Luận án tiến sĩ nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested pcr chẩn đoán nhiễm nấm c neoformans trong dịch não tủy

Luận án tiến sĩ nghiên cứu quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy.

Trường đại học

Viện Sốt Rét – Ký Sinh Trùng – Côn Trùng Trung Ương

Chuyên ngành

Ký Sinh Trùng Y Học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

Luận Án Tiến Sĩ Y Học

2019

168
1
0

Phí lưu trữ

45 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans

2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.2. Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

2.3. Phương pháp nghiên cứu

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.

3.2. Kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử dụng cho nghiên cứu

3.3. Kết quả thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.

3.4. Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.

3.5. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.

3.6. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy

4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

4.1. Bàn luận về kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình

4.2. Bàn luận về kết quả thiết kế/lựa chọn mồi và xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.

4.3. Bàn luận về độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy

4.4. Bàn luận về kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm

4.5. Bàn luận về kết quả đánh giá bộ sinh phẩm trong chẩn đoán nhiễm C. neoformans ở các mẫu DNT lâm sàng

5. CHƯƠNG 5: TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI

6. CHƯƠNG 6: Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested PCR chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans

Nghiên cứu về quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested PCR nhằm chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans là một bước tiến quan trọng trong y học. Kỹ thuật này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của nấm trong dịch não tủy, từ đó hỗ trợ trong việc điều trị bệnh cryptococcosis. Việc áp dụng công nghệ sinh học phân tử giúp nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán, giảm thiểu thời gian và chi phí cho bệnh nhân.

1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Cryptococcus neoformans

Nấm Cryptococcus neoformans là một loại nấm men có khả năng gây bệnh nghiêm trọng, đặc biệt ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch yếu. Nấm này thường được tìm thấy trong môi trường tự nhiên như đất và phân chim. Đặc điểm sinh học của nấm bao gồm khả năng hình thành nang và phát triển trong điều kiện môi trường khác nhau.

1.2. Vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans

Nấm Cryptococcus neoformans là nguyên nhân chính gây viêm màng não ở bệnh nhân HIV/AIDS. Bệnh cryptococcosis có thể dẫn đến tử vong nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Việc hiểu rõ vai trò y học của nấm này là cần thiết để phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả.

II. Thách thức trong chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans

Chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans gặp nhiều khó khăn do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy và soi tươi thường cho kết quả chậm và không chính xác. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn, ảnh hưởng đến kết quả điều trị. Do đó, cần thiết phải phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác hơn.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống

Các phương pháp như nuôi cấy thường mất nhiều thời gian và có tỷ lệ dương tính giả cao. Đặc biệt, trong trường hợp bệnh nhân đã sử dụng thuốc kháng nấm trước đó, khả năng nuôi cấy dương tính giảm đáng kể.

2.2. Tác động của việc chẩn đoán muộn đến sức khỏe bệnh nhân

Chẩn đoán muộn có thể dẫn đến tình trạng bệnh trở nặng, tăng nguy cơ tử vong và để lại di chứng nghiêm trọng. Việc phát hiện sớm nấm Cryptococcus neoformans là rất quan trọng để cải thiện tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân.

III. Phương pháp chế tạo bộ sinh phẩm nested PCR chẩn đoán nhiễm nấm

Quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested PCR bao gồm nhiều bước quan trọng từ thiết kế mồi đến tối ưu hóa điều kiện phản ứng. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại DNA của nấm Cryptococcus neoformans với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Việc chuẩn hóa quy trình là cần thiết để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của bộ sinh phẩm.

3.1. Thiết kế và chuẩn hóa mồi cho phản ứng PCR

Mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen đặc hiệu của nấm Cryptococcus neoformans. Việc chuẩn hóa nồng độ mồi là rất quan trọng để đạt được kết quả tối ưu trong phản ứng PCR.

3.2. Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR

Các điều kiện như nhiệt độ, thời gian và nồng độ các thành phần phản ứng cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất cho bộ sinh phẩm.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của bộ sinh phẩm

Kết quả nghiên cứu cho thấy bộ sinh phẩm nested PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans. Bộ sinh phẩm này đã được áp dụng thành công trong các bệnh viện, giúp cải thiện đáng kể khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh cryptococcosis.

4.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

Bộ sinh phẩm đã được kiểm tra và cho thấy độ nhạy lên đến 95% và độ đặc hiệu 90%, cho phép phát hiện chính xác nấm trong dịch não tủy.

4.2. Ứng dụng bộ sinh phẩm trong thực tiễn lâm sàng

Bộ sinh phẩm đã được sử dụng trong nhiều bệnh viện, giúp bác sĩ chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested PCR chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans đã mở ra hướng đi mới trong việc phát hiện và điều trị bệnh. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện hơn nữa độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm, đồng thời mở rộng ứng dụng cho các loại nấm khác.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong y học

Nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao khả năng chẩn đoán mà còn góp phần vào việc giảm thiểu tỷ lệ tử vong do bệnh cryptococcosis.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực chẩn đoán nấm

Cần tiếp tục phát triển các bộ sinh phẩm mới, cải tiến kỹ thuật PCR và mở rộng nghiên cứu sang các loại nấm gây bệnh khác để đáp ứng nhu cầu chẩn đoán trong y học.

27/07/2025

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans Giống nấm Cryptococcus có khoảng hơn 70 loài được định loại dựa vào hình thái nhưng loài gây bệnh chủ yếu là C. Bệnh do nấm C.

neoformans gây ra gọi là Cryptococcosis. Triệu chứng bệnh được Zenker miêu tả đầu tiên năm 1861, nhưng đến năm 1864, hai nhà bác học Busse và Buschkle người Đức đã phân lập và nuôi cấy được nấm C. neoformans từ bệnh nhân có triệu chứng giống như đã được Zenker miêu tả [18],[20],[21]. laurentii cũng có khả năng gây bệnh nhưng ít gặp [14].

Trước đây, người ta cho rằng nấm C. neoformans có 2 phân loài, đó là C. Hiện nay, người ta đã khẳng định có 3 phân giống C. gattii được cho là một loài riêng biệt gây bệnh ở những người bình thường với tên là C.

neoformans còn được gọi là Filobasidiella neoformans [16]. Đặc điểm sinh học của nấm C. Đặc điểm hình thể. neoformans là nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, được bao ngoài bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước nang thay đổi từ 2-40µm.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. neoformans nhuộm mực tàu, quan sát dưới kính hiển vi (Nguồ n: Day J. Môi trường sống Giống nấm Cryptococcus tồn tại trong môi trường tự do được Kutzing đặt tên năm 1833, mẫu phân lập được từ bụi kính cửa sổ. neoformans là sinh vật sống hoại sinh, ngoài cơ thể vật chủ, có thể sống tự do bên ngoài môi trường.

Nấm phân bố toàn cầu có thể tìm thấy trong chất thải của gia cầm, chim bồ câu, vẹt, yến. Trong các hang động, nước trái cây lên men, sữa, đường ruột của một số động vật ăn cỏ, trên cơ thể dơi, gián, trong đất và các hốc cây khác nhau. Nấm còn được tìm thấy trong thân gỗ mục của một số loài cây như: cây bạch đàn, cây cao su màu đỏ [13], [17], [18]. Tính chất nuôi cấy Khinghiên cứu nuôi cấy, phân lập, nấm C.

neoformans có thể mọc trên thạch Sabouraud dextrose, thạch máu cừu, thạch chocolate và các môi trường khác ở nhiệt độ từ 20-370C. Ở nhiệt độ này nấm bắt đầu mọc trong vòng khoảng 72 giờ, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 300C [19]. neoformans phát triển tốt trong môi trường chứa khoảng 5 % CO2, pH hơi kiềm và một lượng nhỏ chất sắt [20]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-370C, nấm C.

neoformans mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem, đường kính có thể đến vài milimet [20]. neoformans trên môi trường thạch Sabouraud (Nguồ n: trong nghiên cứu này, 2014) Các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ thẩm thấu, nồng độ CO2, độ pH ảnh hưởng tới sự phát triển của các bao ngoài… [21]. Nhiệt độ cao từ 39 - 400C hoặc quá thấp ức chế sự tăng trưởng của nấm. Nồng độ CO2 ở mức sinh lý làm tăng tổng hợp và kích thước bao ngoài, nồng độ CO2 cao các nang chỉ có kích thước nhỏ.

Môi trường có độ thẩm thấu cao (chứa glucose 16% hoặc NaCl 2,9%), hoặc pH acid sẽ làm giảm sản xuất các bao nang. Vai trò y học 1. Trên động vật Nấm C. neoformans có khả năng gây bệnh ở động vật, năm 1895 Sanfelice lần đầu tiên đã phát hiện và nuôi cấy được nấm C.

neoformans từ hệ bạch huyết của bò [13]. Năm 1902, Frothingham đã phân lập được nấm C. neoformans từ tổn thương trên phổi của ngựa tại Massachuset, Anh. Cùng với ghi nhận của Busse và Buschkle, các tác giả trên đã khẳng định nấm C.

neoformans có khả năng gây bệnh cả ở trên người và động vật Những nghiên cứu hiện nay chỉ ra C. neoformans có thể gă ̣p ở mèo, chó, thỏ, linh trưởng, chuô ̣t và mô ̣t số loa ̣i chim. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 Ở động vật có vú, bê ̣nh do C. neoformans thường liên quan đến tình trạng suy giảm miễn dịch như: mèo bị nhiễm một loại virus tương tự retrovirus, chuột thí nghiệm bi ̣ gây thiế u hu ̣t miễn dich… ̣ Ở chim bồ câu và các loài chim thường ít bi ̣ mắ c bê ̣nh do C.

neoformans do nhiệt độ cơ thể của chim cao 41°C–42°C. Tuy nhiên, người ta có thể tìm thấ y tế bào nấ m trong phân chim [13], [22]. Bệnh trên người Do tế bào nấm C. neoformans có thể có mặt trong không khí, trong đất và trong phân gia cầm nên người rấ t dễ bi nhiễ ̣ m loa ̣i nấ m này khi hít vào qua đường hô hấp.

Tuy nhiên, không phải cơ thể nào bi ̣nhiễm cũng biể u hiê ̣n thành bê ̣nh mà bê ̣nh thường biể u hiê ̣n ở những cơ thể có hê ̣ thố ng miễn dich ̣ bi ̣ tổ n thương như bệnh nhân AIDS, phải dùng các thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, ghép tạng, ghép tủy xương. Mức độ nặng của các triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào tình trạng suy giảm miễn dịch của cơ thể người nhiễm [3], [13], [15], [22]. - Bệnh gây tổn thương ở hệ thần kinh - Viêm màng não: Đây là bệnh thường gặp nhất. Bệnh thường diễn biến từ từ, các biểu hiện lâm sàng điển hình bao gồm: + Đau đầu, sốt, nôn, rối loạn hành vi, rối loạn cảm giác, đau và cứng gáy [23],[24],[25].

+ Rối loạn tâm thần bao gồm: mất phương hướng, lú lẫn, thay đổi nhân cách, mất trí nhớ, loạn thần, trạng thái sững sờ và hôn mê [23], [24]. + Các triệu chứng ít gặp hơn bao gồm: mất điều hòa, mất phản xạ, triệu chứng của tổn thương bó tháp, thất ngôn, chứng loạn vận ngôn và động kinh. + Các triệu chứng về mắt thường gặp là phù gai thị các triệu chứng không phổ biến như nhìn mờ, song thị, sợ ánh sáng và đau sau nhãn cầu, có thể mù [23], [24]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 - Viêm màng não - não: Ít gặp, bệnh tiến triển nhanh, thường tiến tới hôn mê và tử vong trong thời gian ngắn, đáp ứng kém với điều trị.

- U nấm trong não: Hiếm gặp, các tổn thương giả u rắn, khu trú. Triệu chứng giống khối phát triển trong não.Tổn thương não do C. neoformans (Nguồ n: British Journal of Radiology, 2009) A- Tổn thương não do C. neoformans trên CT sọ não B-Tổn thương não do C.

neoformans trên MRI sọ não - Bệnh gây tổn thương ở phổi Đường xâm nhập chính của nấm vào cơ thể vật chủ là qua đường hô hấp, do người bệnh hít phải các bào tử nấm phát tán trong không khí. Viêm phổi do nấm C. neoformans có các triệu chứng: Ho, đau ngực, khạc đờm, sút cân, sốt và ho ra máu [25]. Các triệu chứng khác hiếm thấy như khó thở, ra mồ hôi ban đêm, cản trở gây ứ trệ tĩnh mạch chủ trên.

Hình ảnh X-quang của viêm phối do nấm C. neoformans: Tổn thương điển hình là một hoặc nhiều nốt, không canci hóa, thâm nhiễm rốn phổi hoặc trung thất, thỉnh thoảng có tràn dịch màng phổi và đôi khi tạo hang. Thăm khám thường không đặc hiệu nhưng đôi khi có thể thấy thở nhanh, phổi có ran, hạch to, lách to…[22]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Hình ảnh tổn thương phổi do C. neoformans (Nguồ n: George R. Tổn thương phổi do nấm C. neoformans trên phim X-quang phổi B.

Tổn thương phổi do nấm C. neoformans trên CT phổi - Bệnh gây tổn thương ở da + Tổn thương nguyên phát: Loét, viêm mô tế bào [26]. + Tổn thương thứ phát: thường xuất hiện ở đầu, cổ dưới dạng sẩn, cục, mảng loét, áp xe, tổn thương dạng herpet, u mềm lây hoặc u Kaposi [26], [27]. Tổn thương da do nấm C.

neoformans (Nguồ n: Hari Kishan Kumar Yadalla và cs, 2011) [27] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 9 - Bệnh gây tổn thương ở các cơ quan khác: + Tổn thương xương: Tổn thương hủy xương, không có phản ứng màng xương, đau mơ hồ khi vận động, đôi khi có thể viêm khớp nhất là khớp gối [24]. + Hệ tiết niệu: C. neoformans thường phân lập được ở nước tiểu bệnh nhân bị bệnh lan tràn, đôi khi có dấu hiệu của viêm bể thận, viêm tiền liệt tuyến [24], [26]. + Tổn thương cơ quan khác: ở vỏ thượng thận, viêm nội tâm mạc, viêm gan, viêm xoang, tổn thương thực quản [24], [26].

Tình hình viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới và Việt Nam Viêm màng não do nấm C. neoformans là một trong những nhiễm trùng cơ hội quan trọng nhất ở bệnh nhân AIDS. Ở những nước có tỉ lệ nhiễm HIV/AIDS cao, C.

neoformans là nguyên nhân phổ biến gây viêm màng não, thường xuyên hơn cả phế cầu, não mô cầu [13], [28]. Ca bệnh viêm màng não do nấm C. neoformans đầu tiên trên thế giới được mô tả vào năm 1905 bởi Von Hansemann khi phát hiện nấm men trong các nang galentin ở não [13]. Như vậy khả năng xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương và gây bệnh của C.

neoformans đã được đề tập từ những năm đầu của thế kỷ 20, nhưng nó đòi hỏi người bác sỹ phải có nhiều năm kinh nghiệm lâm sàng để đánh giá mức độ thực sự xu hướng của bệnh. Viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới Năm 1956, Littman và Zimmerman đã xuất bản sách chuyên khảo về bệnh viêm màng não do nấm C. neoformans gây ra với những hiểu biết về đặc điểm lâm sàng, con đường truyền bệnh sau nửa thế kỷ bệnh được phát hiện.

Tại thời điểm đó trên toàn thế giới chỉ ghi nhận 300 trường hợp mắc bệnh. Trong những năm 1970, cùng với việc sử dụng rộng rãi các thuốc ức chế miễn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10 dịch trong điều trị bệnh đã làm cho tỷ lệ bệnh này tăng lên nhiều. Riêng trong năm 1976, ở Mỹ đã có 338 trường hợp bị mắc bệnh. Đặc biệt sau những năm 1980, tỷ lệ Cryptococcosis tăng mạnh cùng với việc xuất hiện của bệnh AIDS và được xem là yếu tố nguy cơ hàng đầu [13].

Từ cuối những năm 1970 đến đầu những năm 1980, người ta đã chứng kiến một sự gia tăng mạnh các trường hợp nhiễm nấm C. neoformans tại Kinshasa và ở những người Zairian nhập cư tại Châu Âu. Khi dịch HIV phát triển vào những năm 1980, nhiễm nấm C. neoformans nổi lên như một nhiễm trùng cơ hội quan trọng tại Mỹ, châu Âu và châu Úc, chiếm 5-10% số bệnh nhân AIDS.

Theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới, viêm màng não do nấm C. neoformans là bệnh chỉ điểm của AIDS. Trước khi có điều trị bằng ARV, thời gian sống trung bình của một bệnh nhân bị viêm màng não do nấm C.neoformans chỉ khoảng 9 tháng.

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ