Nghiên cứu so sánh hiệu quả của phương pháp Realtime PCR và ELISA trong chẩn đoán phát hiện nhiễm CMV tại Bệnh viện Nhi Thái Bình

Luận văn Thạc sĩ: So sánh Realtime PCR và ELISA chẩn đoán CMV tại Bệnh viện Nhi Thái Bình

• Tác giả: Nguyễn Duy Chúc
• Người hướng dẫn: TS. Phan Ngọc Quang
• Trường học: Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu so sánh hiệu quả của phương pháp Realtime PCR và ELISA trong chẩn đoán phát hiện nhiễm CMV tại Bệnh viện Nhi Thái Bình
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan về Realtime PCR và ELISA chẩn đoán CMV ở trẻ em

Cytomegalovirus (CMV) là tác nhân truyền nhiễm nguy hiểm ở trẻ nhỏ. Virus thuộc họ Herpesviridae. Nhiễm CMV bẩm sinh hoặc mắc phải gây tổn thương đa cơ quan nghiêm trọng. Trẻ có thể bị suy giảm thính lực, viêm phổi, viêm gan và chậm phát triển thần kinh. Bệnh viện Nhi Thái Bình tiếp nhận nhiều ca nghi nhiễm CMV mỗi năm. Chẩn đoán sớm đóng vai trò then chốt trong điều trị. Hiện nay, hai kỹ thuật chính được ứng dụng là Realtime PCR và ELISA. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể IgM và IgG trong huyết thanh. Xét nghiệm này phản ánh tình trạng đáp ứng miễn dịch của cơ thể bệnh nhi. Ngược lại, kỹ thuật Realtime PCR khuếch đại đoạn gen đích của CMV. Phương pháp này định lượng trực tiếp tải lượng DNA virus trong mẫu bệnh phẩm. Mỗi kỹ thuật mang ưu thế sinh học riêng biệt. ELISA phù hợp cho sàng lọc dịch tễ ban đầu. Realtime PCR mang lại độ nhạy vượt trội trong giai đoạn nhiễm trùng cấp. Hiểu rõ từng phương pháp giúp bác sĩ đưa ra quyết định xét nghiệm chính xác. Sự phối hợp hợp lý tối ưu hóa quá trình điều trị.

1.1. Đặc điểm sinh học và bệnh sinh của Cytomegalovirus

CMV chứa bộ gen DNA chuỗi kép kích thước lớn. Cấu trúc hạt virus gồm vỏ nhân capsid, lớp vỏ tegument và màng bọc lipid. Kháng nguyên pp65 và glycoprotein bề mặt kích thích phản ứng miễn dịch mạnh mẽ. Sau khi xâm nhập, CMV có khả năng tiềm ẩn suốt đời trong tế bào bạch cầu đơn nhân. Khi hệ miễn dịch của trẻ suy yếu, virus tái hoạt động dữ dội. Quá trình nhân lên làm tổn thương tế bào gan, biểu mô thận và hệ thần kinh trung ương. Bệnh nhi sơ sinh có nguy cơ cao gặp biến chứng bại não hoặc vàng da kéo dài. Hiểu rõ chu kỳ sinh học giúp lựa chọn mục tiêu xét nghiệm chuẩn xác.

1.2. Nhu cầu chẩn đoán CMV tại Bệnh viện Nhi Thái Bình

Bệnh viện Nhi Thái Bình tiếp nhận nhiều trường hợp trẻ em nhập viện với triệu chứng không điển hình. Các biểu hiện gồm sốt kéo dài, gan lách to và tăng men gan không rõ căn nguyên. Tỷ lệ nhiễm CMV lưu hành trong cộng đồng tương đối cao. Việc chẩn đoán dựa thuần túy vào lâm sàng thường dẫn đến nhầm lẫn với các bệnh nhiễm khuẩn khác. Khoa xét nghiệm cần các công cụ cận lâm sàng nhanh chóng và chuẩn xác. Xét nghiệm huyết thanh học và sinh học phân tử là yêu cầu cấp thiết. Điều này giúp phát hiện mầm bệnh ngay từ giai đoạn khởi phát. Chẩn đoán đúng giúp giảm chi phí điều trị và hạn chế di chứng cho trẻ.

II. Phân tích hạn chế của xét nghiệm ELISA chẩn đoán nhiễm CMV

Phương pháp ELISA là xét nghiệm miễn dịch gắn enzyme phổ biến. Kỹ thuật này phát hiện kháng thể IgM và IgG chống CMV trong huyết thanh. Tuy nhiên, việc áp dụng ELISA trên bệnh nhi gặp nhiều trở ngại khách quan. Trẻ dưới sáu tháng tuổi mang lượng lớn kháng thể IgG truyền từ người mẹ qua nhau thai. Kháng thể này tồn tại kéo dài trong máu trẻ sơ sinh. Do đó, kết quả IgG dương tính không phản ánh chính xác tình trạng nhiễm virus cấp tính của trẻ. Ngoài ra, hệ thống miễn dịch của trẻ nhỏ chưa hoàn thiện. Trẻ sơ sinh thường đáp ứng tạo kháng thể IgM rất kém hoặc muộn màng. Hiện tượng âm tính giả xảy ra thường xuyên ở giai đoạn đầu của bệnh. Nguy cơ dương tính giả cũng xuất hiện do phản ứng chéo với các virus họ Herpes khác hoặc yếu tố dạng thấp. Độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA vì thế bị ảnh hưởng đáng kể. Bác sĩ không thể chỉ dựa vào hiệu giá kháng thể để chỉ định dùng thuốc kháng virus độc tính cao như Ganciclovir.

2.1. Ảnh hưởng của kháng thể mẹ và miễn dịch chưa trưởng thành

Kháng thể IgG của mẹ truyền qua hàng rào nhau thai bảo vệ thai nhi trong những tháng đầu đời. Tuy nhiên, yếu tố này gây nhiễu lớn khi xét nghiệm huyết thanh. Hiệu giá IgG ở trẻ sơ sinh phản ánh miễn dịch của người mẹ thay vì tình trạng nhiễm trùng thực sự của trẻ. Trẻ không nhiễm virus vẫn có thể có kết quả xét nghiệm IgG dương tính. Đồng thời, hệ miễn dịch sơ sinh chưa đủ năng lực sản xuất IgM ngay sau phơi nhiễm. Kháng thể IgM có thể không xuất hiện dù virus đang tích cực nhân lên trong mô. Do đó, ELISA đơn thuần dễ bỏ sót ca bệnh cấp tính nguy hiểm.

2.2. Vấn đề dương tính giả và âm tính giả trong xét nghiệm ELISA

Hiện tượng dương tính giả của kháng thể IgM CMV là thách thức lâm sàng lớn. Phản ứng chéo thường xảy ra khi bệnh nhi đồng nhiễm Epstein-Barr virus hoặc Herpes simplex virus. Sự hiện diện của kháng thể tự miễn dạng thấp (RF) cũng kích hoạt tín hiệu dương tính giả trên phiến giếng ELISA. Ngược lại, nồng độ IgG quá cao có thể ức chế cạnh tranh với IgM, gây ra kết quả âm tính giả. Giai đoạn cửa sổ miễn dịch kéo dài từ vài tuần đến hàng tháng. Điều này khiến xét nghiệm huyết thanh không thể xác định nhanh căn nguyên ở bệnh cảnh cấp cứu. Việc phụ thuộc hoàn toàn vào ELISA tiềm ẩn rủi ro chẩn đoán sai lệch.

III. Phương pháp Realtime PCR tối ưu hóa chẩn đoán virus CMV

Kỹ thuật Realtime PCR mang lại giải pháp đột phá trong chẩn đoán nhiễm CMV. Phương pháp này dựa trên nguyên lý khuếch đại axit nucleic đặc hiệu kết hợp đầu dò huỳnh quang TaqMan. Quy trình cho phép phát hiện trực tiếp DNA của CMV với độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội. Realtime PCR không phụ thuộc vào trạng thái đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Ngay cả khi bệnh nhi chưa kịp sinh kháng thể, virus vẫn bị phát hiện nếu đang hiện diện trong mẫu bệnh phẩm. Hệ thống máy PCR phân tích tín hiệu huỳnh quang theo thời gian thực trong chu kỳ nhiệt. Kết quả được định lượng qua giá trị chu kỳ ngưỡng Ct. Bác sĩ xác định được chính xác tải lượng virus trong máu toàn phần, huyết tương hoặc dịch não tủy. Nồng độ virus phản ánh trực tiếp mức độ hoạt động và khả năng nhân lên của mầm bệnh. Thời gian thực hiện xét nghiệm được rút ngắn xuống còn vài giờ. Điều này tạo điều kiện thuận lợi để chỉ định điều trị sớm và đánh giá đáp ứng thuốc chuẩn xác.

3.1. Quy trình kỹ thuật và thiết kế mồi TaqMan đặc hiệu

Quy trình Realtime PCR tại Bệnh viện Nhi Thái Bình tuân thủ kiểm soát nghiêm ngặt. Mẫu máu được tách chiết DNA bằng cột silica chuyên dụng để loại bỏ chất ức chế PCR. Hỗn hợp phản ứng thể tích 25 microlit bao gồm enzyme Taq DNA polymerase, dNTPs và đệm phản ứng chứa magie. Cặp mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế chuyên biệt để bắt cặp chính xác vào vùng gen đích bảo tồn của CMV. Đầu dò huỳnh quang TaqMan phát tín hiệu khi bị thủy phân trong quá trình kéo dài chuỗi. Việc bổ sung dUTP và enzyme UNG giúp triệt tiêu nguy cơ ngoại nhiễm chéo giữa các mẻ xét nghiệm.

3.2. Ưu thế định lượng tải lượng virus trong theo dõi điều trị

Realtime PCR không chỉ phát hiện sự hiện diện của virus mà còn đo lường chính xác tải lượng DNA. Số bản sao virus trong mỗi mililit máu tương quan trực tiếp với mức độ tiến triển của bệnh. Trẻ có tải lượng CMV cao cần được can thiệp ngay lập tức bằng thuốc kháng virus. Trong suốt liệu trình điều trị, xét nghiệm Realtime PCR định kỳ giúp theo dõi sự suy giảm mật độ virus. Nếu tải lượng DNA không giảm hoặc tăng trở lại, bác sĩ có thể phát hiện tình trạng kháng thuốc. Khả năng giám sát động học virus là lợi thế vượt trội mà kỹ thuật ELISA không thể cung cấp.

IV. Kết luận ứng dụng phối hợp Realtime PCR và ELISA thực tiễn

Nghiên cứu so sánh tại Bệnh viện Nhi Thái Bình khẳng định vai trò bổ trợ thiết yếu giữa Realtime PCR và ELISA. Không có phương pháp đơn lẻ nào thay thế hoàn toàn kỹ thuật còn lại trong mọi hoàn cảnh lâm sàng. ELISA là lựa chọn tối ưu cho mục tiêu sàng lọc dịch tễ và đánh giá tiền sử miễn dịch. Chi phí xét nghiệm ELISA hợp lý, quy trình thực hiện phù hợp với đơn vị y tế tuyến cơ sở. Tuy nhiên, Realtime PCR là tiêu chuẩn vàng để khẳng định nhiễm trùng hoạt động ở bệnh nhi sơ sinh. Kỹ thuật sinh học phân tử loại bỏ hoàn toàn sai số do kháng thể thụ động từ mẹ truyền sang. Trong thực hành lâm sàng, chiến lược kết hợp mang lại hiệu quả chẩn đoán cao nhất. Bác sĩ nên chỉ định ELISA để đánh giá sơ bộ kháng thể huyết thanh. Đối với các ca bệnh có biểu hiện nặng hoặc nghi ngờ âm tính giả, Realtime PCR cần được tiến hành ngay lập tức. Mô hình tiếp cận đa tầng này giúp nâng cao độ chính xác, tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân và bảo đảm an toàn điều trị.

4.1. Hướng dẫn phác đồ chỉ định xét nghiệm phối hợp hiệu quả

Phác đồ chẩn đoán tối ưu cần phân loại bệnh nhi theo nhóm tuổi và triệu chứng lâm sàng. Trẻ sơ sinh dưới ba tuần tuổi nghi nhiễm CMV bẩm sinh cần được chỉ định xét nghiệm Realtime PCR máu hoặc nước tiểu ngay từ đầu. Bước này giúp khẳng định sự nhân lên của virus mà không bị đánh lừa bởi kháng thể mẹ truyền. Đối với trẻ lớn hơn có biểu hiện nhẹ, xét nghiệm ELISA kháng thể IgM và IgG được ưu tiên làm xét nghiệm đầu tay. Khi kết quả ELISA cho thấy IgM dương tính hoặc có nghi vấn lâm sàng, kỹ thuật Realtime PCR sẽ đóng vai trò xác nhận và định lượng virus trước khi điều trị đặc hiệu.

4.2. Khuyến nghị nâng cao năng lực chẩn đoán tại Bệnh viện Nhi Thái Bình

Bệnh viện Nhi Thái Bình cần tiếp tục duy trì và chuẩn hóa hệ thống máy Realtime PCR cùng máy ELISA hiện có. Đội ngũ kỹ thuật viên xét nghiệm cần được tập huấn thường xuyên về kỹ thuật thao tác vô trùng và kiểm soát nội kiểm. Việc thiết lập hệ thống cảnh báo sớm giúp bác sĩ điều trị nhận diện kịp thời trẻ nhiễm CMV nguy cơ cao. Bệnh viện cũng cần tăng cường dự trữ hóa chất mồi TaqMan đạt chuẩn quốc tế nhằm hạn chế nguy cơ sai số. Sự phối hợp chặt chẽ giữa khoa lâm sàng và khoa xét nghiệm là chìa khóa then chốt nâng cao chất lượng chăm sóc bệnh nhi.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm Cytomegalovirus ở người, hay Human Herpesvirus 5, là một trong những nguyên nhân truyền nhiễm hàng đầu gây dị tật bẩm sinh và tổn thương thần kinh vĩnh viễn ở trẻ nhỏ. Theo các báo cáo dịch tễ học toàn cầu, tỷ lệ huyết thanh dương tính với virus này trong quần thể người trưởng thành dao động từ 60% đến 90%. Ở phụ nữ trong độ tuổi sinh sản, tỷ lệ nhiễm dao động từ 45% tại các quốc gia phát triển lên đến gần 100% tại các quốc gia đang phát triển, tạo nên nguy cơ phơi nhiễm nguyên phát rất lớn trong thai kỳ. Nhiễm virus bẩm sinh xảy ra ở khoảng 0,2% đến 2,2% tổng số trẻ sơ sinh sống trên toàn thế giới. Đáng lưu ý, khoảng 90% trẻ nhiễm bẩm sinh hoàn toàn không biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở thời điểm chào đời, nhưng có từ 7% đến 15% trong số này sẽ tiến triển thành điếc thần kinh giác quan tiến triển và 5% đến 17% xuất hiện các biến chứng thần kinh muộn sau vài tháng hoặc vài năm. Đối với 10% trẻ có triệu chứng khởi phát sớm, các biểu hiện rất nặng nề bao gồm tật đầu nhỏ chiếm 53%, vàng da ứ mật chiếm 67%, xuất huyết dưới da 71%, tăng enzyme gan ALT và AST chiếm 83%, kèm theo nguy cơ tử vong cao.

Vấn đề then chốt trong thực hành lâm sàng nhi khoa hiện nay là kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme truyền thống nhằm tìm kháng thể kháng virus thường bộc lộ độ nhạy hạn chế, dễ xảy ra hiện tượng âm tính giả trong giai đoạn cửa sổ hoặc dương tính giả do kháng thể của người mẹ truyền qua nhau thai. Do đó, việc định danh chính xác sự hiện diện và hoạt động của virus là yêu cầu cấp thiết. Luận văn hướng đến mục tiêu đánh giá, so sánh hiệu quả chẩn đoán giữa kỹ thuật Realtime PCR định lượng vật chất di truyền và kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch phát hiện kháng thể trên mẫu huyết thanh của bệnh nhi nghi nhiễm, đồng thời xác định mối tương quan giữa nồng độ kháng thể, tải lượng virus và biểu hiện lâm sàng. Nghiên cứu được triển khai trên đối tượng trẻ em dưới 6 tuổi tại Bệnh viện Nhi Thái Bình trong khung thời gian 12 tháng, từ tháng 03 năm 2020 đến tháng 03 năm 2021. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn quan trọng, giúp các bác sĩ rút ngắn thời gian chẩn đoán xác định xuống dưới 5 giờ, nâng độ chính xác lâm sàng lên trên 95%, từ đó thiết lập phác đồ điều trị thuốc kháng virus kịp thời trong 28 ngày đầu đời nhằm giảm thiểu tối đa các di chứng thần kinh và tiết kiệm hàng chục triệu đồng chi phí điều trị cho mỗi gia đình bệnh nhân.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai trục lý thuyết sinh học phân tử và miễn dịch học vi sinh vật chuyên sâu. Trục lý thuyết thứ nhất là cấu trúc phân tử và chu trình sao chép của virus thuộc phân họ Betaherpesvirinae. Bộ gen của virus là chuỗi DNA xoắn kép mạch thẳng có kích thước lớn khoảng 235 kbp (± 1,9 kbp), bao gồm hai cấu phần duy nhất dài và ngắn, mã hóa hơn 200 khung đọc mở với khả năng sinh tổng hợp khoảng 100 loại protein chức năng. Trong đó, gen UL55 mã hóa glycoprotein bề mặt quan trọng tham gia vào quá trình gắn kết màng tế bào túc chủ, còn gen UL83 mã hóa phosphoprotein pp65 thuộc chất nền liên quan trực tiếp đến phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Quá trình nhân bản của virus diễn ra chậm, bắt đầu tổng hợp DNA trong nhân tế bào sau 16 đến 24 giờ và chỉ giải phóng hạt virion hoàn chỉnh sau 72 đến 96 giờ.

Trục lý thuyết thứ hai là động học đáp ứng miễn dịch dịch thể của cơ thể túc chủ đối với mầm bệnh. Kháng thể sớm xuất hiện trong vòng 4 đến 7 tuần sau khi cơ thể tiếp xúc với nguồn lây và có thể tồn tại kéo dài từ 16 đến 20 tuần, đóng vai trò là dấu ấn chỉ điểm cho tình trạng nhiễm trùng tiên phát hoặc tái hoạt động của virus. Ngược lại, kháng thể muộn xuất hiện chậm hơn nhưng tồn tại suốt đời, phản ánh tình trạng miễn dịch ghi nhớ hoặc sự phơi nhiễm trước đó trong quá khứ. Các khái niệm cốt lõi được ứng dụng xuyên suốt bao gồm chu kỳ ngưỡng khuếch đại huỳnh quang, hiệu quả phản ứng khuếch đại chuỗi đạt chuẩn từ 90% đến 105%, hệ số tương quan tuyến tính của đường chuẩn nồng độ đạt giá trị tuyệt đối trên 0,980, và tải lượng virus biểu thị qua mật độ bản sao trên mỗi mililit mẫu bệnh phẩm.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng thiết kế mô tả cắt ngang kết hợp hai phương pháp hồi cứu và tiến cứu, thu thập dữ liệu lâm sàng và cận lâm sàng tại Khoa Xét nghiệm thuộc Bệnh viện Nhi Thái Bình. Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 180 bệnh nhi dưới 6 tuổi đến khám và điều trị tại các khoa lâm sàng có chỉ định xét nghiệm chẩn đoán virus. Phương pháp chọn mẫu thuận tiện có chủ đích được áp dụng nhằm thu nhận các trường hợp có biểu hiện nghi ngờ như sốt kéo dài, vàng da, gan lách to hoặc suy giảm miễn dịch.

Hai phương pháp xét nghiệm phân tích đối đầu được lựa chọn dựa trên những cơ sở khoa học chặt chẽ:

Thứ nhất, kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch gắn enzyme sử dụng bộ sinh phẩm thương mại của hãng DiaPro nhằm phát hiện định lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh. Phương pháp này được chọn vì tính phổ biến, chi phí hợp lý và khả năng sàng lọc diện rộng nhanh chóng trên các hệ thống đọc quang học tự động ở bước sóng 450/620 nm. Quy trình pha loãng mẫu đạt tỷ lệ 1:101, ủ phản ứng tại 37 độ C trong 60 phút và đo mật độ quang học theo chuẩn quốc tế của Tổ chức Y tế Thế giới.

Thứ hai, kỹ thuật Realtime PCR sử dụng hệ thống cặp mồi đặc hiệu và đầu dò huỳnh quang TaqMan probe để nhân bản đoạn gen đích của virus. Mẫu máu toàn phần chống đông không dùng heparin được tách chiết DNA qua quy trình phenol kết hợp chloroform và chất trợ tủa chuyên dụng, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 5 phút. Phản ứng khuếch đại được thiết lập trên chu trình nhiệt 40 chu kỳ, bao gồm giai đoạn biến tính ở 95 độ C trong 15 giây và bắt cặp kéo dài ở 55 độ C trong 60 giây. Kỹ thuật này được lựa chọn làm tiêu chuẩn đối sánh vì độ nhạy lâm sàng vượt trội, giới hạn phát hiện đạt mức dưới 250 bản sao trên mỗi mililit và hoàn toàn không bị gây nhiễu bởi kháng thể thụ động truyền từ mẹ sang con. Toàn bộ tiến trình thu thập dữ liệu và phân tích mẫu kéo dài liên tục trong 12 tháng, từ tháng 03 năm 2020 đến tháng 03 năm 2021, đảm bảo tính chuẩn hóa theo quy định quản lý mẫu bệnh phẩm truyền nhiễm do Bộ Y tế ban hành.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phân tích số liệu từ 180 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhi dưới 6 tuổi đem lại những phát hiện quan trọng về hiệu quả của hai phương pháp xét nghiệm:

Thứ nhất, xét nghiệm miễn dịch ghi nhận tỷ lệ dương tính với kháng thể kháng virus ở mức rất cao, đạt khoảng 86,1% (tương đương 155 trên 180 trẻ), chứng minh tỷ lệ phơi nhiễm tự nhiên trong cộng đồng địa phương là vô cùng phổ biến. Trong khi đó, tỷ lệ phát hiện kháng thể sớm chỉ đạt 21,7% (tương đương 39 trên 180 trẻ), với sự tập trung áp đảo ở nhóm trẻ dưới 1 tuổi, chiếm tới 64,1% tổng số ca dương tính với kháng thể sớm.

Thứ hai, kỹ thuật Realtime PCR chứng minh năng lực phát hiện vượt trội khi ghi nhận tỷ lệ dương tính với DNA của virus đạt 38,3% (tương đương 69 trên 180 mẫu máu toàn phần). So với tỷ lệ 21,7% của kháng thể sớm, kỹ thuật sinh học phân tử đã phát hiện thêm 16,6% số ca bệnh đang trong giai đoạn virus hoạt động nhân lên mà xét nghiệm miễn dịch thông thường đã bỏ sót.

Thứ ba, sự phân bố tải lượng virus có sự khác biệt rõ rệt theo nhóm tuổi và đặc điểm nhân khẩu học. Nhóm trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi có tải lượng virus trung bình cao nhất, dao động trong khoảng từ 1,5 x 10^3 đến 8,2 x 10^5 bản sao trên mỗi mililit máu. Tỷ lệ phát hiện vật chất di truyền của virus ở trẻ em sinh sống tại khu vực nông thôn chiếm 41,2%, cao hơn đáng kể so với tỷ lệ 33,8% ở khu vực thành thị. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ nhiễm giữa bé trai (chiếm 52,2%) và bé gái (chiếm 47,8%).

Thứ tư, khi so sánh đối đầu trực tiếp, trong 39 trường hợp dương tính với kháng thể sớm, Realtime PCR cho kết quả đồng thuận dương tính ở 35 ca, đạt tỷ lệ tương thích 89,7%. Tuy nhiên, trong 141 trường hợp có kháng thể sớm âm tính, Realtime PCR vẫn phát hiện được 34 ca dương tính với DNA của virus, chiếm tỷ lệ lên tới 24,1%. Đây là những trường hợp mang tải lượng virus cao và đi kèm biểu hiện men gan ALT tăng vượt ngưỡng 80 U/L.

Thảo luận kết quả

Sự chênh lệch đáng kể giữa tỷ lệ phát hiện vật chất di truyền bằng Realtime PCR và kháng thể sớm bằng kỹ thuật miễn dịch phản ánh chân thực đặc điểm sinh lý bệnh học ở trẻ nhỏ. Ở nhóm trẻ dưới 6 tháng tuổi, hệ thống miễn dịch thể dịch chưa phát triển hoàn thiện, khả năng sinh kháng thể sớm còn yếu ớt hoặc bị ức chế bởi nồng độ cao kháng thể muộn do người mẹ truyền qua hàng rào nhau thai. Hiện tượng này dẫn đến tỷ lệ âm tính giả rất cao khi chỉ dựa vào xét nghiệm huyết thanh học. Ngược lại, Realtime PCR trực tiếp khuếch đại đoạn gen đích của hạt virus tự do và virus nội bào trong bạch cầu đơn nhân, do đó phản ánh trực tiếp và chính xác tình trạng virus đang nhân lên mà không phụ thuộc vào phản ứng tạo kháng thể của bệnh nhi.

Kết quả của luận văn hoàn toàn tương đồng với các công bố khoa học trước đây. Nghiên cứu của Đặng Hồng Cúc tại Việt Nam từng chỉ ra rằng kỹ thuật Realtime PCR có thể phát hiện DNA của virus ở cả những mẫu huyết thanh có kháng thể sớm âm tính nhưng có biểu hiện lâm sàng rõ rệt. Tương tự, nghiên cứu của Costa và các cộng sự tại Brazil trên bệnh nhân ghép tạng cũng khẳng định kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy vượt trội trong việc phát hiện sớm sự nhân lên của virus trước khi các triệu chứng lâm sàng bộc lộ từ vài tuần đến vài tháng.

Để trực quan hóa các dữ liệu khoa học này, kết quả nghiên cứu có thể được trình bày thông qua một biểu đồ cột kép biểu diễn tỷ lệ dương tính giữa phương pháp miễn dịch và Realtime PCR theo từng nhóm tuổi chi tiết (dưới 6 tháng, từ 6 đến 12 tháng, từ 1 đến 3 tuổi và từ 3 đến 6 tuổi). Cách thể hiện này làm nổi bật ưu thế chẩn đoán của Realtime PCR tại nhóm tuổi sơ sinh. Đồng thời, một bảng chéo phân tích 2x2 giữa kết quả Realtime PCR và kết quả kháng thể sớm giúp người đọc nắm bắt trực quan độ nhạy lâm sàng đạt 89,7% cùng giá trị dự đoán âm tính của phương pháp, tạo cơ sở thực chứng vững chắc cho việc thay đổi quy trình chỉ định xét nghiệm trong thực tiễn bệnh viện.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng khoa học thu thập được, luận văn đưa ra bốn nhóm giải pháp hành động cụ thể nhằm hoàn thiện công tác chẩn đoán và điều trị:

Thứ nhất, thiết lập và ban hành quy trình phối hợp chẩn đoán đa tầng giữa Khoa Xét nghiệm và các khoa lâm sàng tại Bệnh viện Nhi Thái Bình. Hội đồng Khoa học bệnh viện cần quy định xét nghiệm Realtime PCR là chỉ định bắt buộc đối với tất cả trẻ sơ sinh có kháng thể sớm âm tính nhưng biểu hiện triệu chứng lâm sàng nghi ngờ như vàng da kéo dài hoặc tăng men gan, nhằm đạt mục tiêu nâng tỷ lệ chẩn đoán đúng lên trên 98% và giảm tỷ lệ bỏ sót ca bệnh xuống dưới 2% trong vòng 6 tháng tới.

Thứ hai, tối ưu hóa quy trình kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử tại Khoa Xét nghiệm thông qua việc áp dụng hệ thống tách chiết DNA tự động và chuẩn hóa hóa chất TaqMan probe. Mục tiêu đặt ra là rút ngắn thời gian trả kết quả từ 24 giờ xuống còn dưới 4 giờ đối với các ca cấp cứu sơ sinh nguy kịch, dự kiến hoàn thành triển khai trong quý 3 năm 2023.

Thứ ba, tổ chức đào tạo và tập huấn chuyên môn định kỳ cho đội ngũ y bác sĩ. Phòng Chỉ đạo tuyến của bệnh viện phối hợp cùng các chuyên gia đầu ngành tổ chức 4 khóa tập huấn chuyên sâu về phiên giải kết quả chu kỳ ngưỡng và ý nghĩa của các mức tải lượng virus trên 10^3 bản sao trên mỗi mililit cho 100% bác sĩ lâm sàng thuộc khối Sơ sinh và Truyền nhiễm trong vòng 12 tháng.

Thứ tư, mở rộng chỉ định sàng lọc thường quy bằng kỹ thuật Realtime PCR nước tiểu và máu cho nhóm trẻ sinh non nhẹ cân dưới 1500g hoặc trẻ có mẹ nhiễm virus trong thai kỳ. Ban Giám đốc Bệnh viện Nhi Thái Bình cần phê duyệt danh mục kỹ thuật sàng lọc này và đưa vào áp dụng thường quy bắt đầu từ tháng 01 năm 2024 nhằm can thiệp sớm bằng thuốc kháng virus trong 28 ngày vàng đầu đời.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn to lớn cho bốn nhóm đối tượng chuyên môn sau:

Thứ nhất, các bác sĩ chuyên khoa Nhi, bác sĩ Sơ sinh và Truyền nhiễm có thể sử dụng tài liệu này như một cẩm nang lâm sàng để phân biệt chính xác giữa nhiễm virus thể hoạt động và tình trạng kháng thể thụ động từ mẹ. Nghiên cứu cung cấp bằng chứng rõ ràng giúp bác sĩ tự tin ra quyết định điều trị thuốc kháng virus kịp thời nhằm ngăn chặn nguy cơ điếc giác quan tiến triển ở trẻ.

Thứ hai, cử nhân và kỹ thuật viên xét nghiệm y học tại các cơ sở y tế tuyến tỉnh có thể tham khảo chi tiết quy trình tách chiết mẫu bằng phenol kết hợp chloroform và phương pháp kiểm soát ngoại nhiễm bằng enzym chuyên biệt. Tài liệu hướng dẫn cụ thể cách dựng đường chuẩn tuyến tính 4 điểm với nồng độ từ 10^2 đến 10^8 bản sao để vận hành xét nghiệm đạt độ lặp lại cao.

Thứ ba, học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học và Vi sinh y học sẽ tìm thấy trong luận văn một mô hình nghiên cứu chuẩn mực, kết hợp hài hòa giữa lý thuyết sinh học phân tử với thực hành y học chứng cứ, cùng phương pháp xử lý số liệu sinh học chính xác.

Thứ tư, các nhà quản lý y tế và lãnh đạo bệnh viện chuyên khoa có thêm căn cứ dữ liệu thực chứng để xây dựng đề án đầu tư phòng xét nghiệm đạt chuẩn an toàn sinh học cấp 2a, mua sắm máy móc sinh học phân tử và định giá dịch vụ kỹ thuật cao phục vụ công tác khám chữa bệnh tại địa phương.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật Realtime PCR có điểm gì vượt trội hơn xét nghiệm miễn dịch trong chẩn đoán ở trẻ sơ sinh? Realtime PCR phát hiện trực tiếp DNA của virus với độ nhạy lâm sàng đạt trên 95% và giới hạn định lượng dưới 250 bản sao trên mỗi mililit máu, hoàn toàn không bị ảnh hưởng bởi kháng thể muộn từ mẹ truyền sang. Nghiên cứu thực tế chỉ ra có tới 24,1% trẻ mang tải lượng virus cao được phát hiện qua Realtime PCR dù xét nghiệm kháng thể sớm cho kết quả âm tính.

Kháng thể muộn IgG dương tính ở trẻ dưới 6 tháng tuổi có đồng nghĩa với việc trẻ đang mắc bệnh không? Kháng thể muộn dương tính chỉ phản ánh tình trạng trẻ từng phơi nhiễm hoặc nhận kháng thể thụ động bảo vệ từ mẹ truyền qua nhau thai. Trong nghiên cứu, có tới 86,1% trẻ có kháng thể muộn dương tính, nhưng phần lớn không trong tình trạng nhiễm trùng hoạt động. Do đó, bác sĩ cần chỉ định xét nghiệm Realtime PCR để đo tải lượng virus trước khi kết luận bệnh.

Mức tải lượng virus nào được xem là nguy hiểm cần phải can thiệp điều trị? Khi tải lượng DNA của virus trong máu vượt ngưỡng khoảng 1.000 bản sao trên mỗi mililit, kết hợp với các triệu chứng tổn thương đa cơ quan như nồng độ men gan tăng trên 80 U/L hoặc tiểu cầu giảm dưới 100 G/L, bệnh nhi có nguy cơ cao bị biến chứng thần kinh và cần được xem xét can thiệp thuốc kháng virus trong liệu trình 6 tuần.

Phương pháp tách chiết phenol kết hợp chloroform trong nghiên cứu có ưu và nhược điểm gì? Quy trình tách chiết thủ công này cho hiệu suất thu hồi DNA tinh sạch cao, loại bỏ hoàn toàn các protein biến tính và lipid gây ức chế phản ứng khuếch đại, rất thích hợp với các mẫu huyết thanh phức tạp. Nhược điểm là thao tác đòi hỏi kỹ thuật viên mất khoảng 60 phút và phải thực hiện nghiêm ngặt trong tủ an toàn sinh học để tránh phơi nhiễm hóa chất.

Trẻ sơ sinh nhiễm virus không biểu hiện triệu chứng lúc sinh có cần tái khám định kỳ không? Việc theo dõi định kỳ là bắt buộc vì có khoảng 7% đến 15% trẻ sơ sinh nhiễm virus không triệu chứng ban đầu sẽ tiến triển thành điếc thần kinh giác quan và 5% đến 17% phát triển các rối loạn vận động hoặc chậm phát triển trí tuệ sau này. Bệnh nhi cần được kiểm tra thính lực và phát triển thể chất mỗi 3 đến 6 tháng một lần cho đến khi đủ 3 tuổi.

Kết luận

• Luận văn đã chứng minh kỹ thuật Realtime PCR có độ nhạy lâm sàng vượt trội, phát hiện được 38,3% ca dương tính so với tỷ lệ 21,7% của xét nghiệm kháng thể sớm, khắc phục triệt để khoảng trống chẩn đoán âm tính giả ở trẻ nhỏ.
• Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình định lượng tải lượng virus với đường chuẩn tuyến tính đạt hệ số tin cậy cao trên 0,980 và hiệu quả phản ứng khuếch đại ổn định trong khoảng 90% đến 105%.
• Kết quả làm rõ mối tương quan mật thiết giữa tải lượng virus trong máu với tình trạng tổn thương tế bào gan và các triệu chứng thần kinh, tạo cơ sở vững chắc cho thực hành y học chứng cứ.
• Đóng góp quy trình chuẩn hóa từ khâu lấy mẫu, xử lý huyết thanh không chứa chất ức chế đến kỹ thuật ly tâm tách chiết DNA đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học của Bộ Y tế.
• Định hướng nghiên cứu tiếp theo trong giai đoạn 2024 đến 2025 là mở rộng đánh giá tải lượng virus trên bệnh phẩm nước tiểu và dịch não tủy, đồng thời phân tích đột biến kháng thuốc trên gen UL97.

Các y bác sĩ và đơn vị y tế chuyên khoa hãy chủ động ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR vào quy trình sàng lọc và chẩn đoán sớm nhằm bảo vệ tối đa sức khỏe, thính lực và tương lai phát triển toàn diện của trẻ em ngay từ những tuần đầu đời.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề CMV (Human Cytomegalovirus) ở ngƣời thuộc họ Herpesviridae còn đƣợc gọi là Human Herpesvirus 5 (HHV-5). CMV là tác nhân gây bệnh cơ hội. Vi rút này gây bệnh nặng và tử vong ở những ngƣời có hệ thống miễn dịch bị tổn hại, bao gồm những ngƣời ghép tạng và tủy xƣơng, những ngƣời bị nhiễm HIV, những ngƣời đang sử dụng thuốc ức chế miễn dịch và trẻ sơ sinh bị nhiễm bệnh trong thời kỳ mang thai. Trong cộng đồng, việc nhiễm trùng CMV khá phổ biển, chiếm tỷ lệ 60-90% ở ngƣời trƣởng thành.

Điều này đồng nghĩa với việc có rất nhiều phụ nữ trong độ tuổi sinh sản và các thai phụ có nguy cơ nhiễm CMV nguyên phát thai kỳ. Tính trên toàn thế giới, tỷ lệ có huyết thanh dƣơng tính với CMV ở những phụ nữ độ tuổi sinh sản thay đổi từ 45% ở những nƣớc phát triển đến 100% ở những nƣớc đang phát triển [8]. Nhiễm CMV bẩm sinh là nhiễm trùng bào thai thƣờng gặp nhất tính trên toàn thế giới và chiếm tỷ lệ vào khoảng 0,2-2,2% tất cả trẻ sơ sinh. Ở trẻ em bị nhiễm CMV phần lớn không thể hiện triệu chứng lâm sàng, chỉ khoảng 10% số trẻ bị nhiễm CMV có thể có các triệu chứng lâm sàng sau: kích thƣớc đầu rất nhỏ (microcephaly) hoặc nhỏ, gan và lách to vừa phải, vàng da, phát ban khi sinh, có các cơn động kinh, thiếu cân hoặc viêm mắt.

Khi trẻ nhiễm CMV bẩm sinh gây nên rất nhiều biểu hiện bệnh liên quan đến thần kinh bao gồm giảm trƣơng lực cơ, ăn uống kém, dãn não thất, loạn sản mô não, đa vi hồi não, những cấu trúc giả nang quanh não thất, co giật, co thắt, liệt cứng và chậm phát triển. Khoảng 30% những trẻ nhiễm CMV bẩm sinh sẽ bị điếc thần kinh. Trong số 90% trẻ sơ sinh nhiễm CMV không triệu chứng, 7%-15% sẽ xuất hiện điếc thần kinh ở những năm tuổi sau đó. Các biểu hiện về mắt ở trẻ nhiễm CMV bẩm sinh bao gồm viêm màng mạch - võng mạc, lé, nhãn cầu nhỏ, bất sản thần kinh thị, tổn thƣơng vỏ não thùy chẩm.

Với trẻ nhiễm CMV 2 không triệu chứng lúc sinh sẽ có 5-17% sẽ xuất hiện biến chứng vài tháng đến vài năm sau sinh [8]. Do đó, việc phát hiện sớm CMV có ý nghĩa rất quan trọng, là cơ sở xây dựng phác đồ điều trị và tránh đƣợc những tai biến không đáng có đối với trẻ em. ELISA trƣớc đây đã đƣợc sử dụng để phát hiện kháng thể đặc hiệu CMV (IgG và IgM) chẩn đoán xác định nhiễm CMV. Tuy nhiên, hiện tại, độ đặc hiệu và độ nhạy thấp của phƣơng pháp ELISA đƣợc sử dụng đã đƣợc báo cáo trong một số nghiên cứu đánh giá.

Trẻ bị ảnh hƣởng bởi Cytomegalovirus đƣợc biết là phát tán virus trong các chất tiết khác nhau của cơ thể, đặc biệt là nƣớc tiểu, máu và dịch ngoáy họng, trong một số trƣờng hợp, trong nhiều tháng và nhiều năm. Việc phát hiện Cytomegalovirus trong các mẫu lâm sàng nhƣ nƣớc tiểu và máu, bằng PCR, cũng cung cấp thông tin quan trọng về sự bài tiết của vi rút ở trẻ bị nhiễm bệnh và dự đoán bệnh có triệu chứng. Phƣơng pháp PCR đã đƣợc biết đến dùng để chẩn đoán nhanh CMV và nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra PCR là một phƣơng pháp có độ nhạy cảm, độ đặc hiệu cao trong việc chẩn đoán, dự đoán sự phát triển của bệnh CMV lên đến vài tháng trƣớc khi có biểu hiện lâm sàng. Hiện nay, Bệnh viện Nhi Thái Bình cũng đang triển khai và ứng dụng cả 2 phƣơng pháp Realtime PCR và ELISA trong chẩn đoán CMV phục vụ công tác chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.

Tuy nhiên, tính hiệu quả của cả 2 phƣơng pháp chƣa đƣợc đánh giá về sự khác biệt trong chẩn đoán phát hiện CMV trên mẫu bệnh phẩm. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu so sánh hiệu quả của phƣơng pháp realtime PCR và ELISA trong chẩn đoán phát hiện nhiễm CMV tại bệnh viện Nhi Thái Bình”. Mục tiêu nghiên cứu Đề tài thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp ELISA với phƣơng pháp Realtime PCR trong xét nghiệm với bệnh phẩm là máu của nhóm trẻ đƣa vào nghiên cứu. Xác định mối tƣơng quan giữa đặc điểm lâm sàng với kết quả ELISA và Realtime PCR từ đó làm căn cứ để đƣa ra phƣơng pháp chẩn đoán sớm nhiễm CMV đồng thời có biện pháp can thiệp kịp thời.

Nội dung nghiên cứu - Đề tài xác định đƣợc số lƣợng trẻ đƣợc xét nghiệm tìm kháng thể của CMV trong máu mà kết quả khẳng định có từ một hoặc hai loại kháng thể là IgG và IgM. - Đề tài phân loại đƣợc tỷ lệ có kháng thể theo từng lứa tuổi, giới tính và khu vực sống của trẻ. - Đề tài xác định đƣợc tỷ lệ DNA của CMV trên đối tƣợng nghiên cứu theo độ tuổi, giới tính, khu vực sống. - Đề tài đánh giá đƣợc hiệu quả giữa hai phƣơng pháp Elisa và PCR trên đối tƣợng nghiên cứu.

Đề tài đƣợc thực hiện tại khoa Xét nghiệm bệnh viện Nhi Thái Bình. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đại cƣơng về CMV Hình 1. Cấu tạo virus CMV và tế bào bị nhiễm CMV (nguồn: https://www.com & https://chromoscience.

Lược sử phát hiện và nghiên cứu CMV Cytomegalovirus lần đầu tiên đƣợc phát hiện bởi Ribbert H vào năm 1881 từ việc giải phẫu mô bệnh học của một trẻ sơ sinh mang bệnh bẩm sinh tuy nhiên đến năm 1904 ông mới đƣa ra bằng chứng xác thực. Các tế bào khổng lồ mà Ribbert quan sát thấy lúc khám nghiệm tử thi đƣợc hiểu nhầm là động vật nguyên sinh. Vào năm 1920, Goodpasture và Talbert là những ngƣời đầu tiên cho rằng tề bào bị phình to có thể là do hậu quả của nhiễm virus, và Goodpasture đề nghị sử dụng thuật ngữ “Cytomegalia” là để chỉ sự phồng to của tế bào bị nhiễm. Vào 1956, Smith và Rowe phân lập đƣợc CMV từ tuyến dƣới hàm hoặc tuyến amidan của em bé, và CMV đƣợc gọi là: “virus của tuyến nƣớc bọt”, hay là “virus gây bệnh thể vùi của tuyến nƣớc bọt” [23].

Đến năm 1960, Weller và cộng sự đề nghị sử dụng thuật ngữ “Cytomegalovirus” bởi vì thuật ngữ “bệnh virus của tuyến nƣớc bọt-CID (Cytomegalic inclusion disease)” khó sử dụng và sai lầm, do tuyến nƣớc bọt chỉ là một trong nhiều vị trí bị nhiễm, Klemola và Kaarrianinen đã mô tả bệnh tăng bạch cầu đơn nhân do CMV (1965), cùng năm ấy ngƣời ta phát hiện 5 CMV ở một bệnh nhân đƣợc ghép thận. Trong hai thập niên 1970 và 1980, sinh học phân tử của CMV đƣợc tiếp tục các nhà khoa học nghiên cứu và khám phá. Năm 1984, 28 năm sau lần phân lập đầu tiên, trình tự đầu tiên của Cytomegalovirus ở ngƣời hoặc HCMV (chủng AD169) đƣợc công bố, và chỉ 6 năm sau, vào năm 1990, bản thảo đầu tiên về bộ gen HCMV có chú thích đƣợc xuất bản, tại thời điểm đó, bộ gen lớn nhất đƣợc giải trình tự (số gia nhập Ngân hàng gen BK000394. Kể từ năm 1990 và cho đến năm 2019, 305 bộ gen HCMV hoàn chỉnh có độ dài đầy đủ đã đƣợc công bố [25].

Sau này, các nhà khoa học trên thế giới cũng có nhiều nghiên cứu về CMV. Trong đó, phải kể đến nghiên cứu so sánh về sự thay đổi nucleotide và axit amin của 60 chủng CMV gây bệnh ở ngƣời để có cơ sở thiết kế đầu dò đặc hiệu phục vụ cho việc định lƣợng CMV trên các mẫu bệnh phẩm bằng phƣơng pháp qPCR của Yeliz Yṻcel và cộng sự (2015). Trong những năm qua, các chủng CMV đã đƣợc xác định trình tự, ngày càng cải thiện, mặc dù vẫn chƣa hoàn chỉnh, chúng ta đã có thêm nhiều hiểu biết về quá trình mã hóa, biểu hiện gen và sự đa dạng của các chủng HCMV hoang dã. Các nền tảng giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc so sánh các chủng bị thụ động khác nhau, thách thức chẩn đoán và nghiên cứu dựa trên kiểu gen bộ gen đơn hoặc giảm.

Nhiễm CMV thƣờng gặp ở những bệnh nhân nhận cấy ghép, Alba Guiu và cộng sự (2020) đã công bố nghiên cứu về việc kháng thuốc điều trị CMV tại các bệnh nhân đƣợc nhận tế bào máu dị sinh (Allo-TPH). Kết quả cho thấy, tỷ lệ kháng thuốc trong nhóm cấy ghép nhiễm CMV là 21,43% (3/14 bệnh nhân) và thấy xuất hiện 2 đột biến kháng thuốc là A594V và H520Q trong gen UL97. Maria Paola Landini và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu từ tháng 1 năm 1994 đến tháng 5 năm 1998 đã nghiên cứu trên 76 phụ nữ mang thai nhiễm CMV. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc xác định đƣợc ái lực của kháng thể CMV trƣớc tuần thứ 18 của thai kỳ sẽ là công cụ hữu ích để chấn đoán khả năng nhiễm của thai nhi [22].

So Na 6 Young và cs cũng đã có nghiên cứu so sánh đánh giá các đặc điểm lâm sàng của trẻ (độ tuổi trung bình là 2,8 tháng) bị viêm gan do nhiễm CMV với trẻ bị viêm gan vô căn. Kết quả là không có sự khác biệt đáng kể nào đƣợc quan sát thấy giữa cả hai nhóm về mức ALT huyết thanh đỉnh, huyết thanh đỉnh, tổng nồng độ bilirubin, thời gian tăng bilirubin và tăng ALT; không thể phân biệt nhiễm trùng bẩm sinh với nhiễm trùng chu sinh trong nghiên cứu này [27]. Bên cạnh đó, Anne Naessens và cs (2008) đã có nghiên cứu đánh giá hai phƣơng pháp tách chiết và khuếch đại DNA CMV từ vết máu khô của trẻ sơ sinh 2 tuần tuổi. Nghiên cứu đã tiến hành tách chiết nucleotit bằng phƣơng pháp phenol-cloroform và bằng phƣơng pháp easyMAG.

Đồng thời DNA đƣợc khuếch đại bằng 2 phƣơng pháp PCR truyền thống và RT-PCR. Kết quả cho thấy việc tách chiết bằng phenol-cloroform cho kết quả tốt hơn easyMAG và RT-PCR có độ nhạy tốt hơn PCR truyền thống [26]. Wolfgang Siegert và các nhà khoa học Đức (2000) đã áp dụng kỹ thuật qPCR để định lƣợng DNA CMV. Thử nghiệm này đƣợc sử dụng để chứng minh lƣợng CMV DNA trong huyết tƣơng của bệnh nhân ghép tủy xƣơng cao hơn so với lƣợng máu của ngƣời hiến [32].

Costa và cộng sự (1999) đánh giá tỷ lệ mắc và tầm quan trọng lâm sàng của nhiễm CMV trong cấy ghép thận ở Brazil bằng kỹ thuật PCR trên mẫu nƣớc tiểu của 37 bệnh nhân đồng thời xác định sự có mặt của IgM và IgG bằng phƣơng pháp Elisa và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFI). Kết quả chỉ ra PCR có độ nhạy cao với việc phát hiện sớm nhiễm CMV ở bệnh nhân ghép thận [33]. Mặt khác, Wei Zhu và cs (2015) công bố nghiên cứu sử dụng cảm biến sinh học (BIE) phát hiện kháng thể IgG của CMV trong huyết thanh.