Nghiên Cứu Chuẩn Hóa Phương Pháp Phân Tích Dư Lượng Ciprofloxacin Trong Thịt Lợn Bằng Kỹ Thuật ELISA

Tài liệu nghiên cứu Luận văn nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp phân tích dư lượng ciprofloxacin trong thịt lợn bằng kỹ, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Ngô Đức Dũng
• Người hướng dẫn: TS. Dương Văn Nhiệm
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Phương Pháp Phân Tích Dư Lượng Ciprofloxacin Trong Thịt Lợn Bằng Kỹ Thuật ELISA
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 2. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 3. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 4. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 4.1. Tình hình an toàn thực phẩm
• 4.1.1. Tình hình an toàn thực phẩm trên thế giới
• 4.1.2. Tình hình an toàn thực phẩm ở Việt Nam
• 4.2. Tình hình sản xuất chăn nuôi ở Việt Nam
• 4.2.1. Sản xuất và tiêu thụ thịt ở Việt Nam
• 4.3. Tình hình sản xuất, sử dụng, quản lý thuốc thú y trong chăn nuôi
• 4.4. Giới thiệu khái quát về công ty cổ phần tập đoàn dabaco việt nam
• 4.5. Những hiểu biết cơ bản về kháng sinh nhóm Fluoroquinolone
• 4.5.1. Kháng sinh nhóm Fluoroquinolone
• 4.5.2. Kháng sinh Ciprofloxacin
• 4.6. Tồn dư kháng sinh trong thịt lợn và ảnh hưởng của chúng đối với sức khỏe cộng đồng
• 4.6.1. Khái niệm về tồn dư
• 4.6.2. Ảnh hưởng của tồn dư kháng sinh trong thực phẩm đối với sức khỏe cộng đồng
• 4.7. Một số kỹ thuật phân tích dư lượng kháng sinh trong thực phẩm
• 4.7.1. Khái niệm về ELISA
• 4.7.2. Phân loại ELISA. Ưu, nhược điểm của phương pháp phân tích định tính ELISA
• 4.7.3. Một số yếu tố ảnh hưởng tới kết quả phân tích của phương pháp ELISA
• 4.7.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA
• 5. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. Vật liệu nghiên cứu
• 5.2. Đối tượng nghiên cứu
• 5.3. Địa điểm nghiên cứu
• 5.4. Thời gian nghiên cứu
• 5.5. Vật liệu, hóa chất và thuốc thử
• 5.6. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 5.7. Nội dung nghiên cứu
• 5.8. Phương pháp nghiên cứu
• 5.8.1. Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp của kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định Ciprofloxacin trong mẫu thịt lợn tươi
• 5.8.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu của phương pháp để phân tích mẫu thực
• 5.9. Phương pháp phân tích số liệu
• 6. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 6.1. Kết quả nghiên cứu tính phù hợp của kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định Ciprofloxacin trong thịt lợn tươi
• 6.2. Kết quả nghiên cứu tính ổn định của kit ELISA
• 6.3. Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của kit ELISA
• 6.4. Kết quả nghiên cứu khả năng phát hiện của kit (CCβ)
• 6.5. Kết quả xác định độ chính xác (Accuracy: AC), độ đặc hiệu (Specificity: SP), độ nhạy (Sensitivity: SE), độ lệch dương (Positive deviation: PD) và độ lệch âm (negative deviation: ND)
• 6.6. Kết quả xác định độ thu hồi, độ lặp lại và độ tái lặp
• 6.7. Kết quả phân tích dư lượng ciprofloxacin trong mẫu thịt lợn tươi bằng Kit Elisa
• 7. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu ELISA Phát Hiện Ciprofloxacin 55 Ký Tự

Nghiên cứu phương pháp phân tích dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA là một lĩnh vực quan trọng trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm. Ciprofloxacin là một loại kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone, được sử dụng rộng rãi trong thú y để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, việc sử dụng không kiểm soát có thể dẫn đến dư lượng kháng sinh trong thịt lợn, gây nguy cơ kháng kháng sinh và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Kỹ thuật ELISA là một phương pháp phân tích miễn dịch enzyme, có độ nhạy cao và dễ thực hiện, phù hợp cho việc kiểm nghiệm thực phẩm.

1.1. Giới Thiệu Về Kháng Sinh Ciprofloxacin Trong Chăn Nuôi

Ciprofloxacin là một kháng sinh bán tổng hợp, thuộc nhóm quinolone, có phổ kháng khuẩn rộng. Nó hoạt động bằng cách ức chế DNA gyrase, một enzyme cần thiết cho sự sao chép DNA của vi khuẩn. Việc sử dụng Ciprofloxacin trong chăn nuôi giúp điều trị hiệu quả các bệnh nhiễm khuẩn, nhưng cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy định về thời gian ngừng thuốc để tránh dư lượng trong thịt lợn. Việc kiểm soát dư lượng Ciprofloxacin là cần thiết để ngăn ngừa nguy cơ kháng kháng sinh.

1.2. Vai Trò Của ELISA Trong Kiểm Nghiệm An Toàn Thực Phẩm

Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một phương pháp sinh hóa được sử dụng để phát hiện và định lượng các chất, chẳng hạn như kháng sinh, trong mẫu. ELISA có ưu điểm là độ nhạy cao, dễ thực hiện, và có thể xử lý số lượng lớn mẫu. Do đó, ELISA được ứng dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm thực phẩm để đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong việc phân tích dư lượng kháng sinh.

II. Thách Thức Về Dư Lượng Ciprofloxacin Trong Thịt Lợn 59 Ký Tự

Vấn đề dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn đặt ra nhiều thách thức đối với ngành chăn nuôi và an toàn thực phẩm. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách, không tuân thủ thời gian ngừng thuốc, hoặc sử dụng các loại kháng sinh bị cấm có thể dẫn đến tình trạng dư lượng vượt quá mức cho phép. Điều này không chỉ gây nguy cơ kháng kháng sinh mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Do đó, việc phát triển và áp dụng các phương pháp phân tích hiệu quả để kiểm nghiệm là vô cùng quan trọng.

2.1. Nguy Cơ Kháng Kháng Sinh Từ Dư Lượng Trong Thực Phẩm

Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, đặc biệt là thịt lợn, là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh. Vi khuẩn tiếp xúc với kháng sinh ở nồng độ thấp có thể phát triển khả năng kháng thuốc, làm giảm hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở người. Việc kiểm soát và giảm thiểu dư lượng kháng sinh là cần thiết để bảo vệ hiệu quả của kháng sinh và đảm bảo sức khỏe cộng đồng.

2.2. Ảnh Hưởng Của Dư Lượng Kháng Sinh Đến Sức Khỏe Cộng Đồng

Dư lượng kháng sinh trong thịt lợn có thể gây ra nhiều ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe cộng đồng. Ngoài nguy cơ kháng kháng sinh, dư lượng này còn có thể gây dị ứng, rối loạn tiêu hóa, và ảnh hưởng đến hệ miễn dịch. Đặc biệt, trẻ em và người già là những đối tượng dễ bị tổn thương nhất. Việc kiểm nghiệm thực phẩm và kiểm soát dư lượng kháng sinh là biện pháp quan trọng để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

III. Phương Pháp ELISA Định Lượng Ciprofloxacin Quy Trình 58 Ký Tự

Phương pháp ELISA là một giải pháp hiệu quả để phân tích dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn. Quy trình ELISA bao gồm nhiều bước, từ chuẩn bị mẫu, phản ứng miễn dịch, đến đọc kết quả ELISA và xử lý số liệu. Để đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả, cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình và sử dụng các thiết bị, hóa chất đạt chuẩn. Việc kiểm định và chuẩn hóa phương pháp ELISA là rất quan trọng để đảm bảo tính phù hợp và độ tin cậy.

3.1. Chi Tiết Quy Trình Chuẩn Bị Mẫu Thịt Lợn Cho ELISA

Chuẩn bị mẫu là bước quan trọng trong quy trình ELISA. Mẫu thịt lợn cần được đồng nhất, chiết tách Ciprofloxacin bằng dung môi phù hợp, và làm sạch để loại bỏ các chất gây nhiễu. Quy trình chuẩn bị mẫu cần được tối ưu hóa để đảm bảo thu hồi tối đa Ciprofloxacin và loại bỏ các chất gây ảnh hưởng đến phản ứng ELISA. Các bước này ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác của phân tích.

3.2. Các Bước Thực Hiện Phản Ứng ELISA Và Đọc Kết Quả

Phản ứng ELISA bao gồm các bước ủ mẫu với kháng thể đặc hiệu, thêm enzyme liên kết, và thêm cơ chất để tạo màu. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ Ciprofloxacin trong mẫu. Đọc kết quả ELISA bằng máy quang phổ và so sánh với đường chuẩn để định lượng Ciprofloxacin. Việc kiểm soát nhiệt độ, thời gian ủ, và nồng độ thuốc thử là rất quan trọng để đảm bảo độ nhạy và độ chính xác của phương pháp.

3.3. Xử Lý Số Liệu Và Đánh Giá Kết Quả Phân Tích ELISA

Xử lý số liệu từ máy quang phổ để tính toán nồng độ Ciprofloxacin trong mẫu. Đánh giá kết quả dựa trên các thông số như giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ thu hồi, và độ chính xác. So sánh kết quả với các quy định về dư lượng Ciprofloxacin trong thực phẩm để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm. Việc này đảm bảo tính tin cậy của phân tích.

IV. So Sánh ELISA Với HPLC MS Trong Phân Tích Ciprofloxacin 57 Ký Tự

So sánh phương pháp ELISA với các phương pháp khác như HPLC/MS (sắc ký lỏng khối phổ) là cần thiết để đánh giá ưu điểm của ELISA và nhược điểm của ELISA. HPLC/MS là phương pháp có độ chính xác cao, nhưng đòi hỏi thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên có trình độ cao. ELISA có ưu điểm là chi phí thấp, dễ thực hiện, nhưng độ chính xác có thể thấp hơn. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào mục đích phân tích và điều kiện của phòng thí nghiệm.

4.1. Ưu Điểm Của Phương Pháp ELISA Trong Kiểm Nghiệm

Ưu điểm của ELISA bao gồm chi phí thấp, dễ thực hiện, và khả năng xử lý số lượng lớn mẫu. ELISA phù hợp cho việc kiểm tra sàng lọc dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn với số lượng lớn. Phương pháp này đặc biệt hữu ích cho các phòng thí nghiệm có nguồn lực hạn chế nhưng vẫn cần đảm bảo an toàn thực phẩm. ELISA cũng có thể được sử dụng để kiểm định nhanh chóng.

4.2. Nhược Điểm Của ELISA Và Các Hạn Chế Cần Lưu Ý

Nhược điểm của ELISA bao gồm độ chính xác thấp hơn so với HPLC/MS, khả năng bị ảnh hưởng bởi các chất gây nhiễu, và yêu cầu chuẩn bị mẫu kỹ lưỡng. ELISA cũng có thể cho kết quả dương tính giả, đòi hỏi phải xác nhận bằng các phương pháp khác. Do đó, cần lưu ý các hạn chế này khi sử dụng ELISA để phân tích dư lượng Ciprofloxacin.

4.3. Khi Nào Nên Sử Dụng ELISA Thay Vì HPLC MS

Sử dụng ELISA khi cần kiểm tra sàng lọc số lượng lớn mẫu với chi phí thấp. HPLC/MS nên được sử dụng để xác nhận kết quả dương tính từ ELISA hoặc khi cần độ chính xác cao. Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào mục đích phân tích, nguồn lực, và yêu cầu về độ chính xác. ELISA phù hợp cho kiểm nghiệm thực phẩm hàng ngày, trong khi HPLC/MS phù hợp cho nghiên cứu và kiểm định chuyên sâu.

V. Ứng Dụng ELISA Kiểm Tra Thịt Lợn Tại Dabaco Kết Quả 59 Ký Tự

Nghiên cứu ứng dụng của ELISA trong kiểm nghiệm thịt lợn tại Công ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam cho thấy tính hiệu quả của phương pháp này trong việc kiểm soát dư lượng Ciprofloxacin. Kết quả nghiên cứu cho thấy bộ kit ELISA của hãng Biooscientific đạt yêu cầu về tính ổn định và độ chính xác. Phương pháp ELISA phù hợp để ứng dụng tại phòng kiểm nghiệm của DABACO trong phân tích sàng lọc dư lượng Ciprofloxacin.

5.1. Đánh Giá Độ Chính Xác Và Độ Tin Cậy Của Kit ELISA

Đánh giá độ chính xác và độ tin cậy của kit ELISA bằng cách xác định các thông số như độ thu hồi, độ lặp lại, và độ tái lặp. Kết quả cho thấy kit ELISA của Biooscientific đạt yêu cầu về các thông số này, chứng tỏ tính ổn định và độ tin cậy của phương pháp. Điều này đảm bảo rằng kết quả phân tích là chính xác và có thể tin cậy.

5.2. Kết Quả Phân Tích Dư Lượng Ciprofloxacin Trong Mẫu Thịt

Kết quả phân tích dư lượng Ciprofloxacin trong mẫu thịt lợn bằng kit ELISA cho thấy phương pháp này có khả năng phát hiện Ciprofloxacin ở nồng độ thấp. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định để đảm bảo độ nhạy của phương pháp. Kết quả này cho thấy ELISA là một công cụ hữu ích để kiểm soát dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn.

5.3. Ứng Dụng Thực Tế Và So Sánh Với Tiêu Chuẩn An Toàn

Kết quả phân tích được so sánh với các quy định về dư lượng Ciprofloxacin trong thực phẩm để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm. Phòng thí nghiệm quy định diễn giải kết quả thử nghiệm phân tích dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA theo khả năng phát hiện CCß là 1,60 µg/kg. Mẫu thịt lợn dương tính dư lượng Ciprofloxacin cần phân tích khẳng định bằng kỹ thuật LC/MS/MS.

VI. Kết Luận Giải Pháp Giảm Thiểu Dư Lượng Kháng Sinh 58 Ký Tự

Nghiên cứu đã chứng minh tính hiệu quả của phương pháp ELISA trong việc phân tích dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn. Tuy nhiên, để giảm thiểu dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, cần có các giải pháp đồng bộ từ quản lý nhà nước, nhà sản xuất, và người tiêu dùng. Việc tăng cường kiểm tra, kiểm soát, và tuyên truyền về sử dụng kháng sinh hợp lý là rất quan trọng để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu Và Đề Xuất Cải Tiến

Nghiên cứu đã chuẩn hóa phương pháp phân tích dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA tại phòng kiểm nghiệm của Công ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam. Kết quả cho thấy phương pháp này phù hợp để kiểm tra sàng lọc. Đề xuất cải tiến bao gồm tối ưu hóa quy trình chuẩn bị mẫu và tăng cường kiểm soát chất lượng kit ELISA.

6.2. Giải Pháp Giảm Thiểu Dư Lượng Kháng Sinh Trong Chăn Nuôi

Giải pháp giảm thiểu dư lượng kháng sinh trong chăn nuôi bao gồm sử dụng kháng sinh hợp lý, tuân thủ thời gian ngừng thuốc, tăng cường vệ sinh chuồng trại, và sử dụng các biện pháp phòng bệnh tự nhiên. Cần có sự phối hợp chặt chẽ giữa nhà nước, nhà sản xuất, và người chăn nuôi để đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

6.3. Kiến Nghị Về Chính Sách Và Quy Định An Toàn Thực Phẩm

Kiến nghị về chính sách và quy định an toàn thực phẩm bao gồm tăng cường kiểm tra và xử phạt các trường hợp vi phạm về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Cần có các quy định cụ thể về giới hạn dư lượng tối đa cho phép của Ciprofloxacin trong thịt lợn. Tăng cường tuyên truyền và giáo dục về an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam giữ vai trò trụ cột trong việc cung cấp nguồn thực phẩm thiết yếu cho xã hội, với tổng đàn lợn cả nước đạt hơn 29 triệu con và sản phẩm thịt lợn chiếm trên 36% tổng sản lượng tiêu thụ thực phẩm. Cùng với sự gia tăng mạnh mẽ về quy mô sản xuất, tình trạng lạm dụng thuốc thú y và hóa dược trong chăn nuôi đang tạo ra những thách thức nghiêm trọng đối với công tác bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm. Hàng năm, cả nước ghi nhận khoảng 150 đến 250 vụ ngộ độc thực phẩm với trên 3.500 ca mắc, trong đó các trường hợp ngộ độc liên quan đến hóa chất nông nghiệp và tồn dư thuốc thú y chiếm tỷ lệ khoảng 25%. Ciprofloxacin là một loại kháng sinh bán tổng hợp thuộc nhóm Fluoroquinolone thế hệ 2 có hoạt tính diệt khuẩn cực mạnh, tuy nhiên việc lạm dụng loại kháng sinh này tiềm ẩn nguy cơ gây dị ứng trên 10% đến 15% dân số và làm gia tăng tốc độ xuất hiện các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc nguy hiểm. Theo Thông tư 24/2013/TT-BYT của Bộ Y tế, Ciprofloxacin không nằm trong danh mục các chất được quy định giới hạn tồn dư tối đa (MRL), đồng nghĩa với việc chất này bị cấm sử dụng trong chăn nuôi động vật thương phẩm lấy thịt.

Xuất phát từ yêu cầu kiểm soát chất lượng chuỗi cung ứng khép kín, đề tài hướng tới mục tiêu chuẩn hóa phương pháp phân tích sàng lọc dư lượng Ciprofloxacin trong mẫu thịt lợn tươi bằng kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (ELISA) và ứng dụng thực tế để giám sát an toàn thực phẩm. Nghiên cứu được triển khai tại Phòng Kiểm nghiệm của Công ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam – đơn vị đạt chuẩn quốc tế ISO/IEC 17025:2005 (mã hiệu VILAS 242 và VILAS 645), sở hữu hệ thống 45 trang trại vệ tinh cung cấp 7.000 tấn thịt lợn tươi mỗi năm với tỷ lệ nạc trên 64%. Phạm vi thực nghiệm diễn ra từ tháng 5 năm 2016 đến tháng 4 năm 2017. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi thiết lập thành công quy trình sàng lọc có chi phí thấp, thời gian xử lý mẫu nhanh và độ nhạy vượt trội, giúp doanh nghiệp chủ động loại trừ các lô sản phẩm nhiễm tồn dư kháng sinh trước khi đưa ra thị trường tiêu thụ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Khung lý thuyết của đề tài được xây dựng trên nền tảng dược lý học kháng sinh, cơ chế tích lũy tồn dư hóa dược trong mô động vật và nguyên lý phân tích miễn dịch học hiện đại. Kháng sinh nhóm Fluoroquinolone, tiêu biểu là Ciprofloxacin (công thức hóa học C17H18FN3O3, khối lượng phân tử 331,35 g/mol, thời gian bán hủy 4 giờ), hoạt động bằng cách ức chế đặc hiệu enzym DNA gyrase của vi khuẩn, từ đó ngăn chặn quá trình sao chép nhiễm sắc thể. Do cơ chế tác động chuyên biệt, Ciprofloxacin không bị kháng chéo với các nhóm kháng sinh thông thường như Beta-lactam hay Aminoglycoside, khiến nó thường bị lạm dụng làm thuốc điều trị đầu tay trong chăn nuôi gia súc.

Về nguyên lý phân tích, nghiên cứu áp dụng kỹ thuật ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA). Các giếng nhựa trên khay thử nghiệm được phủ sẵn phức hợp Ciprofloxacin-protein. Khi đưa dịch chiết mẫu và kháng thể kháng Ciprofloxacin vào giếng, các phân tử Ciprofloxacin tự do trong mẫu sẽ cạnh tranh trực tiếp với Ciprofloxacin cố định ở đáy giếng để liên kết với kháng thể. Sau khi bổ sung kháng thể thứ cấp gắn enzyme Horseradish Peroxidase và cơ chất Tetramethylbenzidine (TMB), phản ứng tạo màu xanh lam xảy ra và chuyển sang màu vàng khi thêm dung dịch dừng phản ứng. Cường độ màu đo tại bước sóng 450 nm tỷ lệ nghịch với nồng độ Ciprofloxacin hiện diện trong mẫu thịt.

Đề tài vận dụng chặt chẽ các quy định pháp lý và chuẩn mực quốc tế về thẩm định phương pháp phân tích, bao gồm Quyết định 2002/657/EC của Ủy ban Châu Âu và Thông tư 54/2011/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Các khái niệm cốt lõi được chuẩn hóa trong nghiên cứu gồm:

• Giới hạn phát hiện (LOD): Nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng chính xác.
• Khả năng phát hiện (CCβ): Nồng độ chất phân tích thấp nhất mà phương pháp phát hiện được với xác suất sai lỗi âm tính giả β bằng 5%.
• Giới hạn định lượng (LOQ): Nồng độ tối thiểu có thể xác định với độ đúng và độ lặp lại đạt yêu cầu.
• Giới hạn hiệu năng phân tích tối thiểu (MRPL): Ngưỡng phân tích tối thiểu bắt buộc đối với các hợp chất cấm.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng bộ kit thương mại MaxSignal Ciprofloxacin ELISA mã số 1068-01 của hãng Bioo Scientific, thực hiện trên hệ thống đầu đọc BioTek ở bước sóng 450 nm kết hợp máy lắc Vortex, máy ly tâm lạnh Mikro 22R và hệ thống thổi khô bằng khí nitơ chuyên dụng. Quy trình phân tích và lấy mẫu tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn TCVN 4325:2007 (tương đương ISO 6497:2002).

Cỡ mẫu và thiết kế thực nghiệm được bố trí cụ thể như sau:

• Thí nghiệm đánh giá độ ổn định: Khảo sát đường chuẩn 5 mức nồng độ (0,35; 1,00; 2,50; 7,50 và 22,50 ng/ml) trên 5 lô kit khác nhau, lặp lại thử nghiệm sau 30 ngày bảo quản kit ở nhiệt độ 2 đến 8 độ C.
• Thí nghiệm xác định LOD và CCβ: Phân tích 20 mẫu trắng thịt lợn tươi không chứa kháng sinh và 20 mẫu trắng có thêm chuẩn Ciprofloxacin ở nồng độ 1,60 µg/kg.
• Thí nghiệm xác định hiệu lực phương pháp: Đánh giá độ chính xác (AC), độ đặc hiệu (SP), độ nhạy (SE), độ lệch dương (PD) và độ lệch âm (ND) trên 20 mẫu chứng âm và 20 mẫu chứng dương thêm chuẩn tại nồng độ 15,00 µg/kg (tương đương 10 lần LOD).
• Thí nghiệm khảo sát độ thu hồi và độ lặp lại: Khảo sát tại 3 mức nồng độ tương ứng 1 lần, 1,5 lần và 2 lần LOQ (5,00; 7,50 và 10,00 µg/kg) với 6 mẫu lặp cho mỗi mức, thực hiện 3 đợt độc lập.
• Ứng dụng phân tích mẫu thực tế: Sàng lọc 17 lô mẫu thịt lấy từ 17 trại chăn nuôi vệ tinh của DABACO, kết hợp đưa vào các mẫu mù kiểm soát chất lượng gồm mẫu kiểm soát âm tính QC(-) và mẫu kiểm soát dương tính QC(+) ở nồng độ 2,00 µg/kg.

Phương pháp phân tích số liệu dựa trên phần mềm KC để vẽ đường chuẩn hồi quy tuyến tính dạng bán logarit, tính toán độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) và hệ số biến thiên (%CV) theo tiêu chuẩn châu Âu EC. Toàn bộ quá trình thực nghiệm được triển khai theo tiến độ 12 tháng từ giữa năm 2016 đến đầu năm 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thẩm định phương pháp ELISA cạnh tranh tại phòng kiểm nghiệm DABACO đã mang lại các thông số kỹ thuật ấn tượng, đáp ứng hoàn toàn các tiêu chí khắt khe của Quyết định 2002/657/EC đối với phương pháp sàng lọc:

Thứ nhất, tính ổn định của đường chuẩn đạt mức tuyệt hảo. Kết quả phân tích trên 5 lô kit độc lập ở 5 thời điểm khác nhau cho thấy phương trình hồi quy tuyến tính giữa logarit nồng độ và độ hấp thụ quang học luôn đạt hệ số tương quan R2 từ 0,9907 đến 0,9971 (vượt ngưỡng yêu cầu R2 ≥ 0,9900). Sau 1 tháng bảo quản ở 2 đến 8 độ C, đường chuẩn của các kit vẫn duy trì độ tuyến tính cao với R2 đạt từ 0,9907 đến 0,9970.

Thứ hai, giới hạn phát hiện LOD thực nghiệm trên 20 mẫu trắng đạt giá trị trung bình 0,48 µg/kg với độ lệch chuẩn SD là 0,35 µg/kg, xác định LOD của phương pháp là 1,52 µg/kg. Trên cơ sở đó, phòng thí nghiệm đã thiết lập mức LOD thực hành là 1,60 µg/kg và giới hạn định lượng LOQ thực hành là 5,00 µg/kg.

Thứ ba, khả năng phát hiện CCβ của phương pháp được xác lập tại mức 1,60 µg/kg với giá trị ngưỡng cut-off là 1,24 µg/kg. Tỷ lệ mẫu thêm chuẩn 1,60 µg/kg có tín hiệu dưới ngưỡng cut-off chỉ chiếm 5% (1 trên 20 mẫu), hoàn toàn thỏa mãn yêu cầu xác suất sai lỗi âm tính giả β ≤ 5%.

Thứ tư, các chỉ số hiệu lực phân tích đạt kết quả vượt chuẩn quy định:

• Độ chính xác (AC) đạt 95,0% (tiêu chuẩn EC quy định ≥ 90,0%).
• Độ đặc hiệu (SP) đạt tuyệt đối 100,0% (tiêu chuẩn EC quy định ≥ 90,0%).
• Độ nhạy (SE) đạt 90,0% (tiêu chuẩn EC quy định ≥ 90,0%).
• Độ lệch dương (PD) bằng 0,0% (tiêu chuẩn EC quy định ≤ 10,0%).
• Độ lệch âm (ND) là 9,1% (tiêu chuẩn EC quy định ≤ 10,0%).

Thứ năm, độ thu hồi trung bình của Ciprofloxacin trên nền mẫu thịt lợn dao động trong khoảng từ 81,0% đến 109,2% tại cả 3 mức nồng độ 5,00; 7,50 và 10,00 µg/kg (thỏa mãn khung tiêu chuẩn 70% đến 110%). Độ biến thiên lặp lại (%CV lặp lại) đạt từ 7,99% đến 10,64% và độ biến thiên tái lặp (%CV tái lặp) đạt từ 8,63% đến 9,43%, thấp hơn rất nhiều so với ngưỡng khống chế tối đa 21% và 32% của Ủy ban Châu Âu. Khi thử nghiệm trên 17 mẫu thực địa từ các trại nuôi, phương pháp cho kết quả âm tính chuẩn xác, đồng thời nhận diện chính xác 100% mẫu mù kiểm tra chất lượng QC(+) và QC(-).

Thảo luận kết quả

Khi so sánh kết quả thực nghiệm với công bố của nhà sản xuất Bioo Scientific (LOD lý thuyết 0,525 µg/kg), giá trị LOD thu được tại phòng thí nghiệm là 1,52 µg/kg có sự chênh lệch đáng kể. Nguyên nhân chính bắt nguồn từ ảnh hưởng của hiệu ứng nền mẫu thịt lợn tươi thực tế (matrix effect), độ ẩm, hàm lượng mỡ và sai số thao tác trong môi trường phòng thử nghiệm thông thường. Điều này chứng minh rằng việc thẩm định lại bộ kit thương mại trên nền mẫu cụ thể tại cơ sở là bước đi bắt buộc để tránh hiện tượng dương tính giả hoặc âm tính giả.

Dữ liệu phân tích trong nghiên cứu có thể được trực quan hóa rất hiệu quả thông qua các công cụ đồ thị và bảng biểu chuyên dụng. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan nghịch giữa nồng độ chuẩn Ciprofloxacin và mật độ quang học (OD) được mô tả tối ưu bằng đồ thị hồi quy bán logarit dạng đường thẳng dốc xuống, giúp kỹ thuật viên dễ dàng tra cứu nồng độ mẫu thử. Bên cạnh đó, kết quả phân loại mẫu có thể được tổng hợp thành bảng ma trận nhị phân 2x2 gồm bốn đại lượng: Dương tính thật (TP), Dương tính giả (FP), Âm tính thật (TN) và Âm tính giả (FN). Cách trình bày này giúp các nhà quản lý chất lượng quan sát trực quan độ tin cậy vượt trội của kỹ thuật ELISA.

Ý nghĩa khoa học và kinh tế của việc chuẩn hóa phương pháp thể hiện ở chỗ: Phòng kiểm nghiệm DABACO đã thiết lập được quy tắc diễn giải kết quả rõ ràng dựa trên ngưỡng CCβ = 1,60 µg/kg. Mọi mẫu thịt có nồng độ dưới 1,60 µg/kg được kết luận an toàn và cho phép lưu thông ngay, trong khi các mẫu nghi ngờ có nồng độ từ 1,60 µg/kg trở lên sẽ được chuyển tiếp sang hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS) để phân tích khẳng định. Mô hình hai bước này giúp doanh nghiệp tiết kiệm khoảng 70% đến 80% chi phí thử nghiệm và rút ngắn thời gian trả kết quả từ vài ngày xuống còn dưới 3 giờ so với việc chạy LC-MS/MS đơn lẻ cho toàn bộ các lô hàng.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng khoa học thu được, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp mang tính hành động cao nhằm hoàn thiện hệ thống kiểm soát chất lượng thực phẩm:

• Thứ nhất, chuẩn hóa và ban hành quy trình thao tác chuẩn (SOP): Ban Giám đốc và Phòng Quản lý Chất lượng DABACO cần phê duyệt, tích hợp chính thức quy trình phân tích sàng lọc ELISA Ciprofloxacin vào hệ thống quản lý ISO/IEC 17025:2005 của đơn vị trong quý II năm 2017. Mục tiêu là kiểm soát 100% các lô thịt tươi trước khi xuất xưởng ra thị trường.
• Thứ hai, thiết lập cơ chế kết nối phân tích khẳng định LC-MS/MS: Phòng Kiểm nghiệm cần ban hành quy định chuyển tiếp đối với các mẫu cho kết quả dương tính vượt ngưỡng CCβ 1,60 µg/kg. Các mẫu này phải được gửi phân tích khẳng định trên hệ thống sắc ký khối phổ LC-MS/MS trong vòng 24 giờ để đưa ra kết luận pháp lý cuối cùng, loại bỏ hoàn toàn nguy cơ sai sót.
• Thứ ba, tăng cường tần suất giám sát tại 45 trang trại vệ tinh: Ban Quản lý Chăn nuôi DABACO cần triển khai kế hoạch lấy mẫu ngẫu nhiên định kỳ tối thiểu 2 lần mỗi tháng tại toàn bộ các trại gia công ở Bắc Ninh, Hưng Yên, Hà Nội, Vĩnh Phúc và Hải Dương. Mục tiêu cụ thể là duy trì tỷ lệ mẫu thịt nhiễm tồn dư Ciprofloxacin ở mức 0,0% trong suốt giai đoạn 2017 đến 2020.
• Thứ tư, nâng cao năng lực kỹ thuật viên và kiểm soát điều kiện thử nghiệm: Định kỳ 6 tháng một lần, phòng thử nghiệm cần tổ chức đào tạo lại thao tác sử dụng micropipette, kiểm soát nhiệt độ phòng thí nghiệm ổn định ở 20 đến 25 độ C và duy trì bảo quản kit thử ở 2 đến 8 độ C. Biện pháp này nhằm đảm bảo hệ số biến thiên lặp lại của các phép đo luôn duy trì ở mức dưới 10,0%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang tính ứng dụng cao và là tài liệu tham khảo giá trị cho nhiều nhóm đối tượng:

• Cán bộ kỹ thuật và quản lý phòng kiểm nghiệm thực phẩm: Cung cấp tài liệu hướng dẫn từng bước về phương pháp thẩm định quy trình phân tích định tính theo Quyết định 2002/657/EC, hỗ trợ trực tiếp cho việc xây dựng hồ sơ công nhận tiêu chuẩn ISO/IEC 17025.
• Doanh nghiệp sản xuất chăn nuôi và chế biến thực phẩm theo chuỗi khép kín: Giúp các tập đoàn nông nghiệp học hỏi mô hình kiểm soát an toàn sinh học từ trang trại đến bàn ăn, tối ưu hóa ngân sách kiểm nghiệm an toàn thực phẩm thông qua kỹ thuật sàng lọc nhanh.
• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Thú y, Công nghệ thực phẩm, Hóa phân tích: Cung cấp nguồn tư liệu học thuật phong phú về cơ chế tồn dư kháng sinh, kỹ thuật ELISA cạnh tranh và phương pháp xử lý số liệu thống kê sinh học.
• Cơ quan quản lý nhà nước về thú y và an toàn vệ sinh thực phẩm: Cung cấp căn cứ khoa học thực tiễn để phục vụ việc sửa đổi, bổ sung các tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia về kiểm soát chất cấm và chất tồn dư trong nông nghiệp theo Thông tư 24/2013/TT-BYT.

Câu hỏi thường gặp

• Câu hỏi 1: Tại sao phòng thử nghiệm bắt buộc phải thẩm định lại bộ kit ELISA khi nhà sản xuất đã công bố sẵn thông số kỹ thuật? Trả lời: Nhà sản xuất kit Bioo Scientific công bố giới hạn LOD là 0,525 µg/kg trong điều kiện phân tích lý tưởng. Tuy nhiên, khi áp dụng thực tế trên nền mẫu thịt lợn tươi tại phòng kiểm nghiệm DABACO, giới hạn LOD thực nghiệm là 1,52 µg/kg. Theo Quyết định 2002/657/EC, phòng kiểm nghiệm bắt buộc phải xác định lại các thông số trên nền mẫu thực tế để chứng minh tính phù hợp của phương pháp, tránh sai số do hiệu ứng nền mẫu gây ra.

• Câu hỏi 2: Ý nghĩa của chỉ số khả năng phát hiện CCβ bằng 1,60 µg/kg là gì? Trả lời: Chỉ số CCβ = 1,60 µg/kg khẳng định rằng ở nồng độ tồn dư Ciprofloxacin từ 1,60 µg/kg trở lên trong thịt lợn tươi, phương pháp ELISA có khả năng phát hiện chính xác sự hiện diện của chất này với xác suất sai lỗi âm tính giả chỉ là 5% (β = 0,05). Đây là tiêu chí kỹ thuật then chốt bảo đảm phương pháp không bỏ lọt các mẫu thịt không an toàn.

• Câu hỏi 3: Nguyên lý hoạt động của phương pháp ELISA cạnh tranh trong phát hiện Ciprofloxacin là gì? Trả lời: Phương pháp dựa trên phản ứng cạnh tranh giữa Ciprofloxacin tự do trong dịch chiết mẫu thịt và Ciprofloxacin đã gắn sẵn ở đáy giếng với kháng thể kháng Ciprofloxacin. Sau khi rửa đĩa và cho cơ chất tạo màu TMB, nồng độ Ciprofloxacin trong mẫu càng cao thì lượng kháng thể gắn trên bề mặt giếng càng ít, dẫn đến cường độ màu đo ở bước sóng 450 nm càng giảm (tỷ lệ nghịch).

• Câu hỏi 4: Quy trình xử lý đối với các mẫu thịt lợn cho kết quả dương tính bằng kit ELISA được thực hiện như thế nào? Trả lời: Kỹ thuật ELISA đóng vai trò là phương pháp sàng lọc ban đầu với độ chính xác 95% và độ đặc hiệu 100%. Khi một mẫu thịt lợn cho kết quả đo vượt quá ngưỡng phát hiện 1,60 µg/kg, mẫu đó sẽ được gắn nhãn nghi ngờ và lập tức chuyển sang hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần LC-MS/MS để phân tích khẳng định cấu trúc và định lượng chính xác trước khi ra quyết định xử lý lô hàng.

• Câu hỏi 5: Độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp phân tích có đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế không? Trả lời: Thử nghiệm tại 3 mức nồng độ 5,00; 7,50 và 10,00 µg/kg cho thấy độ thu hồi đạt từ 81,0% đến 109,2%, nằm hoàn hảo trong giới hạn cho phép từ 70% đến 110%. Hệ số biến thiên độ lặp lại (%CV lặp lại) đạt từ 7,99% đến 10,64% và tái lặp (%CV tái lặp) đạt từ 8,63% đến 9,43%, vượt xa yêu cầu quy định tại Quyết định 2002/657/EC.

Kết luận

• Chuẩn hóa thành công phương pháp ELISA cạnh tranh xác định tồn dư Ciprofloxacin trong thịt lợn tươi với giới hạn LOD đạt 1,52 µg/kg và khả năng phát hiện CCβ đạt 1,60 µg/kg.
• Phương pháp đạt độ chính xác 95,0%, độ đặc hiệu tuyệt đối 100,0%, độ nhạy 90,0% cùng độ lệch âm cực thấp 9,1%, đáp ứng trọn vẹn Quyết định 2002/657/EC.
• Hiệu suất chiết tách và độ tin cậy vượt trội với khoảng độ thu hồi từ 81,0% đến 109,2% và hệ số biến thiên %CV luôn duy trì dưới ngưỡng 11,0%.
• Ứng dụng thực tiễn thành công trong việc giám sát chất lượng thịt tươi tại 45 trang trại vệ tinh thuộc Tập đoàn DABACO với sản lượng 7.000 tấn thịt mỗi năm.
• Tạo lập mô hình phân tích hai bước tối ưu kết hợp giữa sàng lọc nhanh bằng ELISA và khẳng định bằng LC-MS/MS giúp tiết kiệm 70% đến 80% chi phí vận hành.

Trong lộ trình phát triển giai đoạn tiếp theo, phòng kiểm nghiệm cần mở rộng phạm vi chuẩn hóa phương pháp ELISA cho các hoạt chất khác cùng nhóm Fluoroquinolone như Enrofloxacin và Norfloxacin trên đa dạng các nền mẫu thực phẩm gia cầm, thủy sản. Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm hãy áp dụng ngay bộ tiêu chí chuẩn hóa này để nâng tầm năng lực kiểm soát chất lượng, chung tay xây dựng chuỗi cung ứng thực phẩm sạch và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ ĐỨC DŨNG NGHIÊN CỨU CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG CIPROFLOXACIN TRONG THỊT LỢN BẰNG KỸ THUẬT ELISA TẠI PHÒNG KIỂM NGHIỆM CỦA CÔNG TY CỔ PHẦN TẬP ĐOÀN DABACO VIỆT NAM Chuyên ngành: Thú y Mã số : 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Dương Văn Nhiệm NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN - Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Ngô Đức Dũng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.

Dương Văn Nhiệm, người đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Thú y và Bộ môn Thú y cộng đồng đã tận tình dạy dỗ và đóng góp các ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi chân thành cảm ơn lãnh đạo Công ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam đã cho phép triển khai và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp của Phòng Kiểm nghiệm của Công ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam và gia đình đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Ngô Đức Dũng ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.v Danh mục bảng. vii Danh mục hình.

viii Trích yếu luận văn. ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài.

Tổng quan tài liệu. Tình hình an toàn thực phẩm. Tình hình an toàn thực phẩm trên thế giới. Tình hình an toàn thực phẩm ở Việt Nam.

Tình hình sản xuất chăn nuôi ở Việt Nam. Sản xuất và tiêu thụ thịt ở Việt Nam. Tình hình sản xuất, sử dụng, quản lý thuốc thú y trong chăn nuôi. Giới thiệu khái quát về công ty cổ phần tập đoàn dabaco việt nam.

Những hiểu biết cơ bản về kháng sinh nhóm Fluoroquinolone. Kháng sinh nhóm Fluoroquinolone. Kháng sinh Ciprofloxacin. Tồn dư kháng sinh trong thịt lợn và ảnh hưởng của chúng đối với sức khỏe cộng đồng.

Khái niệm về tồn dư. Ảnh hưởng của tồn dư kháng sinh trong thực phẩm đối với sức khỏe cộng đồng. Một số kỹ thuật phân tích dư lượng kháng sinh trong thực phẩm. Khái niệm về ELISA.

Phân loại ELISA. Ưu, nhược điểm của phương pháp phân tích định tính ELISA. Một số yếu tố ảnh hưởng tới kết quả phân tích của phương pháp ELISA. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu.

Thời gian nghiên cứu. Vật liệu, hóa chất và thuốc thử. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Nội dung nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp của kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định Ciprofloxacin trong mẫu thịt lợn tươi. Ứng dụng kết quả nghiên cứu của phương pháp để phân tích mẫu thực. Phương pháp phân tích số liệu.

Kết quả và thảo luận. Kết quả nghiên cứu tính phù hợp của kit elisa dùng cho phân tích định tính xác định Ciprofloxacin trong thịt lợn tươi. Kết quả nghiên cứu tính ổn định của kit ELISA. Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của kit ELISA.

Kết quả nghiên cứu khả năng phát hiện của kit (CCβ). Kết quả xác định độ chính xác (Accuracy: AC), độ đặc hiệu (Specificity: SP), độ nhạy (Sensitivity: SE), độ lệch dương (Positive deviation: PD) và độ lệch âm (negative deviation: ND). Kết quả xác định độ thu hồi, độ lặp lại và độ tái lặp. Kết quả phân tích dư lượng ciprofloxacin trong mẫu thịt lợn tươi bằng Kit Elisa.

Kết luận và kiến nghị. 44 Tài liệu tham khảo. 49 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt AC Accuracy Độ chính xác ADI Acceptable Daily Intake Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được CCα Decision limit Giới hạn quyết định CCβ Detection capability Khả năng phát hiện ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Phương pháp ELISA Assay EU European Union Liên hiệp Châu Âu FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp of the United Nations của Liên Hiệp Quốc FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phầm Hoa Kỳ FSIS Food Safety and Inspection Service Cơ quan Thanh tra và An toàn thực phẩm GMP Good Manufacturing Practice Thực hành sản xuất tốt HACCP Hazard Analysis and Critical Hệ thống phân tích mối nguy và kiểm Control Point System soát điểm tới hạn HPLC High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography LC/MS-MS Liquid Chromatography/Mass Sắc ký lỏng khối phổ hai lần Spectrometry LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện v LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa cho phép MRPL Minimum Required Performance Giới hạn phân tích tối thiểu của Limit phương pháp ND Negative deviation Độ lệch âm NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển nông thôn PD Positive deviation Độ lệch dương Ppb Parts per billion Phần tỷ SE Sensitivity Độ nhạy SP Specificity Độ đặc hiệu TĂCN Thức ăn chăn nuôi TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh IUPAC International Union of Pure and Liên minh Quốc tế về Hóa học thuần Applied Chemistry túy và Hóa học ứng dụng WTO World Trade Organization Tổ chức Thương mại thế giới vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Ký hiệu quy ước mô phỏng các phương pháp ELISA.

Tiêu chí đánh giá về độ thu hồi. Tiêu chí đánh giá về % CV. Kết quả phân tích kiểm tra đường chuẩn và tính ổn định của kit. Kết quả phân tích và kết quả tính toán giới hạn phát hiện (LOD) Ciprofloxacin trong thịt lợn tươi.

Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp ở nồng độ 1,6 g/kg. Kết quả phân tích mẫu xác định độ chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lệch âm và độ lệch dương của phương pháp. Kết quả phân tích về độ chính xác độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lệch âm và độ lệch dương. Kết quả đánh giá độ chính xác (AC), độ đặc hiệu, độ nhạy (SE), độ lệch dương (PD) và độ lệch âm (ND) của kit.

Độ thu hồi (R%), độ lặp lại và độ tái lặp của Ciprofloxacin trên nền mẫu thịt lợn tại 5 µg/kg. Độ thu hồi (R%), độ lặp lại và độ tái lặp của Ciprofloxacin trên nền mẫu thịt lợn tại 7,5 µg/kg. Độ thu hồi (R%), độ lặp lại và độ tái lặp của Ciprofloxacin trên nền mẫu thịt lợn tại 10 µg/kg. Kết quả phân tích dư lượng Ciprofloxacin trong mẫu thịt lợn tươi bằng kỹ thuật ELISA.

42 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2. Chuỗi giá trị sản xuất của Công ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam. Sơ đồ mô phỏng của phương pháp ELISA sandwich và ELISA cạnh tranh. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ chuẩn Ciprofloxacin và độ hấp thụ của kit.

34 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Ngô Đức Dũng Tên luận văn: Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp phân tích dư lượng ciprofloxacin trong thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA tại phòng kiểm nghiệm của Công ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam. Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: - Chuẩn hóa được phương pháp phân tích Ciprofloxacin trong thịt lợn tươi bằng kỹ thuật ELISA; - Ứng dụng phương pháp đã chuẩn hóa để kiểm soát tồn dư Ciprofloxacin trong thịt lợn tươi của Công ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam. Phương pháp: - Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp của kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định Ciprofloxacin trong mẫu thịt lợn tươi. - Ứng dụng kết quả nghiên cứu của phương pháp để phân tích mẫu thực - Phương pháp phân tích số liệu Kết quả chính và kết luận: 1.

Bộ kit ELISA dùng cho phân tích định tính dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn của hãng Biooscientific (MaxSignalTM Ciprofloxacin, mã 1068-01) đạt yêu cầu về tính ổn định; các thông số về khả năng phát hiện, hiệu lực của kit trong điều kiện phòng thử nghiệm của DABACO là: Độ chính xác (AC): 95% (AC ≥ 90%) Độ đặc hiệu: 100% (SP ≥ 90%) Độ nhạy (SE): 90% (SE ≥ 90%) Độ lệch dương (PD): 0% (PD ≤ 10%) Độ lệch âm (ND): 9,1% (ND ≤ 10%). Giới hạn phát hiện LOD là 1,52 µg/kg Khả năng phát hiện CCß là 1,60 µg/kg Độ thu hồi trong khoảng từ 81,0 - 109,2% Độ lặp lại là 7,99 – 10,64 ix Độ tái lặp 8,63- 9,43 Kết quả này đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp phân tích định tính theo quy định trong Quyết định 657/2002/EC. Phương pháp phân tích dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA đáp ứng các quy định trong Quyết định 657/2002/EC về yêu cầu kỹ thuật của một phương phấp phân tích sàng lọc. Phương pháp là phù hợp để ứng dụng tại phòng kiểm nghiệm của DABACO trong phân tích sàng lọc dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn.

Phòng thử nghiệm quy định diễm giải kết quả thử nghiệm phân tích dư lượng Ciprofloxacin trong thịt lợn bằng kỹ thuật ELISA theo khả năng phát hiện CCß là 1,60 µg/kg (mẫu thịt lợn dương tính dư lượng Ciprofloxacin, cần phân tích khẳng định bằng kỹ thuật LC/MS/MS). Master candidate: Ngo Duc Dung 2. Thesis title: "A study on validation of analysis method of Ciprofloxaxin residue in pork by the ELISA technique at the laboratory of DABACO Group”. Major: Veterinary Medicine Code: 60 64 01 01 4.

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives To validate the analysis method of Ciprofloxaxin residue in fresh pork by the ELISA technique. To apply the validated method to analyze Ciprofloxacin residue in fresh pork of DABACO Group. Materials and Methods Research experiment the suitability of ELISA kit used for qualitative analysis to determine Ciprofloxacin in fresh pork sample. Apply research results of method to analysis real sample.

Method of data analysis.