Nghiên cứu qui trình Real-Time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người

Nghiên cứu qui trình real time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hằng
• Người hướng dẫn: TS.BS Bùi Tiến Sỹ
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng qui trình Real-Time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: Giới thiệu về Rickettsiaceae
• 1.1. Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae
• 1.2. Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra
• 1.3. Các vector lây truyền
• 1.4. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae
• 1.4.1. Spotted Fever Group
• 1.4.2. Scrub Typhus Group
• 1.5. Đặc điểm lâm sàng, cơ chế gây bệnh do Rickettsiaceae
• 1.5.1. Spotted fever Group
• 1.5.2. Scrub Typhus Group
• 1.6. Các phương pháp pháp chẩn đoán Rickettsiaceae
• 1.6.1. Phương pháp Weil – Felix
• 1.6.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập mầm bệnh
• 1.6.3. Phương pháp ELISA
• 1.6.4. Phương pháp kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
• 1.6.5. Phương pháp PCR, nested PCR
• 1.6.6. Phương pháp real-time PCR
• 1.7. Tình hình bệnh do Rickettsiaceae ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp thiết kế mồi, probe
• 2.5. Tách chiết ADN
• 2.6. Khuếch đại gen của vi khuẩn bằng phản ứng PCR
• 2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.8. Phương pháp giải trình tự xác định loài
• 2.9. Phương pháp nhân dòng
• 2.10. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR
• 2.11. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật real-time PCR
• 2.12. Áp dụng hai kĩ thuật real-time PCR để chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm O. tsutsugamushi và Rickettsia
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O. tsutsugamushi và các loài Rickettsia
• 3.2. Thiết kế primer, probe đặc hiệu cho phản ứng PCR, real-time PCR
• 3.3. Thiết kế plasmid chuẩn dương cho phản ứng real-time PCR
• 3.4. Đánh giá độ đặc hiệu của kĩ thuật real-time PCR
• 3.5. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật Real-time PCR
• 3.6. Ứng dụng real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae trên các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ
• 3.7. Một số đặc điểm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae
• 3.8. Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae bằng kỹ thuật real-time PCR
• 3.9. Một số đặc điểm của bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về qui trình Real Time PCR phát hiện Rickettsia

Qui trình Real-Time PCR là một phương pháp hiện đại trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm. Rickettsia là một nhóm vi khuẩn nội bào bắt buộc, có thể gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng. Việc phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn này là rất quan trọng để điều trị kịp thời và giảm thiểu tỷ lệ tử vong.

1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Rickettsia và bệnh do chúng gây ra

Rickettsia là một chi vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm ở người. Các bệnh này bao gồm sốt phát ban, sốt mò và nhiều bệnh khác. Đặc điểm của Rickettsia là chúng sống nội bào và thường được truyền qua côn trùng như ve, bọ chét. Việc hiểu rõ về đặc điểm của vi khuẩn này giúp nâng cao hiệu quả trong việc chẩn đoán và điều trị.

1.2. Tầm quan trọng của việc phát hiện sớm Rickettsia

Việc phát hiện sớm vi khuẩn Rickettsia là rất quan trọng trong việc điều trị bệnh. Nếu không được chẩn đoán kịp thời, bệnh có thể dẫn đến những biến chứng nghiêm trọng, thậm chí tử vong. Phương pháp Real-Time PCR giúp xác định nhanh chóng sự hiện diện của vi khuẩn, từ đó giúp bác sĩ có hướng điều trị phù hợp.

II. Thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia

Việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia gặp nhiều thách thức do tính chất nội bào của chúng. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn thường không hiệu quả. Hơn nữa, các triệu chứng lâm sàng của bệnh do Rickettsia gây ra thường dễ nhầm lẫn với các bệnh khác, dẫn đến chẩn đoán sai. Do đó, cần có những phương pháp chẩn đoán mới, hiệu quả hơn.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn hoặc huyết thanh học thường không cho kết quả chính xác. Chúng có thể mất nhiều thời gian và không thể phát hiện vi khuẩn trong giai đoạn đầu của bệnh. Điều này làm tăng nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân.

2.2. Sự cần thiết của phương pháp Real Time PCR

Phương pháp Real-Time PCR được phát triển để khắc phục những hạn chế của các phương pháp truyền thống. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp này cho phép phát hiện vi khuẩn Rickettsia trong thời gian ngắn, từ đó giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

III. Phương pháp Real Time PCR trong phát hiện Rickettsia

Phương pháp Real-Time PCR là một kỹ thuật tiên tiến trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia. Kỹ thuật này sử dụng phản ứng chuỗi polymerase để khuếch đại DNA của vi khuẩn, cho phép phát hiện ngay cả khi số lượng vi khuẩn trong mẫu rất ít. Điều này giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác trong chẩn đoán.

3.1. Nguyên lý hoạt động của Real Time PCR

Real-Time PCR hoạt động dựa trên nguyên lý khuếch đại DNA thông qua chuỗi phản ứng polymerase. Trong quá trình này, các tín hiệu huỳnh quang được phát ra khi DNA được khuếch đại, cho phép theo dõi quá trình này theo thời gian thực. Điều này giúp xác định nhanh chóng sự hiện diện của vi khuẩn Rickettsia.

3.2. Quy trình thực hiện Real Time PCR

Quy trình thực hiện Real-Time PCR bao gồm các bước như tách chiết DNA, thiết kế mồi và probe, khuếch đại DNA và phân tích kết quả. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả. Việc chuẩn bị mẫu bệnh phẩm cũng rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Kết quả nghiên cứu ứng dụng Real Time PCR

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp Real-Time PCR có thể phát hiện vi khuẩn Rickettsia trong các mẫu bệnh phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kết quả cho thấy phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh do Rickettsia gây ra, từ đó giúp nâng cao hiệu quả điều trị.

4.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của Real Time PCR

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Real-Time PCR đã được đánh giá thông qua các thử nghiệm lâm sàng. Kết quả cho thấy phương pháp này có thể phát hiện vi khuẩn Rickettsia ngay cả trong các mẫu có lượng vi khuẩn thấp, từ đó giúp nâng cao khả năng chẩn đoán.

4.2. Ứng dụng thực tiễn của Real Time PCR trong y tế

Phương pháp Real-Time PCR đã được áp dụng tại nhiều cơ sở y tế để chẩn đoán bệnh do Rickettsia. Việc phát hiện sớm vi khuẩn giúp bác sĩ có thể đưa ra phương pháp điều trị kịp thời, giảm thiểu biến chứng và tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về qui trình Real-Time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia đã mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán bệnh truyền nhiễm. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp này có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tỷ lệ tử vong. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện hơn nữa các phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh do Rickettsia gây ra.

5.1. Triển vọng phát triển các phương pháp chẩn đoán mới

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp chẩn đoán mới, kết hợp giữa Real-Time PCR và các kỹ thuật khác để nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia.

5.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức về bệnh Rickettsia

Nâng cao nhận thức về bệnh do Rickettsia gây ra là rất quan trọng. Cần có các chương trình giáo dục cộng đồng để giúp người dân hiểu rõ hơn về bệnh và cách phòng ngừa, từ đó giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae gây ra đang là một thách thức y tế toàn cầu nghiêm trọng với gánh nặng dịch tễ ngày càng gia tăng. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới và Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ, mỗi năm có khoảng 1 triệu trường hợp mắc bệnh sốt mò trên thế giới và hơn 1 tỷ người sinh sống tại các khu vực lưu hành đang đối mặt với nguy cơ lây nhiễm. Tại Hoa Kỳ, số ca bệnh thuộc nhóm sốt phát ban đốm đã tăng mạnh từ 424 ca năm 1993 lên 4.470 ca vào năm 2012 và duy trì mức trên 3.500 ca vào năm 2014. Tại miền Bắc Việt Nam, một nghiên cứu gần đây ghi nhận tỷ lệ nhiễm Rickettsia lên tới 9,14% (83/908 trường hợp), trong đó nhóm sốt phát ban đốm chiếm 6,5% và sốt mò chiếm 1,1%.

Khó khăn lớn nhất trong thực hành lâm sàng hiện nay là bệnh do Rickettsiaceae có biểu hiện ban đầu không đặc hiệu như sốt cấp tính, đau đầu, đau cơ, dễ bị chẩn đoán nhầm lẫn với sốt xuất huyết Dengue, sốt rét hoặc thương hàn. Nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời bằng kháng sinh đặc hiệu, bệnh có thể dẫn đến các biến chứng nguy hiểm như viêm màng não, viêm cơ tim, suy đa phủ tạng và tử vong. Trong khi đó, các phương pháp chẩn đoán truyền thống như phản ứng Weil-Felix có độ nhạy rất thấp (chỉ khoảng 33%) và độ đặc hiệu chỉ đạt 46%; phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) hay ELISA chỉ phát hiện được kháng thể sau từ 15 đến 26 ngày kể từ khi nhiễm khuẩn, làm mất đi thời điểm vàng để điều trị.

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn cấp bách đó, luận văn tập trung vào hai mục tiêu cốt lõi:

1. Xây dựng quy trình kỹ thuật Real-time PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện chính xác vi khuẩn Orientia tsutsugamushi và các loài thuộc chi Rickettsia.
2. Ứng dụng quy trình đã hoàn thiện để xác định căn nguyên gây bệnh trên 87 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh nhân nghi ngờ tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 trong giai đoạn từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 9 năm 2017.

Nghiên cứu mang ý nghĩa y học to lớn khi thiết lập được công cụ sinh học phân tử có khả năng phát hiện mầm bệnh ngay ở giai đoạn cấp tính (1-7 ngày đầu của bệnh) với thời gian trả kết quả chỉ trong khoảng 1 giờ 45 phút, giúp bác sĩ định hướng phác đồ kháng sinh sớm, giảm thiểu tỷ lệ biến chứng nặng và tử vong cho người bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng phân loại học vi sinh vật và sinh học phân tử hiện đại về họ Rickettsiaceae. Đây là nhóm vi khuẩn Gram âm ký sinh nội bào bắt buộc, có kích thước nhỏ (chiều rộng từ 0,3-0,5 µm, chiều dài từ 0,8-3,0 µm) và không có khả năng phát triển trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo thông thường. Về mặt phân loại, họ Rickettsiaceae được chia thành ba nhóm bệnh lý chính:

• Nhóm sốt phát ban đốm (Spotted Fever Group - SFG): Bao gồm 24 loài như Rickettsia rickettsii, R. akari, R. conorii lây truyền qua ve và bọ chét.
• Nhóm sốt phát ban dịch tễ (Typhus Group - TG): Do Rickettsia prowazekii và Rickettsia typhi lây truyền qua chấy, rận và bọ chét chuột.
• Nhóm sốt mò (Scrub Typhus Group - STG): Do loài duy nhất là Orientia tsutsugamushi gây ra, lây truyền qua ấu trùng mò Leptotrombidium.

Về mặt di truyền phân tử, hệ gen của chi Rickettsia có kích thước từ 1,0 đến 1,4 Mb chứa khoảng 900 đến 1.500 gen, trong đó gen gltA (mã hóa enzyme tổng hợp citrate synthetase) là vùng gen có tính bảo thủ cao nhất giữa các loài, rất lý tưởng để làm gen đích định danh toàn bộ chi. Đối với Orientia tsutsugamushi, hệ gen có kích thước từ 2,0 đến 2,7 Mb với 1.967 trình tự mã hóa; trong đó gen mã hóa kháng nguyên bề mặt đặc hiệu loài 56 kDa (TSA) có kích thước khung đọc mở khoảng 1.600 bp gồm 516-541 axit amin chứa bốn domain biến thể (VD I-IV), đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập tế bào chủ và là đích phân tử đặc hiệu nhất để nhận diện loài.

Cơ chế bệnh sinh của Rickettsiaceae dựa trên sự xâm nhập và nhân lên trong tế bào nội mô mạch máu, kích hoạt quá trình viêm quanh mạch máu nhỏ, làm tăng tính thấm thành mạch dẫn đến thoát dịch, giảm albumin huyết thanh và hạ huyết áp nghiêm trọng.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 87 mẫu bệnh phẩm (gồm mẫu máu toàn phần chống đông bằng EDTA và mô sinh thiết quanh vết loét hoại tử eschar) thu thập từ các bệnh nhân điều trị nội trú tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 từ tháng 6/2016 đến tháng 9/2017.

Phương pháp chọn mẫu: Nghiên cứu áp dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện có chủ đích dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng nghiêm ngặt:

• Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân sốt cấp tính có ít nhất một trong các triệu chứng điển hình như vết loét hoại tử đặc trưng (eschar), xung huyết, phát ban, sưng hạch ngoại vi, đau cơ dữ dội, hoặc bệnh nhân sốt cấp tính chưa rõ nguyên nhân sau 7 ngày nhập viện.
• Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân sốt do các nguyên nhân không nhiễm trùng (bệnh tự miễn, ung thư) hoặc đã có bằng chứng xác định nhiễm trùng khác như cấy máu dương tính, ký sinh trùng sốt rét dương tính, huyết thanh chẩn đoán sởi IgM dương tính hoặc Real-time PCR cúm dương tính.

Nhóm mẫu đối chứng bao gồm ADN tách chiết từ 9 chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp do Khoa Sinh học phân tử cung cấp (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Salmonella sp., Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus suis) và 1 mẫu ADN tách từ máu người khỏe mạnh.

Quy trình phân tích thực nghiệm bao gồm:

1. Tách chiết ADN bộ gen từ máu bằng bộ sinh phẩm thương mại cột silica và tách chiết từ mô bằng phương pháp Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol.
2. Thiết kế mồi và đầu dò TaqMan: Phân tích 15 trình tự gen 56 kDa và 54 trình tự gen gltA thu thập từ cơ sở dữ liệu GenBank bằng các phần mềm BioEdit và Clone Manager 9; áp dụng mã quy ước IUPAC tại các vị trí nucleotide đa hình để bao quát tối đa các biến chủng lưu hành.
3. Nhân dòng tạo chuẩn dương: Thực hiện phản ứng Nested PCR khuếch đại đoạn gen 56 kDa kích thước 725 bp và Semi-nested PCR khuếch đại gen gltA kích thước 520 bp từ 10 mẫu bệnh phẩm ban đầu (mã số SM1601 đến SM1610); tinh sạch sản phẩm và giải trình tự gen trên hệ thống máy mao quản CEQ 8800 để kiểm chứng độ tương đồng; sau đó gắn vào vector nhân dòng pTZ57R/T, biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α để tạo plasmid chuẩn dương pOri và pRick.
4. Tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR: Thiết lập chu trình nhiệt 45 chu kỳ (95°C trong 15 giây và 60°C trong 1 phút) với thời gian chạy tổng cộng là 1 giờ 45 phút, khuếch đại đoạn gen đích 109 bp cho O. tsutsugamushi và 83 bp cho Rickettsia.

Lý do lựa chọn phương pháp: Real-time PCR sử dụng công nghệ đầu dò TaqMan mang lại độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội so với PCR thông thường, loại bỏ hoàn toàn các bước điện di tốn thời gian, tránh nguy cơ ngoại nhiễm chéo aerosol trong phòng xét nghiệm và cho phép trả lời kết quả định tính lẫn định lượng nhanh chóng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã thu được các kết quả thực nghiệm có ý nghĩa khoa học và giá trị ứng dụng thực tiễn cao:

1. Thiết kế thành công các cặp mồi và đầu dò TaqMan đặc hiệu cao: Cặp mồi O.tsu108S-F/R kết hợp đầu dò huỳnh quang O.tsu108S-Pro nhắm vào gen 56 kDa cho sản phẩm khuếch đại 109 bp đặc hiệu cho O. tsutsugamushi; cặp mồi Rick.S-CS-F/R kết hợp đầu dò Rick.S-CS-Pro1 nhắm vào gen gltA cho sản phẩm khuếch đại 83 bp đặc hiệu cho các loài Rickettsia.
2. Tạo dòng thành công plasmid chuẩn dương pOri và pRick: Giải trình tự sản phẩm PCR vòng 2 của mẫu SM1604 và SM1608 cho thấy độ tương đồng 100% với trình tự tham chiếu của O. tsutsugamushi và Rickettsia trên GenBank. Các plasmid tái tổ hợp sau khi tách chiết đã được kiểm tra bằng cặp mồi vector M13, đảm bảo độ tinh sạch và nồng độ chuẩn cho các thử nghiệm tiếp theo.
3. Đạt độ đặc hiệu phân tích tuyệt đối 100%: Khi thử nghiệm phản ứng Real-time PCR trên 9 chủng vi khuẩn gây bệnh không thuộc họ Rickettsiaceae và mẫu máu người khỏe mạnh, hoàn toàn không xuất hiện tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng nền. Tín hiệu khuếch đại chỉ xuất hiện duy nhất ở các giếng chứa ADN của O. tsutsugamushi, Rickettsia hoặc plasmid chuẩn tương ứng.
4. Độ nhạy và độ lặp lại cao: Đánh giá trên dải nồng độ pha loãng từ 10.000 bản sao xuống 1 bản sao/µl với 50 phản ứng lặp lại cho thấy đường chuẩn tuyến tính đạt hệ số tương quan rất cao (R² > 0,99). Kỹ thuật có khả năng phát hiện ổn định ở ngưỡng nồng độ thấp từ 1 đến 2 bản sao/µl phản ứng.
5. Ứng dụng chẩn đoán hiệu quả trên mẫu lâm sàng: Áp dụng quy trình trên 87 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ đã phát hiện chính xác các trường hợp dương tính với O. tsutsugamushi và Rickettsia, mang lại tỷ lệ chẩn đoán xác định căn nguyên vượt trội so với các phương pháp huyết thanh học truyền thống.

Thảo luận kết quả

Về cơ chế phân tử, độ đặc hiệu vượt trội của phản ứng Real-time PCR được đảm bảo bởi ba cấu phần nhận diện bổ sung: hai đoạn mồi xuôi - ngược và một đầu dò TaqMan đặc hiệu. Trong giai đoạn kéo dài ở 60°C, hoạt tính 5'-3' exonuclease của enzyme Taq DNA polymerase tiến hành phân cắt đầu dò TaqMan đã lai với mạch khuôn, giải phóng phân tử phát huỳnh quang FAM khỏi phân tử hấp phụ huỳnh quang quencher ở đầu 3', từ đó phát ra tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao ADN được tổng hợp sau mỗi chu kỳ.

Khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế, phát hiện của luận văn hoàn toàn tương đồng với báo cáo của một nghiên cứu gần đây năm 2011, trong đó kỹ thuật PCR khuếch đại gen 56 kDa đạt độ đặc hiệu 100%, vượt xa phương pháp ELISA (độ đặc hiệu 73%) và phản ứng Weil-Felix (độ đặc hiệu 94%). Nghiên cứu của một nhóm tác giả năm 2015 cũng chỉ ra rằng phương pháp huyết thanh học IFA ghi nhận tới 5/24 trường hợp dương tính giả ở bệnh nhân sốt Dengue do phản ứng chéo kháng thể, trong khi Real-time PCR cho kết quả âm tính chính xác 100%.

Trong quá trình phân tích số liệu, dữ liệu thực nghiệm được hiển thị trực quan thông qua hai dạng biểu đồ chuẩn:

• Biểu đồ đường cong khuếch đại huỳnh quang (Amplification Plot): Biểu diễn sự gia tăng cường độ tín hiệu huỳnh quang dR theo số chu kỳ nhiệt (từ chu kỳ 1 đến 45), giúp xác định chính xác giá trị chu kỳ ngưỡng Ct của từng mẫu bệnh phẩm.
• Đồ thị đường chuẩn hồi quy tuyến tính (Standard Curve): Biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa giá trị Ct và logarit nồng độ plasmid chuẩn (từ 10 đến 10.000 bản sao), qua đó cho phép định lượng chính xác tải lượng vi khuẩn ban đầu trong mẫu máu hoặc mô của bệnh nhân.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm đã đạt được, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể nhằm nâng cao năng lực chẩn đoán và điều trị bệnh do Rickettsiaceae:

1. Chuẩn hóa và đóng gói quy trình xét nghiệm thành bộ sinh phẩm thương mại: Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 cần phối hợp với các đơn vị sản xuất sinh phẩm y tế hoàn thiện quy trình Real-time PCR dạng phản ứng kép (duplex Real-time PCR) trong vòng 12 tháng tới. Mục tiêu đạt giới hạn phát hiện dưới 5 bản sao ADN/phản ứng và duy trì độ đặc hiệu 100%, tạo điều kiện sẵn sàng triển khai tại các phòng xét nghiệm đạt chuẩn ISO 15189.
2. Mở rộng đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các bệnh viện tuyến dưới: Bộ Y tế và các bệnh viện tuyến trung ương cần xây dựng chương trình tập huấn, chuyển giao công nghệ xét nghiệm Real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae cho 100% bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh tại các khu vực trọng điểm sốt mò (miền núi phía Bắc, miền Trung, Tây Nguyên) trong giai đoạn 18 đến 24 tháng. Mục tiêu nâng tỷ lệ chẩn đoán đúng căn nguyên sốt mò lên trên 85% ngay tại cơ sở y tế địa phương.
3. Thiết lập mạng lưới giám sát dịch tễ học phân tử quốc gia: Cục Y tế Dự phòng phối hợp với Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương định kỳ hàng quý thu thập mẫu giám sát từ động vật chân đốt (bọ mò, bọ ve, bọ chét) và bệnh nhân nghi ngờ tại các vùng lưu hành. Thực hiện giải trình tự gen gltA và gen 56 kDa để xây dựng bản đồ dịch tễ học phân tử và theo dõi sự xuất hiện của các biến chủng mới trên phạm vi cả nước từ năm 2024 đến năm 2026.
4. Cập nhật hướng dẫn chẩn đoán và điều trị lâm sàng sớm: Hội Truyền nhiễm Việt Nam cần bổ sung chỉ định xét nghiệm Real-time PCR vào phác đồ chẩn đoán sốt cấp tính chưa rõ nguyên nhân. Khuyến cáo các bác sĩ lâm sàng chủ động sử dụng kháng sinh Doxycycline (liều 100 mg x 2 lần/ngày trong 5-7 ngày) ngay trong vòng 24 giờ đầu khi có kết quả xét nghiệm phân tử dương tính, hướng tới mục tiêu giảm tỷ lệ biến chứng nặng xuống dưới 3% và tỷ lệ tử vong do sốt mò xuống dưới 0,5%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn là nguồn tài liệu chuyên môn giá trị cho 4 nhóm đối tượng chính sau:

1. Bác sĩ chuyên khoa Truyền nhiễm và Hồi sức cấp cứu: Cung cấp cơ sở khoa học để nhận biết sớm các dấu hiệu lâm sàng gợi ý sốt mò và sốt phát ban đốm; hiểu rõ giá trị và thời điểm chỉ định xét nghiệm Real-time PCR trong tuần đầu của bệnh nhằm phân biệt chính xác với các bệnh nhiễm trùng cấp tính khác, từ đó chỉ định phác đồ Doxycycline kịp thời và hiệu quả.
2. Kỹ thuật viên xét nghiệm và cán bộ nghiên cứu Sinh học phân tử: Cung cấp quy trình chi tiết, từng bước từ tách chiết ADN mẫu máu/mô, thiết kế mồi suy biến theo danh pháp IUPAC, kỹ thuật tạo plasmid chuẩn dương pOri/pRick trên vector pTZ57R/T đến tối ưu hóa điều kiện phản ứng Real-time PCR 45 chu kỳ để ứng dụng trực tiếp tại phòng xét nghiệm.
3. Nhà nghiên cứu Dịch tễ học và Ký sinh trùng học y học: Cung cấp bức tranh toàn diện về đặc điểm sinh học, vector truyền bệnh (ấu trùng mò Leptotrombidium, ve, bọ chét), ổ chứa tự nhiên và phân bố dịch tễ học của các nhóm vi khuẩn Rickettsiaceae tại Việt Nam và khu vực Đông Nam Á, phục vụ công tác dự báo và kiểm soát dịch bệnh.
4. Học viên cao học, nghiên cứu sinh và sinh viên khối ngành Y Dược, Công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp luận nghiên cứu thực nghiệm y sinh, kỹ thuật nhân dòng phân tử, giải trình tự Sanger và phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán phân tử.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao phản ứng huyết thanh học Weil-Felix không còn được ưu tiên trong chẩn đoán Rickettsiaceae? Phản ứng Weil-Felix dựa trên hiện tượng ngưng kết chéo giữa kháng thể kháng Rickettsia với kháng nguyên của vi khuẩn Proteus. Phương pháp này có độ nhạy rất thấp (chỉ khoảng 33%) và độ đặc hiệu chỉ đạt 46%, dễ gây ra kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả nghiêm trọng. Do đó, các hiệp hội y khoa khuyến cáo thay thế bằng xét nghiệm phân tử Real-time PCR có độ đặc hiệu 100%.

Gen gltA và gen 56 kDa đóng vai trò gì trong phản ứng Real-time PCR của nghiên cứu? Gen gltA mã hóa enzyme citrate synthetase có trình tự nucleotide bảo thủ cao giữa các loài trong chi Rickettsia, giúp nhận diện bao quát nhóm sốt phát ban đốm và sốt phát ban dịch tễ. Ngược lại, gen 56 kDa mã hóa protein màng ngoài đặc hiệu chỉ có ở Orientia tsutsugamushi, giúp định danh chính xác tác nhân gây bệnh sốt mò mà không nhầm lẫn với các vi khuẩn khác.

Kỹ thuật Real-time PCR trong luận văn rút ngắn thời gian chẩn đoán như thế nào? Phương pháp Real-time PCR hoàn tất quá trình khuếch đại và đọc tín hiệu huỳnh quang trong 1 giờ 45 phút, cho kết quả ngay trong ngày nhập viện. Ngược lại, phương pháp nuôi cấy tế bào mất từ 30 đến 60 ngày và đòi hỏi an toàn sinh học cấp cao, còn xét nghiệm kháng thể ELISA/IFA phải đợi từ 15 đến 26 ngày sau khởi phát bệnh mới xuất hiện hiệu giá kháng thể.

Kháng sinh nào được khuyến cáo điều trị hàng đầu khi có kết quả xét nghiệm dương tính? Doxycycline là kháng sinh lựa chọn hàng đầu cho tất cả các nhóm bệnh do Rickettsiaceae gây ra, với phác đồ uống viên 100 mg x 2 lần/ngày trong 5 đến 7 ngày. Thuốc có khả năng hấp thu tốt, thời gian bán thải kéo dài và mang lại hiệu quả cắt sốt nhanh chóng trong vòng 24 đến 48 giờ. Đối với phụ nữ mang thai, Azithromycin liều đơn 500 mg có thể được xem xét thay thế.

Quy trình Real-time PCR này kiểm soát nguy cơ dương tính giả và âm tính giả bằng cách nào? Quy trình sử dụng hệ thống ống phản ứng kín hoàn toàn, loại bỏ bước mở nắp điện di giúp triệt tiêu nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm PCR. Đồng thời, nghiên cứu bổ sung mẫu nội chuẩn (Internal Quality Control) trong quá trình tách chiết để kiểm soát hiện tượng ức chế phản ứng (âm tính giả) và sử dụng chứng âm H2O vô trùng để phát hiện nhiễm bẩn hóa chất (dương tính giả).

Kết luận

• Luận văn đã thiết kế thành công hai bộ mồi và đầu dò TaqMan chuyên biệt trên gen 56 kDa (sản phẩm 109 bp) và gen gltA (sản phẩm 83 bp), phát hiện chính xác Orientia tsutsugamushi và các loài thuộc chi Rickettsia.
• Chế tạo và thẩm định thành công hai plasmid chuẩn dương tái tổ hợp pOri và pRick trên vector pTZ57R/T, làm vật liệu chuẩn định lượng nồng độ bản sao vi khuẩn.
• Chứng minh độ đặc hiệu phân tích đạt 100% khi thử nghiệm đối chứng trên 9 chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp và mẫu máu người khỏe mạnh, hoàn toàn không xảy ra phản ứng chéo.
• Xác lập độ nhạy phân tích cao với giới hạn phát hiện đạt từ 1 đến 2 bản sao/µl và đường chuẩn tuyến tính đạt hệ số tương quan R² > 0,99 qua 50 phản ứng lặp lại.
• Ứng dụng thành công quy trình trên 87 mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn 1 giờ 45 phút.

Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới, quy trình cần tiếp tục được đánh giá trên các cỡ mẫu lâm sàng lớn hơn tại nhiều trung tâm y tế trên cả nước và đóng gói thành bộ kit chẩn đoán tiện dụng. Các đơn vị y tế và nhà nghiên cứu quan tâm có thể liên hệ trực tiếp với tác giả hoặc Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 để tiếp nhận chuyển giao quy trình kỹ thuật, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị bệnh truyền nhiễm tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh truyền nhiễm luôn nhận được sự quan tâm của nền y tế toàn cầu. Những mầm bệnh trước đây đã được kiểm soát nhưng nay thường xuyên biến đổi kết hợp với các căn nguyên mới xuất hiện gây khó khăn cho kiểm soát dịch bệnh cũng như điều trị bệnh truyền nhiễm. Theo CDC 4470 ca bệnh Spotted fever group được báo cáo ở Mỹ năm 2012, 18000 trường hợp Scrub typhus group (sốt mò) được báo cáo trong chiến tranh thế giới thứ II. Trong thời gian gần đây, ước tính mỗi năm có khoảng 1 triệu trường hợp sốt mò và có tới 1 tỷ người sống trong các vùng lưu hành bệnh có nguy cơ lây nhiễm thì Rickettsia là căn nguyên gây bệnh đáng được chú ý.

Rickettsia được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn nội bào bắt buộc không thể nhận dạng bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Dựa trên đặc điểm hình thái, kháng nguyên, và chuyển hóa, Rickettsia được phân loại thành các nhóm sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus Group (STG). Dựa vào các tác nhân gây bệnh khác nhau cùng với các cơ chế lan truyền, phân bố địa lý, sự hạn chế trong việc chẩn đoán, tình hình dịch tễ học và đánh giá về mức độ nghiêm trọng của bệnh do Rickettsiaceae gây ra trong khu vực Đông Nam Á được xem là một thách thức khó khăn. Hàng trăm trường hợp tử vong và hàng ngàn trường hợp nhiễm bệnh đã không được chẩn đoán.

Việc chẩn đoán bệnh do Rickettsiaceae ở Việt Nam vẫn chủ yếu dựa vào lâm sàng và yếu tố dịch tễ. Bệnh do Rickettsiaceae có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng dễ nhầm lẫn với nhiều bệnh truyền nhiễm khác. Thêm vào đó, bệnh có thể để lại những biến chứng thần kinh nặng nề và có thể gây tử vong cho bệnh nhân. Do vậy, chẩn đoán xác định căn nguyên gây bệnh sớm và chính xác để điều trị sớm có ý nghĩa rất lớn.

Các xét nghiệm chẩn đoán mầm bệnh đã được áp dụng như phương pháp huyết thanh học (phản ứng Weil – Felix), nhưng phương pháp này còn nhiều hạn chế, chỉ chẩn đoán được một vài loài nhất định và dễ xảy ra các phản ứng chéo gây sai lệch kết quả. Phương pháp phân lập mầm bệnh bằng tiêm truyền mầm bệnh, phương pháp này nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn trong tế bào động vật rất khó và nguy LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] hiểm cho người thực hiện thí nghiệm. Các phương pháp gần đây như ELISA, IFA thao tác dễ, tiết kiệm chi phí, tuy nhiên các phương pháp này chẩn đoán được khi thời gian nhiễm vi khuẩn từ 15-26 ngày, hạn chế trong việc chẩn đoán sớm. Từ đó đặt ra nhu cầu cần những phương pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thời gian trả lời kết quả sớm.

Phương pháp real-time PCR trong chẩn đoán Rickettsiaceae gây bệnh ở người đã cho những kết quả khả quan. Phương pháp này sẽ giúp xác định sớm, chính xác mầm bệnh, định hướng thầy thuốc lâm sàng điều trị đặc hiệu kịp thời, làm giảm tỷ lệ biến chứng và tử vong của bệnh do Rickettsiaceae. Chính vì những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình real-time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người.” Với hai mục tiêu chính: 1. Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O.

tsutsugamushi và các loài Rickettsia. Áp dụng kĩ thuật real-time PCR xác định các mầm bệnh gây sốt Rickettsiaceae trên mẫu bệnh phẩm thu thập được tại Bệnh viện Trung ương quân đội 108 từ tháng 6/2016 - tháng 9/2017. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1. Giới thiệu về Rickettsiaceae 1.

Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae Rickettsia được biết đến như là các căn nguyên gây bệnh ở động vật có xương sống với các vectơ truyền bệnh thuộc nhóm động vật chân đốt. Trước đây Rickettsia được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn không thể nhận dạng bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Rickettsia được đặt tên sau khi nhà bệnh học Howard Taylor Ricketts phát hiện ra mầm bệnh sốt phát ban (1906) và ông bị chết vì nhiễm bệnh này trong thời gian nghiên cứu [20]. Bằng sự phát triển của các kỹ thuật phân tử gần đây, sự phân loại các loài Rickettsia có sự thay đổi lớn.

Rickettsia tsutsugamushi đã được chứng minh đủ điều kiện để phân loại thành một chi mới là Orientia [65]. Dựa trên đặc điểm hình thái, kháng nguyên và chuyển hóa, Rickettsia được phân loại thành hai nhóm bệnh: Spotted Fever Group (SFG) và Typhus Group (TG); Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay còn gọi là bệnh sốt mò ở Việt Nam. Theo nghiên cứu của Bechah và cộng sự (2008), chi Rickettsia có 24 loài gây bệnh và Orientia chỉ có một loài duy nhất là Orientia tsutsugamushi (Rickettsia tsutsugamushi). Phân loại các loài Rickettsiaceae được thể hiện như hình 1.1: Phân loại Rickettsiaceae 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2: Hình ảnh Rickettsia trong tế bào vật chủ [71] Các vi khuẩn trong chi Rickettsia là các loài sống nội bào bắt buộc có chiều dài khoảng 0,8 - 2,0 µm, chiều rộng khoảng 0,3 - 0,5 µm, đa hình thái, hình dạng thay đổi qua các giai đoạn phát triển: cầu khuẩn đứng riêng rẽ hoặc thành từng đôi có khi xếp thành chuỗi ngắn hoặc từng đám trong hoặc ngoài tế bào.

Tế bào chất của các vi khuẩn này chứa ribosome, các sợi ADN và được bao bọc bởi cấu trúc của tế bào Gram âm điển hình với một lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide ở màng ngoài, nhưng không có tiên mao [53]. Bộ gene của các loài thuộc Rickettsia là một ADN đơn dạng vòng, có kích thước lên đến 1-1,4Mbp. Có khoảng 900 - 1500 gene tùy loài, trong đó có 704 protein và 39 RNA chung cho tất cả các loài [4, 45]. Gen đầu tiên được sử dụng cho mục đích phát sinh loài là 16S rDNA [55].

Sau đó, nghiên cứu phát sinh loài dựa trên các trình tự gen khác bao gồm gltA (gen mã hóa tổng hợp citrate) [57], gen mã hóa protein 17kDa [3] và nhóm gen kháng nguyên bề mặt tế bào (SCA): ompA, ompB, sca4, sca1 và sca2 [18, 44, 56, 43]. Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự gen mã hóa protein 17kDa không cho nhiều giá trị ý nghĩa. Ngược lại, dựa trên trình tự gen gltA có thể xây dựng mối quan hệ phát sinh loài. tsutsugamushi là vi khuẩn có chiều rộng khoảng 0,5 µm và chiều dài từ 1,2 đến 3,0µm, lớn hơn so với các vi khuẩn nhóm SFG và TG [24].

Hơn nữa cấu tạo tế bào của O. tsutsugamushi bị thiếu lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide khác với các loài Rickettsia khác [2]. tsutsugamushi có kích thước hệ gen dao động từ 2,0 đến 2,7 Mb bao gồm 1967 trình tự mã hóa protein và khoảng 46,7% là các trình tự lặp lại [41]. tsutsugamushi chứa nhiều biến thể kháng nguyên, bao gồm Gilliam, 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Kato, Karp, Kawasaki, Kuroki và các loại khác.

Sự thay đổi kháng nguyên này phụ thuộc phần lớn vào sự đa dạng của kháng nguyên đặc hiệu loài 56kDa (TSA) nằm trên bề mặt của màng vi khuẩn [52]. Với một khung đọc mở (ORF) là 1600 bp, TSA 56kDa gồm có 516-541 amino axit và tham gia vào việc xâm nhập vào tế bào chủ thông qua sự kết hợp của fibronektyin. Có bốn domain biến thể trong vùng này, các domain biến thể (VD) I-IV, chịu trách nhiệm về mức độ biến đổi kháng nguyên lớn ở gen [37]. Họ vi khuẩn Rickettsiaceae sinh sản bằng hình thức chia đôi giống như vi khuẩn.

Tuy nhiên tốc độ sinh sản chậm so với vi khuẩn và virut khác. Trong nuôi cấy tế bào, thời gian 1 thế hệ là 8-10 giờ ở nhiệt độ 32-35oC [53]. Dịch tễ học của các bệnh ở người do Rickettsiaceae gây ra liên quan đến đặc điểm sinh học của vectơ truyền bệnh. Bệnh do Rickettsiaceae rất khác nhau ở mức độ nghiêm trọng từ bệnh nhẹ không cần điều trị đến việc nhiễm trùng đe dọa tính mạng.

Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra Các bệnh gây ra bởi các sinh vật trong nhóm Rickettsiaceae được công nhận và có thể được chia thành 3 nhóm bệnh sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus Group (STG) [73]. - Nhóm bệnh SFG được chia theo từng bệnh như sau: Rocky Mountain spotted fever (RMSF) do Rickettsia rickettsii gây bệnh; Rickettsialpox do Rickettsia akari gây ra; Boutonneuse fever,… - Nhóm bệnh TG có đặc điểm dịch tễ học giống nhau, do các loài vi khuẩn Rickettsia prowazekii và Rickettsia typhi là căn nguyên gây bệnh chính: Louse- borne typhus, Brill-Zinsser disease, Murine typhus,… - Tác nhân gây bệnh sốt mò (STG) chỉ có một loài duy nhất là O. tsutsugamushi, có ba kiểu huyết thanh học chủ yếu là Karp, Gilliam, Kato. Các vector lây truyền Vật chủ mà Rickettsiaceae kí sinh rất đa dạng, tất cả các loài đều có liên quan đến động vật chân đốt.

Một số loài Rickettsiaceae có thể lan truyền trong động vật có xương sống, một số loài gây bệnh ở người và động vật, do chúng lây truyền 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] bởi các động vật chân đốt như bọ chét, chấy, chấy hoặc ve và hiện nay các loài Rickettsiaceae đã được công bố gần như trên toàn thế giới [49]. Cho đến nay ve, rận và bọ chét trong giới Ixodidea, Phtiraptera, và Siphonaptera tương ứng được biết đến như là các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia. Năm 2012, Socolovschi và cộng sự cho rằng muỗi cũng là một trong số các vector lây truyền R. felis đáng chú ý [62].

Mò Leptotrombidium là vector truyền bệnh của vi khuẩn thuộc chi Orientia [25]. Động vật chân đốt đồng thời cũng là ổ chứa và nơi nhân lên của vi khuẩn chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc lây lan. Tuy nhiên cách thức lây truyền từ động vật chân đốt sang người là khác nhau. Vi khuẩn lây nhiễm vào vật chủ qua nước bọt, vết đốt của côn trùng như ve, bét, chấy rận hoặc mò mạt.

Ngoài ra chúng còn được truyền qua phân qua vết xước ở da vật chủ [50]. Rickettsia và Orientia lây nhiễm sang các tế bào da như lớp nội mạc mạch máu (tế bào bị nhiễm chính), nguyên bào sợi, tế bào nội mô bạch huyết và đại thực bào.3: Các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia [38] Các loài Rickettsiaceae được duy trì trong tự nhiên bằng cách truyền trực tiếp hay gián tiếp tới những con bọ không nhiễm bệnh thông qua đường ruột những con bọ này khi đốt nhưng loài gặm nhấm hay động vật khác bị nhiễm Rickettsiaceae (hình 1. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.4: Chu kỳ nhiễm bệnh Sốt Mò 1. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae.

Bệnh sốt do Rickettsiaceae được tìm thấy ở mọi châu lục trừ Nam Cực [17] Hình 1.5: Phân bố các loài Rickettsiaceae gây bệnh.