thức và quy trình bào chế phytosome

Quá trình khảo sát đơn yếu tố các thông số công nghệ thu được kết quả như sau:

  • Khảo sát tỷ lệ mol Quercetin : PC (ở 25 °C, thời gian 8 giờ): Tỷ lệ mol 1:1 cho hiệu suất phytosome hóa cao nhất (72,56 ± 1,78%), thế Zeta âm lớn (-73,1 ± 0,23 mV) và chỉ số đa phân tán PDI tối ưu (0,648 ± 0,02). Tỷ lệ thừa quercetin (2:1) làm giảm mạnh hiệu suất tạo phức xuống 52,77 ± 2,32%.
  • Khảo sát nhiệt độ phản ứng (tỷ lệ mol 1:1, thời gian 8 giờ): Khi nâng nhiệt độ từ 25 °C lên 40 °C, hiệu suất phytosome hóa tăng vọt từ 72,56% lên 96,86 ± 1,26%, đồng thời kích thước tiểu phân giảm mạnh từ 1665,7 nm xuống 892,47 ± 3,45 nm. Tăng nhiệt độ lên 60 °C và 80 °C làm tăng KTTP (lên 1429,7 nm ở 80 °C) do nhiệt độ cao làm suy yếu liên kết hydro giữa PC và quercetin. Nhiệt độ tối ưu được chọn là 40 °C.
  • Khảo sát thời gian phản ứng (tỷ lệ mol 1:1, nhiệt độ 40 °C): Phản ứng ở 8 giờ đạt hiệu suất phytosome hóa cao nhất (96,86 ± 1,26%), PDI = 0,682, thế Zeta = -62,2 mV. Kéo dài thời gian lên 12 giờ và 18 giờ làm giảm nhẹ hiệu suất tạo phức (còn 90,73% và 87,85%). Do đó, thời gian 8 giờ được lựa chọn nhằm tối ưu hóa năng suất và tiết kiệm năng lượng.
Thông số khảo sát Điều kiện KTTP (nm) PDI Thế Zeta (mV) Hiệu suất EE (%)
Tỷ lệ mol (ở 25 °C, 8h) 1:2 1238,3 ± 6,21 0,684 ± 0,03 -48,1 ± 0,42 70,37 ± 1,23
1:1 (chọn) 1665,7 ± 8,42 0,648 ± 0,02 -73,1 ± 0,23 72,56 ± 1,78
2:1 1242,7 ± 5,45 0,686 ± 0,06 -62,1 ± 0,32 52,77 ± 2,32
Nhiệt độ (tỷ lệ 1:1, 8h) 25 °C 1665,7 ± 8,42 0,648 ± 0,02 -73,1 ± 0,23 72,56 ± 2,32
40 °C (chọn) 892,47 ± 3,45 0,682 ± 0,03 -62,2 ± 0,45 96,86 ± 1,26
60 °C 1112,1 ± 5,23 0,570 ± 0,01 -48,5 ± 0,57 92,94 ± 1,63
80 °C 1429,7 ± 2,33 0,744 ± 0,04 -54,3 ± 0,68 91,93 ± 2,31
Thời gian (tỷ lệ 1:1, 40 °C) 8 giờ (chọn) 892,47 ± 3,45 0,682 ± 0,03 -62,2 ± 0,45 96,86 ± 1,26
12 giờ 689,70 ± 8,23 0,624 ± 0,02 -73,9 ± 0,78 90,73 ± 2,18
18 giờ 713,17 ± 9,84 0,569 ± 0,05 -92,3 ± 0,93 87,85 ± 1,72

3. Kết quả đánh giá đặc tính lý hóa và cấu trúc phân tử

  • Độ tan bão hòa: Phytosome cao hòe làm tăng độ tan của quercetin vượt trội trong mọi môi trường thử nghiệm so với cao hòe nguyên liệu:
    • Trong nước cất: tăng từ 0,47 ± 0,09 mg/mL lên 1,44 ± 0,07 mg/mL (gấp ~3,06 lần).
    • Trong môi trường dạ dày giả định (HCl pH 1,2): tăng từ 0,55 ± 0,06 mg/mL lên 0,80 ± 0,09 mg/mL (gấp 1,45 lần).
    • Trong môi trường đệm pH 4,5: tăng từ 0,57 ± 0,07 mg/mL lên 1,54 ± 0,03 mg/mL (gấp 2,70 lần).
    • Trong môi trường ruột non giả định (đệm pH 6,8): tăng từ 0,62 ± 0,05 mg/mL lên 1,58 ± 0,04 mg/mL (gấp 2,55 lần).
Môi trường thử nghiệm Cao hòe giàu Quercetin (mg/mL) Phytosome Quercetin (mg/mL) Mức độ tăng độ tan
Nước cất 0,47 ± 0,09 1,44 ± 0,07 ~ 3,06 lần
Dung dịch HCl pH 1,2 0,55 ± 0,06 0,80 ± 0,09 ~ 1,45 lần
Đệm phosphat pH 4,5 0,57 ± 0,07 1,54 ± 0,03 ~ 2,70 lần
Đệm phosphat pH 6,8 0,62 ± 0,05 1,58 ± 0,04 ~ 2,55 lần
  • Hệ số phân bố logD: Hệ số phân bố n-octanol/nước của quercetin trong cấu trúc phytosome được duy trì ở mức thuận lợi cho hấp thu sinh học qua đường tiêu hóa (khoảng logD từ 1 đến 3), phản ánh tính chất lưỡng tính được cải thiện rõ rệt.
  • Phân tích cấu trúc tương tác:
    • Phổ FTIR: Phổ của phytosome cho thấy sự dịch chuyển và biến đổi cường độ của các vân hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxyl (-OH phenolic ở vùng 3400 - 3200 cm⁻¹) và nhóm carbonyl (C=O ở vùng 1650 cm⁻¹) của quercetin, đồng thời có sự biến thiên của dải hấp thụ liên kết P=O và P-O-C của phosphatidylcholin, chứng minh sự hình thành liên kết hydro liên phân tử.
    • Giản đồ DSC: Quercetin nguyên liệu thể hiện một pic thu nhiệt sắc nhọn đặc trưng cho nhiệt độ nóng chảy tinh thể ở khoảng trên 300 °C. Trong giản đồ phytosome, pic nóng chảy tinh thể này biến mất hoàn toàn, thay thế bằng điểm chuyển pha nhiệt mới của phức hợp, khẳng định hoạt chất không còn ở trạng thái tinh thể tự do.
    • Giản đồ XRD: Giản đồ nhiễu xạ tia X của cao hòe nguyên liệu và hỗn hợp vật lý xuất hiện nhiều pic nhiễu xạ hẹp, nhọn với cường độ cao (đặc trưng cho cấu trúc kết tinh cao). Ngược lại, giản đồ XRD của phytosome chuyển thành đường cong dạng vô định hình (amorphous broad halo), chứng minh quercetin đã được phân tán phân tử hoàn toàn vào giá mang phospholipid.

4. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học in vitro

  • Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH: Cả quercetin chuẩn, cao hòe giàu quercetin và phytosome cao hòe đều thể hiện khả năng quét gốc tự do phụ thuộc nồng độ. Hệ phytosome duy trì hoạt tính chống oxy hóa tương đương với quercetin tự do và vượt trội hơn so với cao bạch quả thương mại ở cùng mức nồng độ flavonoid thử nghiệm.
  • Hoạt tính ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE): Phức hợp phytosome cao hòe ức chế hoạt độ enzym AChE theo cơ chế phụ thuộc nồng độ, chứng minh tiềm năng ứng dụng trong hỗ trợ và điều trị các rối loạn thoái hóa thần kinh tương tự như cao bạch quả và chất chuẩn Donepezil HCl (mặc dù hoạt lực đối chứng dương tổng hợp Donepezil mạnh hơn).

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  • Đã thẩm định thành công quy trình định lượng đồng thời 4 flavonoid chính (rutin, quercetin, kaempferol, isorhamnetin) bằng HPLC pha đảo với độ đặc hiệu cao, độ lặp lại tốt (RSD < 2%) và khoảng tuyến tính rộng (10 - 200 µg/mL).
  • Đã xác lập bộ thông số công nghệ tối ưu để bào chế phytosome cao hòe giàu quercetin bằng phương pháp bốc hơi dung môi:
    • Tỷ lệ mol Quercetin : PC = 1:1.
    • Dung môi phản ứng: Ethanol tuyệt đối.
    • Nhiệt độ phản ứng: 40 °C.
    • Thời gian đun hồi lưu: 8 giờ.
  • Hệ phytosome thu được có các chỉ số chất lượng cao: Kích thước tiểu phân 892,47 ± 3,45 nm; PDI = 0,682 ± 0,03; Thế Zeta = -62,2 ± 0,45 mV; Hiệu suất phytosome hóa đạt tới 96,86 ± 1,26%.
  • Cải thiện đáng kể độ tan bão hòa của quercetin: tăng gấp 3,06 lần trong nước cất và 2,55 lần trong đệm pH 6,8; chuyển hóa hoàn toàn hoạt chất từ dạng kết tinh sang dạng vô định hình gắn kết phân tử với lipid.
  • Chứng minh hệ phytosome bảo tồn và phát huy tốt tác dụng chống oxy hóa (dọn gốc tự do DPPH) và hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro.

Giải pháp và đề xuất ứng dụng

  • Ứng dụng quy trình bốc hơi dung môi sử dụng ethanol tuyệt đối – dung môi an toàn, thân thiện với môi trường và ít tồn dư độc hại hơn so với dicloromethan hay chloroform – làm quy trình chuẩn để chế tạo nguyên liệu phytosome quy mô phòng thí nghiệm.
  • Đề xuất sử dụng phytosome cao hoa hòe giàu quercetin làm hoạt chất thay thế hoặc phối hợp trong các dạng thuốc rắn (viên nang cứng, viên nén) hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe hướng tới phòng ngừa suy giảm trí nhớ, tai biến mạch máu não và bệnh Alzheimer.

Đóng góp mới của tác giả

  • Là một trong những công trình tiên phong tại Việt Nam nghiên cứu toàn diện từ khâu xây dựng công thức, tối ưu hóa thông số công nghệ đến đánh giá cấu trúc lý hóa sâu (FTIR, DSC, XRD) và tác dụng dược lý kép (chống oxy hóa và ức chế enzym AChE) của phytosome điều chế từ cao hoa hòe giàu quercetin nội địa (thay vì sử dụng quercetin tinh khiết ngoại nhập).
  • Đưa ra bằng chứng khoa học thực nghiệm so sánh đối chiếu trực tiếp giữa phytosome cao hòe và cao bạch quả (nguyên liệu ngoại nhập đắt tiền), tạo cơ sở vững chắc cho việc nâng cao giá trị chuỗi dược liệu hoa hòe Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở quy trình bào chế gián đoạn quy mô phòng thí nghiệm với thể tích nhỏ (150 mL dung môi), chưa khảo sát độ ổn định dài hạn của phức hợp phytosome theo thời gian bảo quản (độ bền ẩm, quá trình oxy hóa phospholipid).
  • Kích thước tiểu phân của hệ phytosome sau hydrat hóa vẫn ở mức cận vi mô (~892 nm), chưa áp dụng các kỹ thuật thu nhỏ kích thước chuyên sâu (đồng hóa áp suất cao hoặc siêu âm đầu dò kéo dài).
  • Các thử nghiệm dược lý mới chỉ thực hiện ở mức độ in vitro (trên phiến 96 giếng với DPPH và enzym AChE tinh chế), chưa tiến hành đánh giá sinh khả dụng in vivo và thử nghiệm tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình động vật thực nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Khảo sát bổ sung các phương pháp thu nhỏ kích thước tiểu phân xuống dưới 200 - 300 nm (kích thước nano) để tối ưu hóa khả năng hấp thu qua màng ruột.
  • Nghiên cứu kỹ thuật sấy phun hoặc đông khô có bổ sung chất bảo vệ màng sinh học để chuyển hỗn dịch phytosome thành dạng bột khô ổn định, phục vụ dập viên nén hoặc đóng nang cứng.
  • Đánh giá độ ổn định của phức hợp theo tiêu chuẩn ICH (ở điều kiện thường và lão hóa cấp tốc).
  • Tiến hành thử nghiệm dược động học so sánh sinh khả dụng (in vivo) và đánh giá hiệu quả điều trị trên mô hình suy giảm nhận thức/Alzheimer gây bởi scopolamin hoặc LPS trên chuột.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng hưởng lợi:
    • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Dược học, Công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc đang tìm hiểu về hệ phân phối thuốc hướng cấu trúc nano/phytosome.
    • Các nhà nghiên cứu Hóa thực vật và Dược liệu quan tâm đến kỹ thuật bán tổng hợp và nâng cao giá trị hoạt chất polyphenol/flavonoid từ nguồn dược liệu trong nước.
    • Các doanh nghiệp và phòng R&D dược phẩm định hướng phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khỏe tuần hoàn não, chống lão hóa và hỗ trợ điều trị Alzheimer từ hoa hòe Việt Nam.
  • Nội dung có giá trị tham khảo cao nhất:
    • Quy trình thẩm định định lượng đồng thời 4 flavonoid bằng HPLC pha đảo theo Dược điển Việt Nam V.
    • Bộ thông số thực nghiệm tối ưu hóa phản ứng tạo phức phospholipid - polyphenol bằng phương pháp bốc hơi dung môi với ethanol.
    • Phương pháp phân tích và đối chiếu phổ tương tác liên phân tử (FTIR, DSC, XRD) phục vụ chứng minh sự tạo phức phân tử.
    • Quy trình vi định lượng đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase theo phương pháp Ellman trên microplate 96 giếng.

Câu hỏi thường gặp

1. Thành phần của cao hoa hòe giàu quercetin sử dụng trong nghiên cứu gồm những gì?

Theo số liệu phân tích định lượng bằng HPLC, cao hoa hòe giàu quercetin do Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm (Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN) cung cấp có thành phần gồm: quercetin 94,06%, rutin 0,56%, kaempferol 1,05% và isorhamnetin 5,22%. Do quercetin chiếm tỷ lệ áp đảo, các tính toán tỷ lệ mol và đánh giá đặc tính của hệ phytosome đều được quy đổi tính theo hoạt chất chính là quercetin.

2. Điều kiện tối ưu để bào chế phytosome cao hoa hòe giàu quercetin là gì?

Qua khảo sát thực nghiệm đơn yếu tố, các điều kiện tối ưu được xác định gồm:

  • Tỷ lệ mol Quercetin : Phosphatidylcholin = 1:1.
  • Dung môi phản ứng: Ethanol tuyệt đối (150 mL).
  • Nhiệt độ phản ứng: 40 °C.
  • Thời gian đun hồi lưu: 8 giờ.
  • Loại dung môi: Bốc hơi dưới áp suất giảm trên thiết bị cô quay chân không.

3. Kích thước tiểu phân, thế Zeta và hiệu suất tạo phức của hệ phytosome tối ưu đạt bao nhiêu?

Ở điều kiện tối ưu (tỷ lệ mol 1:1, 40 °C, 8 giờ), hệ phytosome đạt:

  • Kích thước tiểu phân trung bình: 892,47 ± 3,45 nm.
  • Chỉ số đa phân tán PDI: 0,682 ± 0,03.
  • Thế Zeta: -62,2 ± 0,45 mV (đảm bảo độ ổn định tĩnh điện học cao nhờ lực đẩy giữa các tiểu phân mang điện âm).
  • Hiệu suất phytosome hóa (EE%): 96,86 ± 1,26%.

4. Độ tan của quercetin trong phytosome thay đổi như thế nào so với cao nguyên liệu?

Độ tan của quercetin trong phytosome tăng rõ rệt ở tất cả các môi trường khảo sát:

  • Trong nước cất: đạt 1,44 ± 0,07 mg/mL (tăng gấp 3,06 lần so với mức 0,47 mg/mL của cao nguyên liệu).
  • Trong dung dịch HCl pH 1,2: đạt 0,80 ± 0,09 mg/mL (tăng gấp 1,45 lần so với 0,55 mg/mL).
  • Trong đệm phosphat pH 4,5: đạt 1,54 ± 0,03 mg/mL (tăng gấp 2,70 lần so với 0,57 mg/mL).
  • Trong đệm phosphat pH 6,8: đạt 1,58 ± 0,04 mg/mL (tăng gấp 2,55 lần so với 0,62 mg/mL).

5. Dữ liệu phổ nào chứng minh quercetin đã tạo phức hợp phân tử với phospholipid chứ không phải hỗn hợp cơ học?

Sự hình thành phức hợp được khẳng định thông qua 3 kỹ thuật phân tích:

  • FTIR: Nhận thấy sự dịch chuyển bước sóng và thay đổi cường độ của nhóm -OH phenolic (3400 - 3200 cm⁻¹) và C=O (1650 cm⁻¹) của quercetin cùng các nhóm phosphat (P=O, P-O-C) của phospholipid, chứng minh có liên kết hydro liên phân tử.
  • DSC: Pic thu nhiệt nóng chảy sắc nhọn của quercetin tinh thể (> 300 °C) biến mất hoàn toàn trên giản đồ phytosome, xuất hiện nhiệt độ chuyển pha mới.
  • XRD: Các pic nhiễu xạ sắc nhọn đặc trưng cho cấu trúc tinh thể của cao nguyên liệu và hỗn hợp vật lý hoàn toàn biến mất trên giản đồ phytosome, chỉ còn lại dải nhiễu xạ vô định hình rộng.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lâm Thị Thúy Hằng đã thực hiện thành công việc xây dựng quy trình bào chế phytosome từ cao hoa hòe giàu quercetin Việt Nam bằng phương pháp bốc hơi dung môi với các thông số tối ưu (tỷ lệ mol 1:1, 40 °C, 8 giờ trong ethanol), đạt hiệu suất tạo phức 96,86% và thế Zeta -62,2 mV. Dạng bào chế mới đã khắc phục hiệu quả rào cản sinh dược học của quercetin khi nâng cao độ tan trong nước lên hơn 3 lần và chuyển hóa hoàn toàn hoạt chất sang trạng thái phân tán vô định hình. Đồng thời, nghiên cứu đã chứng minh phytosome cao hòe duy trì hoạt tính chống oxy hóa mạnh và thể hiện tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase rõ rệt in vitro, khẳng định tiềm năng to lớn trong việc phát triển nguồn dược liệu hoa hòe trong nước thành các chế phẩm phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer thay thế nguyên liệu nhập khẩu.