Nghiên cứu qui trình Real-Time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người

Nghiên cứu qui trình real time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hằng
• Người hướng dẫn: TS.BS Bùi Tiến Sỹ
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng qui trình Real-Time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: Giới thiệu về Rickettsiaceae
• 1.1. Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae
• 1.2. Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra
• 1.3. Các vector lây truyền
• 1.4. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae
• 1.4.1. Spotted Fever Group
• 1.4.2. Scrub Typhus Group
• 1.5. Đặc điểm lâm sàng, cơ chế gây bệnh do Rickettsiaceae
• 1.5.1. Spotted fever Group
• 1.5.2. Scrub Typhus Group
• 1.6. Các phương pháp pháp chẩn đoán Rickettsiaceae
• 1.6.1. Phương pháp Weil – Felix
• 1.6.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập mầm bệnh
• 1.6.3. Phương pháp ELISA
• 1.6.4. Phương pháp kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
• 1.6.5. Phương pháp PCR, nested PCR
• 1.6.6. Phương pháp real-time PCR
• 1.7. Tình hình bệnh do Rickettsiaceae ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp thiết kế mồi, probe
• 2.5. Tách chiết ADN
• 2.6. Khuếch đại gen của vi khuẩn bằng phản ứng PCR
• 2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.8. Phương pháp giải trình tự xác định loài
• 2.9. Phương pháp nhân dòng
• 2.10. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR
• 2.11. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật real-time PCR
• 2.12. Áp dụng hai kĩ thuật real-time PCR để chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm O. tsutsugamushi và Rickettsia
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O. tsutsugamushi và các loài Rickettsia
• 3.2. Thiết kế primer, probe đặc hiệu cho phản ứng PCR, real-time PCR
• 3.3. Thiết kế plasmid chuẩn dương cho phản ứng real-time PCR
• 3.4. Đánh giá độ đặc hiệu của kĩ thuật real-time PCR
• 3.5. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật Real-time PCR
• 3.6. Ứng dụng real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae trên các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ
• 3.7. Một số đặc điểm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae
• 3.8. Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae bằng kỹ thuật real-time PCR
• 3.9. Một số đặc điểm của bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về qui trình Real Time PCR phát hiện Rickettsia

Qui trình Real-Time PCR là một phương pháp hiện đại trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm. Rickettsia là một nhóm vi khuẩn nội bào bắt buộc, có thể gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng. Việc phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn này là rất quan trọng để điều trị kịp thời và giảm thiểu tỷ lệ tử vong.

1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Rickettsia và bệnh do chúng gây ra

Rickettsia là một chi vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm ở người. Các bệnh này bao gồm sốt phát ban, sốt mò và nhiều bệnh khác. Đặc điểm của Rickettsia là chúng sống nội bào và thường được truyền qua côn trùng như ve, bọ chét. Việc hiểu rõ về đặc điểm của vi khuẩn này giúp nâng cao hiệu quả trong việc chẩn đoán và điều trị.

1.2. Tầm quan trọng của việc phát hiện sớm Rickettsia

Việc phát hiện sớm vi khuẩn Rickettsia là rất quan trọng trong việc điều trị bệnh. Nếu không được chẩn đoán kịp thời, bệnh có thể dẫn đến những biến chứng nghiêm trọng, thậm chí tử vong. Phương pháp Real-Time PCR giúp xác định nhanh chóng sự hiện diện của vi khuẩn, từ đó giúp bác sĩ có hướng điều trị phù hợp.

II. Thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia

Việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia gặp nhiều thách thức do tính chất nội bào của chúng. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn thường không hiệu quả. Hơn nữa, các triệu chứng lâm sàng của bệnh do Rickettsia gây ra thường dễ nhầm lẫn với các bệnh khác, dẫn đến chẩn đoán sai. Do đó, cần có những phương pháp chẩn đoán mới, hiệu quả hơn.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn hoặc huyết thanh học thường không cho kết quả chính xác. Chúng có thể mất nhiều thời gian và không thể phát hiện vi khuẩn trong giai đoạn đầu của bệnh. Điều này làm tăng nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân.

2.2. Sự cần thiết của phương pháp Real Time PCR

Phương pháp Real-Time PCR được phát triển để khắc phục những hạn chế của các phương pháp truyền thống. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp này cho phép phát hiện vi khuẩn Rickettsia trong thời gian ngắn, từ đó giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

III. Phương pháp Real Time PCR trong phát hiện Rickettsia

Phương pháp Real-Time PCR là một kỹ thuật tiên tiến trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia. Kỹ thuật này sử dụng phản ứng chuỗi polymerase để khuếch đại DNA của vi khuẩn, cho phép phát hiện ngay cả khi số lượng vi khuẩn trong mẫu rất ít. Điều này giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác trong chẩn đoán.

3.1. Nguyên lý hoạt động của Real Time PCR

Real-Time PCR hoạt động dựa trên nguyên lý khuếch đại DNA thông qua chuỗi phản ứng polymerase. Trong quá trình này, các tín hiệu huỳnh quang được phát ra khi DNA được khuếch đại, cho phép theo dõi quá trình này theo thời gian thực. Điều này giúp xác định nhanh chóng sự hiện diện của vi khuẩn Rickettsia.

3.2. Quy trình thực hiện Real Time PCR

Quy trình thực hiện Real-Time PCR bao gồm các bước như tách chiết DNA, thiết kế mồi và probe, khuếch đại DNA và phân tích kết quả. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả. Việc chuẩn bị mẫu bệnh phẩm cũng rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Kết quả nghiên cứu ứng dụng Real Time PCR

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp Real-Time PCR có thể phát hiện vi khuẩn Rickettsia trong các mẫu bệnh phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kết quả cho thấy phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh do Rickettsia gây ra, từ đó giúp nâng cao hiệu quả điều trị.

4.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của Real Time PCR

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Real-Time PCR đã được đánh giá thông qua các thử nghiệm lâm sàng. Kết quả cho thấy phương pháp này có thể phát hiện vi khuẩn Rickettsia ngay cả trong các mẫu có lượng vi khuẩn thấp, từ đó giúp nâng cao khả năng chẩn đoán.

4.2. Ứng dụng thực tiễn của Real Time PCR trong y tế

Phương pháp Real-Time PCR đã được áp dụng tại nhiều cơ sở y tế để chẩn đoán bệnh do Rickettsia. Việc phát hiện sớm vi khuẩn giúp bác sĩ có thể đưa ra phương pháp điều trị kịp thời, giảm thiểu biến chứng và tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về qui trình Real-Time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia đã mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán bệnh truyền nhiễm. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp này có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tỷ lệ tử vong. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện hơn nữa các phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh do Rickettsia gây ra.

5.1. Triển vọng phát triển các phương pháp chẩn đoán mới

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp chẩn đoán mới, kết hợp giữa Real-Time PCR và các kỹ thuật khác để nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia.

5.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức về bệnh Rickettsia

Nâng cao nhận thức về bệnh do Rickettsia gây ra là rất quan trọng. Cần có các chương trình giáo dục cộng đồng để giúp người dân hiểu rõ hơn về bệnh và cách phòng ngừa, từ đó giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh truyền nhiễm luôn nhận được sự quan tâm của nền y tế toàn cầu. Những mầm bệnh trước đây đã được kiểm soát nhưng nay thường xuyên biến đổi kết hợp với các căn nguyên mới xuất hiện gây khó khăn cho kiểm soát dịch bệnh cũng như điều trị bệnh truyền nhiễm. Theo CDC 4470 ca bệnh Spotted fever group được báo cáo ở Mỹ năm 2012, 18000 trường hợp Scrub typhus group (sốt mò) được báo cáo trong chiến tranh thế giới thứ II. Trong thời gian gần đây, ước tính mỗi năm có khoảng 1 triệu trường hợp sốt mò và có tới 1 tỷ người sống trong các vùng lưu hành bệnh có nguy cơ lây nhiễm thì Rickettsia là căn nguyên gây bệnh đáng được chú ý.

Rickettsia được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn nội bào bắt buộc không thể nhận dạng bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Dựa trên đặc điểm hình thái, kháng nguyên, và chuyển hóa, Rickettsia được phân loại thành các nhóm sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus Group (STG). Dựa vào các tác nhân gây bệnh khác nhau cùng với các cơ chế lan truyền, phân bố địa lý, sự hạn chế trong việc chẩn đoán, tình hình dịch tễ học và đánh giá về mức độ nghiêm trọng của bệnh do Rickettsiaceae gây ra trong khu vực Đông Nam Á được xem là một thách thức khó khăn. Hàng trăm trường hợp tử vong và hàng ngàn trường hợp nhiễm bệnh đã không được chẩn đoán.

Việc chẩn đoán bệnh do Rickettsiaceae ở Việt Nam vẫn chủ yếu dựa vào lâm sàng và yếu tố dịch tễ. Bệnh do Rickettsiaceae có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng dễ nhầm lẫn với nhiều bệnh truyền nhiễm khác. Thêm vào đó, bệnh có thể để lại những biến chứng thần kinh nặng nề và có thể gây tử vong cho bệnh nhân. Do vậy, chẩn đoán xác định căn nguyên gây bệnh sớm và chính xác để điều trị sớm có ý nghĩa rất lớn.

Các xét nghiệm chẩn đoán mầm bệnh đã được áp dụng như phương pháp huyết thanh học (phản ứng Weil – Felix), nhưng phương pháp này còn nhiều hạn chế, chỉ chẩn đoán được một vài loài nhất định và dễ xảy ra các phản ứng chéo gây sai lệch kết quả. Phương pháp phân lập mầm bệnh bằng tiêm truyền mầm bệnh, phương pháp này nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn trong tế bào động vật rất khó và nguy LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] hiểm cho người thực hiện thí nghiệm. Các phương pháp gần đây như ELISA, IFA thao tác dễ, tiết kiệm chi phí, tuy nhiên các phương pháp này chẩn đoán được khi thời gian nhiễm vi khuẩn từ 15-26 ngày, hạn chế trong việc chẩn đoán sớm. Từ đó đặt ra nhu cầu cần những phương pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thời gian trả lời kết quả sớm.

Phương pháp real-time PCR trong chẩn đoán Rickettsiaceae gây bệnh ở người đã cho những kết quả khả quan. Phương pháp này sẽ giúp xác định sớm, chính xác mầm bệnh, định hướng thầy thuốc lâm sàng điều trị đặc hiệu kịp thời, làm giảm tỷ lệ biến chứng và tử vong của bệnh do Rickettsiaceae. Chính vì những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình real-time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người.” Với hai mục tiêu chính: 1. Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O.

tsutsugamushi và các loài Rickettsia. Áp dụng kĩ thuật real-time PCR xác định các mầm bệnh gây sốt Rickettsiaceae trên mẫu bệnh phẩm thu thập được tại Bệnh viện Trung ương quân đội 108 từ tháng 6/2016 - tháng 9/2017. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1. Giới thiệu về Rickettsiaceae 1.

Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae Rickettsia được biết đến như là các căn nguyên gây bệnh ở động vật có xương sống với các vectơ truyền bệnh thuộc nhóm động vật chân đốt. Trước đây Rickettsia được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn không thể nhận dạng bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Rickettsia được đặt tên sau khi nhà bệnh học Howard Taylor Ricketts phát hiện ra mầm bệnh sốt phát ban (1906) và ông bị chết vì nhiễm bệnh này trong thời gian nghiên cứu [20]. Bằng sự phát triển của các kỹ thuật phân tử gần đây, sự phân loại các loài Rickettsia có sự thay đổi lớn.

Rickettsia tsutsugamushi đã được chứng minh đủ điều kiện để phân loại thành một chi mới là Orientia [65]. Dựa trên đặc điểm hình thái, kháng nguyên và chuyển hóa, Rickettsia được phân loại thành hai nhóm bệnh: Spotted Fever Group (SFG) và Typhus Group (TG); Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay còn gọi là bệnh sốt mò ở Việt Nam. Theo nghiên cứu của Bechah và cộng sự (2008), chi Rickettsia có 24 loài gây bệnh và Orientia chỉ có một loài duy nhất là Orientia tsutsugamushi (Rickettsia tsutsugamushi). Phân loại các loài Rickettsiaceae được thể hiện như hình 1.1: Phân loại Rickettsiaceae 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2: Hình ảnh Rickettsia trong tế bào vật chủ [71] Các vi khuẩn trong chi Rickettsia là các loài sống nội bào bắt buộc có chiều dài khoảng 0,8 - 2,0 µm, chiều rộng khoảng 0,3 - 0,5 µm, đa hình thái, hình dạng thay đổi qua các giai đoạn phát triển: cầu khuẩn đứng riêng rẽ hoặc thành từng đôi có khi xếp thành chuỗi ngắn hoặc từng đám trong hoặc ngoài tế bào.

Tế bào chất của các vi khuẩn này chứa ribosome, các sợi ADN và được bao bọc bởi cấu trúc của tế bào Gram âm điển hình với một lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide ở màng ngoài, nhưng không có tiên mao [53]. Bộ gene của các loài thuộc Rickettsia là một ADN đơn dạng vòng, có kích thước lên đến 1-1,4Mbp. Có khoảng 900 - 1500 gene tùy loài, trong đó có 704 protein và 39 RNA chung cho tất cả các loài [4, 45]. Gen đầu tiên được sử dụng cho mục đích phát sinh loài là 16S rDNA [55].

Sau đó, nghiên cứu phát sinh loài dựa trên các trình tự gen khác bao gồm gltA (gen mã hóa tổng hợp citrate) [57], gen mã hóa protein 17kDa [3] và nhóm gen kháng nguyên bề mặt tế bào (SCA): ompA, ompB, sca4, sca1 và sca2 [18, 44, 56, 43]. Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự gen mã hóa protein 17kDa không cho nhiều giá trị ý nghĩa. Ngược lại, dựa trên trình tự gen gltA có thể xây dựng mối quan hệ phát sinh loài. tsutsugamushi là vi khuẩn có chiều rộng khoảng 0,5 µm và chiều dài từ 1,2 đến 3,0µm, lớn hơn so với các vi khuẩn nhóm SFG và TG [24].

Hơn nữa cấu tạo tế bào của O. tsutsugamushi bị thiếu lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide khác với các loài Rickettsia khác [2]. tsutsugamushi có kích thước hệ gen dao động từ 2,0 đến 2,7 Mb bao gồm 1967 trình tự mã hóa protein và khoảng 46,7% là các trình tự lặp lại [41]. tsutsugamushi chứa nhiều biến thể kháng nguyên, bao gồm Gilliam, 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Kato, Karp, Kawasaki, Kuroki và các loại khác.

Sự thay đổi kháng nguyên này phụ thuộc phần lớn vào sự đa dạng của kháng nguyên đặc hiệu loài 56kDa (TSA) nằm trên bề mặt của màng vi khuẩn [52]. Với một khung đọc mở (ORF) là 1600 bp, TSA 56kDa gồm có 516-541 amino axit và tham gia vào việc xâm nhập vào tế bào chủ thông qua sự kết hợp của fibronektyin. Có bốn domain biến thể trong vùng này, các domain biến thể (VD) I-IV, chịu trách nhiệm về mức độ biến đổi kháng nguyên lớn ở gen [37]. Họ vi khuẩn Rickettsiaceae sinh sản bằng hình thức chia đôi giống như vi khuẩn.

Tuy nhiên tốc độ sinh sản chậm so với vi khuẩn và virut khác. Trong nuôi cấy tế bào, thời gian 1 thế hệ là 8-10 giờ ở nhiệt độ 32-35oC [53]. Dịch tễ học của các bệnh ở người do Rickettsiaceae gây ra liên quan đến đặc điểm sinh học của vectơ truyền bệnh. Bệnh do Rickettsiaceae rất khác nhau ở mức độ nghiêm trọng từ bệnh nhẹ không cần điều trị đến việc nhiễm trùng đe dọa tính mạng.

Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra Các bệnh gây ra bởi các sinh vật trong nhóm Rickettsiaceae được công nhận và có thể được chia thành 3 nhóm bệnh sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus Group (STG) [73]. - Nhóm bệnh SFG được chia theo từng bệnh như sau: Rocky Mountain spotted fever (RMSF) do Rickettsia rickettsii gây bệnh; Rickettsialpox do Rickettsia akari gây ra; Boutonneuse fever,… - Nhóm bệnh TG có đặc điểm dịch tễ học giống nhau, do các loài vi khuẩn Rickettsia prowazekii và Rickettsia typhi là căn nguyên gây bệnh chính: Louse- borne typhus, Brill-Zinsser disease, Murine typhus,… - Tác nhân gây bệnh sốt mò (STG) chỉ có một loài duy nhất là O. tsutsugamushi, có ba kiểu huyết thanh học chủ yếu là Karp, Gilliam, Kato. Các vector lây truyền Vật chủ mà Rickettsiaceae kí sinh rất đa dạng, tất cả các loài đều có liên quan đến động vật chân đốt.

Một số loài Rickettsiaceae có thể lan truyền trong động vật có xương sống, một số loài gây bệnh ở người và động vật, do chúng lây truyền 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] bởi các động vật chân đốt như bọ chét, chấy, chấy hoặc ve và hiện nay các loài Rickettsiaceae đã được công bố gần như trên toàn thế giới [49]. Cho đến nay ve, rận và bọ chét trong giới Ixodidea, Phtiraptera, và Siphonaptera tương ứng được biết đến như là các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia. Năm 2012, Socolovschi và cộng sự cho rằng muỗi cũng là một trong số các vector lây truyền R. felis đáng chú ý [62].

Mò Leptotrombidium là vector truyền bệnh của vi khuẩn thuộc chi Orientia [25]. Động vật chân đốt đồng thời cũng là ổ chứa và nơi nhân lên của vi khuẩn chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc lây lan. Tuy nhiên cách thức lây truyền từ động vật chân đốt sang người là khác nhau. Vi khuẩn lây nhiễm vào vật chủ qua nước bọt, vết đốt của côn trùng như ve, bét, chấy rận hoặc mò mạt.

Ngoài ra chúng còn được truyền qua phân qua vết xước ở da vật chủ [50]. Rickettsia và Orientia lây nhiễm sang các tế bào da như lớp nội mạc mạch máu (tế bào bị nhiễm chính), nguyên bào sợi, tế bào nội mô bạch huyết và đại thực bào.3: Các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia [38] Các loài Rickettsiaceae được duy trì trong tự nhiên bằng cách truyền trực tiếp hay gián tiếp tới những con bọ không nhiễm bệnh thông qua đường ruột những con bọ này khi đốt nhưng loài gặm nhấm hay động vật khác bị nhiễm Rickettsiaceae (hình 1. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.4: Chu kỳ nhiễm bệnh Sốt Mò 1. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae.

Bệnh sốt do Rickettsiaceae được tìm thấy ở mọi châu lục trừ Nam Cực [17] Hình 1.5: Phân bố các loài Rickettsiaceae gây bệnh.