Nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli

Nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli gây ra theo quy mô công nghiệp, nâng cao hiệu quả chăn nuôi.

• Tác giả: Hoàng Thị Thúy
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Như Quán
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 7. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 7.1. Mục tiêu tổng quát
• 7.2. Mục tiêu cụ thể
• 8. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 9. THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 10. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 10.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN E. coli
• 10.1.1. Phân loại
• 10.1.2. Kháng nguyên
• 10.1.3. Các yếu tố gây bệnh

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E

Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli là một trong những vấn đề cấp thiết trong ngành chăn nuôi hiện nay. Bệnh phù đầu lợn do E. coli gây ra đã gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi, đặc biệt là trong giai đoạn lợn con trước và sau cai sữa. Việc phát triển vaccine hiệu quả không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe đàn lợn mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

1.1. Tình hình bệnh phù đầu lợn do E. coli tại Việt Nam

Bệnh phù đầu lợn do E. coli là một trong những bệnh phổ biến nhất trong chăn nuôi lợn ở Việt Nam. Tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt ở lợn con, đã gây ra thiệt hại kinh tế lớn cho người chăn nuôi. Các triệu chứng điển hình bao gồm phù đầu, thần kinh và tỷ lệ chết cao.

1.2. Vai trò của vaccine trong phòng bệnh phù đầu lợn

Vaccine đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa bệnh phù đầu lợn do E. coli. Việc sử dụng vaccine không chỉ giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh mà còn tăng cường sức đề kháng cho đàn lợn, từ đó nâng cao hiệu quả chăn nuôi.

II. Thách thức trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn

Sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như chất lượng giống vi khuẩn, quy trình sản xuất và kiểm nghiệm đều ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine. Đặc biệt, việc đảm bảo an toàn và hiệu lực của vaccine là rất quan trọng.

2.1. Khó khăn trong việc lựa chọn giống vi khuẩn

Việc lựa chọn giống vi khuẩn E. coli phù hợp để sản xuất vaccine là một thách thức lớn. Các chủng vi khuẩn cần phải có độc lực mạnh và khả năng gây bệnh cao để đảm bảo vaccine có hiệu quả.

2.2. Quy trình sản xuất vaccine phức tạp

Quy trình sản xuất vaccine yêu cầu nhiều bước phức tạp, từ nuôi cấy vi khuẩn đến kiểm nghiệm chất lượng. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo vaccine đạt tiêu chuẩn an toàn và hiệu lực.

III. Phương pháp nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn

Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli được thực hiện theo quy trình nghiêm ngặt. Các phương pháp nghiên cứu bao gồm nuôi cấy vi khuẩn, kiểm nghiệm độc lực và sản xuất vaccine theo quy mô công nghiệp.

3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn E. coli

Việc nuôi cấy vi khuẩn E. coli được thực hiện trên môi trường thạch máu và môi trường lỏng. Các điều kiện nuôi cấy cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo vi khuẩn phát triển tốt và đạt mật độ cao.

3.2. Kiểm nghiệm độc lực của vi khuẩn

Kiểm nghiệm độc lực là bước quan trọng để đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn. Các thí nghiệm trên động vật thí nghiệm giúp xác định mức độ độc lực và tính an toàn của vaccine.

IV. Kết quả nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn

Kết quả nghiên cứu cho thấy vaccine sản xuất đạt tiêu chuẩn về an toàn và hiệu lực. Các lô vaccine được kiểm nghiệm đều cho kết quả tích cực, giúp nâng cao khả năng phòng bệnh cho đàn lợn.

4.1. Kết quả kiểm nghiệm vaccine trên chuột thí nghiệm

Các lô vaccine đã được thử nghiệm trên chuột thí nghiệm với tỷ lệ an toàn đạt 100%. Hiệu lực bảo hộ của vaccine đạt từ 70-90%, cho thấy khả năng phòng bệnh tốt.

4.2. Kết quả thử nghiệm vaccine trên lợn

Khi thử nghiệm trên lợn, vaccine cho thấy hiệu quả cao trong việc phòng ngừa bệnh phù đầu. Tỷ lệ mắc bệnh giảm đáng kể, giúp người chăn nuôi yên tâm hơn trong quá trình chăn nuôi.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của vaccine phòng bệnh phù đầu lợn

Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli đã mở ra hướng đi mới cho ngành chăn nuôi. Vaccine không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe đàn lợn mà còn góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi.

5.1. Tầm quan trọng của vaccine trong chăn nuôi

Vaccine là giải pháp hiệu quả để phòng ngừa bệnh tật trong chăn nuôi. Việc sử dụng vaccine giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh tật gây ra.

5.2. Hướng phát triển vaccine trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các loại vaccine mới, cải thiện quy trình sản xuất và kiểm nghiệm để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo định hướng Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 được phê duyệt tại Quyết định số 10/2008/QĐ-TTg, tổng đàn lợn cả nước duy trì tốc độ tăng trưởng bình quân 2% mỗi năm, đạt quy mô 35 triệu con, trong đó phương thức nuôi trang trại công nghiệp chiếm khoảng 37%. Tuy nhiên, dịch bệnh truyền nhiễm luôn là rào cản lớn nhất gây tổn thất nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam. Trong đó, bệnh phù đầu do vi khuẩn Escherichia coli dung huyết gây ra trên lợn con giai đoạn 21 đến 90 ngày tuổi là một trong những bệnh lý nguy hiểm hàng đầu. Theo số liệu khảo sát dịch tễ tại sáu tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, tỷ lệ lợn mắc bệnh phù đầu lên tới 58,78% và tỷ lệ tử vong chiếm khoảng 53,34% tổng số lợn mắc bệnh. Thể bệnh quá cấp tính khiến con vật tử vong nhanh chóng chỉ sau 6 đến 20 giờ xuất hiện triệu chứng, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho các cơ sở chăn nuôi lợn giống và thương phẩm.

Xuất phát từ yêu cầu cấp bách của thực tiễn, đề tài tập trung giải quyết vấn đề xây dựng và hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phòng bệnh ở quy mô công nghiệp. Mục tiêu cụ thể của luận văn là đánh giá tính ổn định sinh học của các chủng vi khuẩn E. coli dung huyết thực địa, tối ưu hóa quy trình lên men sục khí công suất lớn, đồng thời kiểm nghiệm toàn diện các chỉ tiêu an toàn và hiệu lực bảo hộ của vắc-xin vô hoạt bổ trợ keo phèn. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 10 năm 2017 tại Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Vắc-xin thuộc Công ty Cổ phần Đức Hạnh Marphavet phối hợp cùng Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả đề tài mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi tạo ra sản phẩm vắc-xin đạt hiệu lực bảo hộ trên 75%, thời gian miễn dịch kéo dài từ 6 tháng trở lên, góp phần giảm tỷ lệ tử vong ở lợn con xuống dưới 1% và nâng cao hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết miễn dịch học thú y hiện đại và cơ chế sinh bệnh học của vi khuẩn đường ruột họ Enterobacteriaceae. Mô hình nghiên cứu tập trung vào cơ chế tác động tương hỗ giữa các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli và hệ thống miễn dịch dịch thể của động vật chủ. Các khái niệm cốt lõi bao gồm:

• Kháng nguyên thân O: Cấu trúc lipopolysaccharide nằm ở thành tế bào vi khuẩn, đóng vai trò là yếu tố độc lực chính kích thích cơ thể sinh kháng thể ngưng kết đặc hiệu.
• Kháng nguyên bám dính F18 và F4: Các sợi fimbriae bề mặt giúp vi khuẩn bám chắc vào các thụ thể trên tế bào biểu mô nhung mao ruột non của lợn sau cai sữa, ngăn cản sự đào thải tự nhiên của nhu động ruột.
• Độc tố Shiga Stx2e (Verotoxin VT2e): Ngoại độc tố tế bào gây tổn thương nội mô mạch máu, dẫn đến hiện tượng tăng tính thấm thành mạch, thoát dịch gây phù thũng mô não, mí mắt, dạ dày và kích thích triệu chứng thần kinh co giật điển hình.
• Độc tố đường ruột Enterotoxin (STa, STb, LT): Các phân tử độc tố kích thích tăng tiết dịch ruột, gây mất cân bằng điện giải và tiêu chảy cấp.
• Chất bổ trợ keo phèn (Alhydrogel/Alum adjuvant): Hợp chất nhôm hydroxit có tác dụng tạo kho lưu trữ kháng nguyên tại vị trí tiêm, giải phóng chậm kháng nguyên và tăng cường đáp ứng miễn dịch dịch thể bền vững.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của luận văn được thu thập từ quá trình thực nghiệm trực tiếp trên 6 chủng vi khuẩn E. coli dung huyết ký hiệu từ P1 đến P6 được lưu trữ tại ngân hàng giống của Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Vắc-xin. Cỡ mẫu nghiên cứu động vật bao gồm 150 chuột nhắt trắng khỏe mạnh có trọng lượng từ 18 đến 20 gam và 20 lợn con khỏe mạnh giai đoạn 21 đến 40 ngày tuổi chưa từng tiêm phòng vắc-xin phù đầu. Phương pháp chọn mẫu áp dụng nguyên tắc ngẫu nhiên phân tầng nhằm đảm bảo tính đại diện và đồng nhất sinh học giữa các lô thí nghiệm và lô đối chứng.

Quy trình phân tích sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR với các cặp mồi đặc hiệu do hãng Fermentas cung cấp để xác định các gen sinh độc lực và bám dính (kích thước khuếch đại từ 166 bp đến 696 bp). Quy trình nuôi cấy công nghiệp ứng dụng công nghệ lên men sục khí tự động trên hệ thống thiết bị Sartorius dung tích 15 lít và 120 lít nhập khẩu từ Cộng hòa Liên bang Đức. Việc vô hoạt vi khuẩn được thực hiện bằng Formalin nồng độ 0,5% ở 37 độ C trong 24 giờ. Lý do lựa chọn phương pháp lên men sục khí công nghiệp nhằm kiểm soát tối ưu nồng độ oxy hòa tan, độ pH và mật độ tế bào vi khuẩn, tạo ra lượng sinh khối kháng nguyên đậm đặc cao gấp nhiều lần phương pháp nuôi cấy tĩnh truyền thống. Toàn bộ số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê sinh học, xác định liều gây chết 50% (LD50) theo công thức toán học Reed và Muench (1938) trên phần mềm chuyên dụng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình kiểm định bộ giống vi khuẩn E. coli sau thời gian dài bảo quản dưới dạng thạch lỏng glycerin và đông khô cho thấy tính ổn định sinh học tuyệt đối. 100% chủng vi khuẩn duy trì đầy đủ đặc tính hình thái trực khuẩn Gram âm, khả năng di động và đặc tính sinh hóa đặc trưng như lên men sinh hơi 100% các loại đường glucose, lactose, galactose, fructose, mannitol và dextrose, đồng thời âm tính 100% với dulcitol và saccharose.

Phân tích cấu trúc kháng nguyên và gen độc lực bằng kỹ thuật PCR ghi nhận sự hiện diện của các serotype kháng nguyên O phổ biến gồm O164, O44, O169/O141, O127a, O169/O149 và O166/O149. Tỷ lệ mang gen mã hóa yếu tố bám dính F18 chiếm 66,67% (4 trên 6 chủng), yếu tố bám dính F4 chiếm 33,33%, độc tố đường ruột chịu nhiệt STa chiếm 83,33%, độc tố STb chiếm 50,00%, độc tố không chịu nhiệt LT chiếm 16,67% và độc tố tế bào phù đầu VT2e chiếm 50,00%. Khi thử độc lực trên chuột nhắt trắng với liều 0,2 ml mỗi con, 100% các chủng vi khuẩn khảo nghiệm đều làm chết 100% chuột thí nghiệm trong thời gian rất ngắn từ 17 đến 24 giờ.

Trong quy trình sản xuất quy mô công nghiệp trên máy lên men 120 lít, cả 3 lô sản xuất thử nghiệm (Lô I, Lô II, Lô III) đều đạt mật độ vi khuẩn rất cao, dao động từ 17 x 10^9 đến 19 x 10^9 vi khuẩn trên mỗi mililit canh trùng sau 8 đến 10 giờ lên men sục khí. Quá trình xử lý bằng Formol 0,5% đảm bảo vô trùng 100% khi cấy chuyển trên các môi trường thạch máu, MacConkey và nước thịt dinh dưỡng trong suốt 7 ngày theo dõi.

Về độ an toàn và hiệu lực, thử nghiệm tiêm phúc xoang liều 0,5 ml mỗi con (gấp 2,5 lần liều miễn dịch) và tiêm tĩnh mạch đuôi 0,2 ml trên chuột nhắt trắng đạt tỷ lệ sống 100%. Khi tiêm trên lợn con 21 ngày tuổi với liều gấp đôi (4 ml) và gấp ba liều quy định, 100% lợn đều an toàn tuyệt đối, không phát sinh phản ứng cục bộ hay toàn thân. Khi tiến hành công cường độc với liều 10 LD50 sau 21 ngày tiêm phòng, vắc-xin tạo tỷ lệ bảo hộ từ 70% đến 90% trên chuột thí nghiệm, trong khi 100% chuột ở lô đối chứng không tiêm phòng đều tử vong trong vòng 24 đến 48 giờ. Trên đàn lợn thí nghiệm, vắc-xin đạt tỷ lệ bảo hộ trên 75% với liều tiêm 1 ml mỗi con và duy trì hàm lượng kháng thể bảo hộ kéo dài trên 6 tháng.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả bảo hộ vượt trội của vắc-xin bắt nguồn từ việc kết hợp đa giá các chủng vi khuẩn thực địa có độc lực mạnh, chứa đầy đủ kháng nguyên bám dính F18 và độc tố Shiga Stx2e. Yếu tố F18 giữ vai trò then chốt giúp ngăn chặn vi khuẩn bám vào biểu mô ruột lợn sau cai sữa, trong khi kháng thể kháng độc tố VT2e trung hòa hoàn toàn độc tố gây phù mạch máu. Việc bổ sung 20% keo phèn đã kích thích mạnh mẽ phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và miễn dịch dịch thể, duy trì hiệu giá kháng thể cao ổn định.

Khi so sánh với các nghiên cứu trước đây, thời gian gây chết chuột của các chủng E. coli tuyển chọn trong đề tài (17 đến 24 giờ) nhanh hơn đáng kể so với kết quả của một số tác giả trong nước (24 đến 96 giờ), chứng minh bộ giống được tuyển chọn có độc lực rất cao, thích hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin. Kết quả kiểm nghiệm vô trùng và an toàn trên động vật hoàn toàn tương đồng với các công bố khoa học chuyên ngành thú y của Viện Thú y Quốc gia.

Để trực quan hóa các dữ liệu thực nghiệm, kết quả nghiên cứu có thể được biểu diễn thông qua biểu đồ cột thể hiện sự đồng đều về mật độ vi khuẩn của ba lô sản xuất công nghiệp đạt từ 17 tỷ đến 19 tỷ CFU/ml. Đồng thời, một bảng ma trận đối chiếu tỷ lệ mang các gen độc lực (STa chiếm 83,33%, F18 chiếm 66,67%, VT2e chiếm 50,00%) sẽ làm nổi bật tính đa dạng và tính đại diện miễn dịch của chế phẩm vắc-xin được chế tạo.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất chăn nuôi đại trà, luận văn đưa ra bốn nhóm giải pháp cụ thể:

• Hoàn thiện và chuẩn hóa quy trình công nghệ: Doanh nghiệp sản xuất vắc-xin phối hợp với các cơ sở nghiên cứu tiếp tục nâng công suất dây chuyền lên men tự động từ 120 lít lên 500 lít, duy trì mật độ vi khuẩn ổn định trên 18 x 10^9 CFU/ml, thực hiện hoàn thành trong giai đoạn 2026 đến 2027 nhằm đáp ứng sản lượng tối thiểu 500.000 liều vắc-xin mỗi năm.
• Xây dựng lịch trình tiêm phòng chuẩn cho cơ sở chăn nuôi: Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh ban hành hướng dẫn kỹ thuật tiêm phòng định kỳ cho lợn con ở giai đoạn 21 đến 35 ngày tuổi với liều lượng 1 ml mỗi con tiêm dưới da gốc tai, hướng tới mục tiêu bao phủ miễn dịch trên 85% tổng đàn lợn sau cai sữa tại các vùng chăn nuôi trọng điểm.
• Thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ phân tử: Các trung tâm chẩn đoán thú y định kỳ 6 tháng một lần tiến hành lấy mẫu phân lập và giải trình tự gen vi khuẩn E. coli thực địa nhằm kịp thời phát hiện các biến chủng serotype mới hoặc sự thay đổi của kháng nguyên F18 và độc tố Stx2e, đảm bảo cập nhật bộ giống sản xuất vắc-xin phù hợp với biến động dịch tễ.
• Đẩy mạnh tập huấn và chuyển giao kỹ thuật: Hiệp hội Chăn nuôi phối hợp cùng các đơn vị khuyến nông tổ chức các khóa tập huấn kỹ thuật chăm sóc, kết hợp tiêm phòng vắc-xin vô hoạt keo phèn với các biện pháp vệ sinh an toàn sinh học "cùng vào - cùng ra", phấn đấu giảm tỷ lệ mắc bệnh phù đầu tại các trang trại xuống dưới 3% trong vòng 12 tháng áp dụng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao, đặc biệt hữu ích cho bốn nhóm đối tượng chính:

• Doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y và sinh phẩm y tế: Tài liệu cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết về vận hành hệ thống lên men sục khí 120 lít, tỷ lệ phối trộn tá dược keo phèn 20% và phương pháp kiểm định chất lượng xuất xưởng theo tiêu chuẩn GMP-WHO.
• Bác sĩ thú y, kỹ sư chăn nuôi và chủ trang trại lợn: Cung cấp cơ sở khoa học để chẩn đoán phân biệt bệnh phù đầu lợn với các bệnh truyền nhiễm khác, đồng thời hướng dẫn xây dựng quy trình tiêm phòng vắc-xin vô hoạt 1 ml đạt tỷ lệ bảo hộ trên 75%.
• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Thú y: Là tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp định danh vi khuẩn bằng PCR, kỹ thuật xác định độc lực LD50 theo Reed và Muench, cùng các phương pháp kiểm nghiệm vắc-xin in vivo và in vitro.
• Cơ quan quản lý nhà nước và kiểm nghiệm dược phẩm thú y: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm đáng tin cậy phục vụ công tác xây dựng, thẩm định quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về kiểm nghiệm vắc-xin vô hoạt phòng bệnh đường ruột ở gia súc.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao vắc-xin phù đầu lợn vô hoạt cần bổ trợ keo phèn tỷ lệ 20%? Keo phèn nhôm hydroxit hoạt động như một chất mang giúp giữ kháng nguyên vi khuẩn E. coli tại vị trí tiêm dưới da, giải phóng từ từ vào hệ tuần hoàn. Cơ chế này kích thích đại thực bào và tế bào trình diện kháng nguyên hoạt động mạnh mẽ, tạo hàm lượng kháng thể ngưng kết bền vững kéo dài từ 6 tháng trở lên mà không gây kích ứng mô.

Quy trình lên men sục khí 120 lít đem lại ưu thế gì so với phương pháp nuôi cấy truyền thống? Hệ thống lên men sục khí tự động kiểm soát chính xác nhiệt độ 37 độ C, độ pH 7,2 và lưu lượng oxy hòa tan. Nhờ đó, mật độ vi khuẩn đạt từ 17 tỷ đến 19 tỷ tế bào trên mỗi mililit chỉ sau 8 đến 10 giờ nuôi cấy, cao gấp nhiều lần phương pháp nuôi tĩnh, giúp hạ giá thành sản xuất và tinh gọn liều tiêm xuống 1 ml mỗi con.

Lợn con nên được tiêm phòng vắc-xin vào thời điểm nào để đạt hiệu quả cao nhất? Thời điểm tiêm phòng tối ưu là khi lợn con đạt từ 21 đến 35 ngày tuổi, trước hoặc ngay sau khi cai sữa. Đây là giai đoạn kháng thể thụ động từ sữa mẹ suy giảm mạnh trong khi hệ nhung mao ruột hoàn thiện thụ thể tiếp nhận yếu tố bám dính F18, giúp cơ thể lợn chủ động tạo miễn dịch bảo hộ trên 75% trước khi vi khuẩn thực địa xâm nhập.

Làm thế nào để đảm bảo tính an toàn của vắc-xin khi sử dụng ở liều cao? Chế phẩm vắc-xin được vô hoạt hoàn toàn bằng Formalin 0,5% trong 24 giờ, tiêu diệt 100% vi khuẩn sống mà vẫn bảo tồn nguyên vẹn tính kháng nguyên. Các thử nghiệm tiêm liều gấp 2,5 lần trên chuột nhắt trắng và gấp 2 đến 3 lần trên lợn con 21 ngày tuổi đều cho thấy động vật hoàn toàn khỏe mạnh, không có phản ứng phụ sau 10 ngày theo dõi.

Làm cách nào để phân biệt bệnh phù đầu do E. coli với các bệnh có triệu chứng thần kinh khác? Bệnh phù đầu do E. coli thường phát đột ngột trên những con lợn to khỏe nhất đàn sau cai sữa với triệu chứng phù mí mắt, phù mặt, tiếng kêu khàn và co giật bơi chèo. Để khẳng định chính xác, cần lấy bệnh phẩm máu tim, hạch ruột để phân lập vi khuẩn E. coli dung huyết và xét nghiệm PCR xác định độc tố Shiga Stx2e và yếu tố bám dính F18.

Kết luận

• Hoàn thiện thành công quy trình công nghệ sản xuất vắc-xin vô hoạt phòng bệnh phù đầu lợn trên hệ thống lên men sục khí 120 lít, đạt mật độ vi khuẩn vượt trội từ 17 x 10^9 đến 19 x 10^9 CFU/ml.
• Xác định và chứng minh tính ổn định sinh học, kháng nguyên và độc lực cao của các chủng vi khuẩn E. coli thực địa mang gen bám dính F18 (66,67%) và độc tố phù đầu VT2e (50,00%).
• Chế phẩm vắc-xin vô hoạt bằng Formol 0,5% phối trộn 20% keo phèn đạt tiêu chuẩn vô trùng tuyệt đối, an toàn 100% trên chuột thí nghiệm và lợn con từ 21 ngày tuổi.
• Đạt hiệu lực bảo hộ từ 70% đến 90% khi công cường độc liều cao, tạo miễn dịch kéo dài ít nhất 6 tháng với liều tiêm tiện dụng 1 ml mỗi con.
• Đóng góp giải pháp kỹ thuật có giá trị kinh tế cao, giúp ngành chăn nuôi lợn chủ động phòng chống dịch bệnh và nâng cao năng suất chăn nuôi bền vững.

Kế hoạch tiếp theo trong giai đoạn 2026 - 2027 tập trung mở rộng quy mô thử nghiệm thực địa tại các vùng chăn nuôi trọng điểm phía Bắc và Đồng bằng sông Cửu Long, đồng thời hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành thương mại hóa sản phẩm. Các trang trại và cơ sở chăn nuôi cần chủ động tiếp cận, ứng dụng vắc-xin vô hoạt bổ trợ keo phèn vào quy trình phòng bệnh định kỳ để bảo vệ đàn vật nuôi và tối ưu hóa lợi nhuận.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ THÚY NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE BỔ TRỢ KEO PHÈN PHÒNG BÊNH PHÙ ĐẦU LỢN DO E.COLI DUNG HUYẾT GÂY RA THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Vũ Như Quán NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thúy i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Như Quán bộ môn Ngoại-Sản đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Ngoại-Sản, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến PGS. Cù Hữu Phú cùng toàn thể cán bộ công nhân viên tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin thuộc Công ty CP Đức Hạnh Marphavet đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thúy ii MỤC LỤC Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục sơ đồ hình ảnh.

viii Trích yếu luận văn………………………………………….ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu tổng quát.

Mục tiêu cụ thể. Phạm vi nghiên cứu. Thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu.

Một số hiểu biết về vi khuẩn E.2 Kháng nguyên.3 Các yếu tố gây bệnh. Đặc tính nuôi cấy, sinh vật, hoá học. Bệnh phù đầu do E. coli gây ra.

Phòng bệnh. Bệnh phù đầu ở lợn con. Các vacxin phòng bệnh phù đầu lợn. Các vacxin phòng bệnh phù đầu do E.

coli gây ra. Vacxin phòng bệnh do E. coli gây ra nhập khẩu. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu. Vi khuẩn sử dụng chế tạo vaccine vô hoạt phòng bệnh Phù đầu lợn lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vaccine.

Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu, sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh Phù đầu lợn. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp giám định vi khuẩn. Phương pháp giám định vi khuẩn. Phương pháp giám định vi khuẩn. Phương pháp giám định vi khuẩn.

Phương pháp giám định vi khuẩn. Phương pháp phân tích số liệu. Kết quả và thảo luận. Kết quả kiểm định giống E.

coli sản xuất vaccine. Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E. Kết quả kiểm tra serotype kháng nguyên O của vi khuẩn E.

Kết quả kiểm tra các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch 27 4. Quy trình sản xuất vaccine theo quy mô công nghiệp.

Giống vi khuẩn E. coli để sản xuất vaccine. Nhân giống vi khuẩn E. coli trên môi trường thạch máu.

Nhân giống vi khuẩn E. coli trên môi trường lỏng. Bổ sung keo phèn vào canh trùng.5 Giai đoạn đóng chai, dán nhãn vaccine. Quá trình bảo quản vaccine.3 Kết quả kiểm nghiệm vaccine sản xuất thử nghiệm.

Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vaccine sản xuất theo quy mô công nghiệp. Kết quả kiểm tra thuần khiết của canh trùng sử dụng chế tạo vaccine 34 4. Kết quả kiểm tra vô trùng của 3 lô vaccine sản xuất theo quy mô công nghiệp. Kết quả kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng.

Kết quả kiểm tra hiệu lực trên chuột nhăt trắng.6 Kết quả kiểm tra an toàn vaccine trên lợn. Kết quả thử hiệu lực vaccine trên lợn. Kết quả xác định liều tiêm vaccine Phù đầu lợn. Kết quả xác định độ dài miễn dịch của vaccine Phù đầu lợn.

Kết quả thử nghiệm vaccine trên diện rộng. Kết luận và kiến nghị. 45 Tài liệu tham khảo. 46 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ BHI : Brain Heart Infusion CFU : Colony Forming Unit Cs : Cộng sự DHL : Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA : DeoxyriboNucleic Acid ETEC : EnteroToxigenic E.

coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme - linked Immuno sorbant assay GDP : Guanin DiPhosphate GTP : Guanin TriPhosphate IHA : Indirect Haemagglutination test InvA : Invasion A LPS : LipoPolySaccharide PCR : Polymerase Chain Reaction RR : Relative Risk TSA : Tryptic Soya Agar TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam VX : Vaccine vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Các cặp mồi do công ty Fermentas cung cấp để xác định các yếu tố độc lực và bám dính của vi khuẩn E. Một số đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn E. Một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E.

Serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli nghiên cứu 26 Bảng 4. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E. coli mang các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh.

Độc lực của 10 chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch. Kết quả kiểm tra đậm độ các lô vaccine. Kết quả kiểm tra thuần khiết của 3 lô canh trùng sử dụng chế tạo vaccine.

Kết quả kiểm tra vô trùng của vaccine chế tạo. Kết quả kiểm tra an toàn vaccine trên chuột nhắt trắng. Kết quả kiểm hiệu lực vaccine trên chuột nhắt trắng. Kết quả kiểm tra an toàn vaccine trên lợn.

Kết quả đánh giá hiệu lực vaccine trên lợn. Kết quả xác định kháng thể ở lợn tiêm vaccine với liều tiêm khác nhau. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể trên lợn tiêm vaccine. 43 vii DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH Sơ đồ 4.

Quy trình sản xuất vaccine vô hoạt phù đầu lợn có bổ trợ keo phèn. Hình thái vi khuẩn E. coli mọc trên thạch máu. Hình thái vi khuẩn E.

coli soi trên kính hiển vi quang học. Cấy nhân giống vi khuẩn E. coli trên thạch máu. coli giống nhỡ được nuôi cấy trong tủ lắc.

Máy lên men sục khí 15 lít SATORIUS của CHLB Đức. Máy lên men sục khí 120 lit SATORIUS của CHLB Đức. Hệ thống ra chai tự động của Ý. Dây truyền dán nhãn tự động.

33 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Thị Thúy Tên luận văn: “Nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli dung huyết gây ra theo quy mô công nghiệp”. Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Đánh giá đươc quy trình sản xuất vaccine quy mô công nghiệp, quy trình kiểm nghiệm, sử dụng và bảo quản vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Phù đầu lợn do vi khuẩn E. coli dung huyết gây ra.

Phương pháp: Phương pháp giám định vi khuẩn Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn. Kết quả chính và kết luận: 1. 5 chủng vi khuẩn E. coli phân lập được sử dụng để chế vaccine phòng bệnh phù đầu cho lợn là đại diện cho các chủng vi khuẩn gây bệnh phù đầu lợn con trước và sau cai sữa tại các tỉnh, sau khi bảo quản thời gian dài dưới dạng thạch lỏng và đông khô, vẫn mang đầy đủ các đặc điểm sau: + Mang đầy đủ các đặc tính hình thái, nuôi cấy, sinh hóa như chủng gây bệnh trong tự nhiên.

+ Mang các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh ổn định sau khi lưu giữ sau thời gian dài ở thạch lỏng Glycerin và đông khô. + Có độc lực mạnh, gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 24 giờ. Các lô vaccine chế tạo trên quy mô công nghiệp đều đạt các chỉ tiêu về: + Phương pháp lên men sục khí canh trùng nuôi cấy đạt đậm độ vi 9 khuẩn: từ 17 x 10 vi khuẩn/ml. + Vô trùng bằng Formol 0,5% đạt kết quả 100% vô trùng khi kiểm tra trên các môi trường thạch máu, nước thịt, môi trường yếm khí và thạch nấm.

Các lô vaccine chế tạo trên quy mô công nghiệp đều đạt các chỉ tiêu sau: + Khi thử nghiệm trên chuột bạch, đạt chỉ tiêu an toàn 100% với liều tiêm 0.5ml/chuột với đường tiêm vào phúc xoang và hiệu lực bảo hộ đạt từ 70-90%. + Với liều tiêm gấp đôi và gấp ba liều tiêm miễn dịch: vaccine an toàn 100% với lợn từ 21 ngày tuổi. Vaccine khi được thử nghiệm trên diện rộng đạt chỉ tiêu an toàn cao với liều tiêm 1 ml/con và tạo được miễn dịch phòng hộ tốt. x THESIS ABSTRACT Master candidate: Hoang Thi Thuy Thesis title: Study on the production of vaccine adjuvant alum against head edema of pigs caused by E.coli in industrial scale.

Major: Veterinary Medicine Code: 60 64 01 01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives The study evaluates the vaccine production in industrial scale, test process, use and maintain of inactivated vaccine which supplemented with alum to prevent E. Research Methods Bacterial appraising methods Methods of identification of bacterial pathogens isolated by PCR The virulence test of bacteria on experimental animals Method produce vaccine to prevent head edema disease of pigs Test method for head edema disease of pigs. Main findings and conclusions 1. Five strains of isolated E.

coli used to create vaccine prevent head edema disease of pigs were representative stains of pre-weaning and post-weaning piglets in the provinces. After long time storage in the form of liquid and freeze dried, this stains still had all of the following characteristics: + Had morphological characteristics, culture, biochemical as pathogenic in nature.