Tổng quan luận án
Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế quan trọng, phục vụ tiêu dùng nội địa và xuất khẩu. Tại Việt Nam, vùng Bắc Trung Bộ giữ vị trí trọng điểm về sản xuất lạc, chiếm 22,5% tổng diện tích và 21,6% tổng sản lượng cả nước (Tổng cục Thống kê, 2015). Trong đó, Nghệ An là địa phương có diện tích canh tác lớn nhất với 16.200 ha (chiếm 8,1% cả nước) và sản lượng đạt 37.300 tấn (chiếm 8,3% cả nước). Tuy nhiên, sản xuất lạc tại đây đối mặt với áp lực lớn từ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link gây ra. Loài nấm này không chỉ phá hủy hạt mà còn sinh tổng hợp độc tố aflatoxin—nhóm hợp chất có khả năng gây độc tế bào, quái thai và ung thư gan ở người và động vật. Các khảo sát thực địa tại Nghệ An ghi nhận tỷ lệ mẫu lạc nhiễm A. flavus lên tới 98,30%, trong đó 50,0% mẫu sinh độc tố aflatoxin và 16,67% vượt ngưỡng cho phép của Bộ Y tế (Lê Văn Giang và cs., 2011). Dù các biện pháp canh tác, tuyển chọn giống kháng và sử dụng các chủng A. flavus không độc đã được nghiên cứu, việc ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma bản địa để chuyên phòng trừ A. flavus và giảm thiểu aflatoxin trên lạc tại Nghệ An vẫn là một khoảng trống khoa học thực tiễn chưa được giải quyết đồng bộ.
Mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể trong văn bản:
- Mục đích: Tuyển chọn được các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc Aspergillus flavus hại cây lạc trồng tại Nghệ An; xây dựng được quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng.
- Yêu cầu:
- Tuyển chọn được các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc Aspergillus flavus hại lạc tại Nghệ An.
- Xây dựng được quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng.
Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Các loài nấm Trichoderma phân lập từ các mẫu đất trồng lạc, sử dụng trong phòng trừ nấm A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc tại Nghệ An.
- Phạm vi nghiên cứu: Tập trung tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học đạt mật độ bào tử cao và ứng dụng chế phẩm phòng trừ A. flavus cho vùng chuyên canh lạc tại tỉnh Nghệ An. Địa bàn thu thập mẫu và triển khai khảo nghiệm thực địa tập trung tại các huyện Nghi Lộc, Diễn Châu, Nam Đàn, Hưng Nguyên, Yên Thành, Anh Sơn (Nghệ An), mở rộng thu mẫu đất so sánh tại Thanh Hóa và Hà Tĩnh. Thời gian thực hiện các nội dung điều tra, thực nghiệm kéo dài từ năm 2011 đến năm 2015.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu trên thế giới và trong nước xoay quanh cây lạc, bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus, tình trạng ô nhiễm aflatoxin và các biện pháp quản lý sinh học:
Về quy mô sản xuất và dịch tễ học bệnh mốc vàng: Theo số liệu FAO (2016), sản xuất lạc thế giới giai đoạn 2000–2014 tăng từ 23,260 triệu ha lên 26,542 triệu ha; sản lượng tăng từ 34,720 triệu tấn lên 43,915 triệu tấn. Chi Aspergillus được Florentine mô tả năm 1729, loài A. flavus được Link mô tả năm 1890 và giai đoạn hữu tính được xác định là Petromyces flavus. Nấm tồn tại trong đất dưới dạng bào tử, sợi nấm hoặc hạch nấm qua 3 năm (Horn et al., 1995; Amaike et al., 2011). Mầm bệnh xâm nhiễm trực tiếp qua tiếp xúc giữa vỏ quả với đất, gia tăng nghiêm trọng khi hạn hán hoặc tổn thương cơ giới (Pitt et al., 1991; Mehan et al., 1991). Độc tố aflatoxin gồm các dạng chính B1, B2, G1, G2; trong đó A. flavus sinh tổng hợp chủ yếu B1 và B2 (Yu, 2012). Độc tố rất bền nhiệt và không bị phân hủy khi đun nấu thông thường (Martinez et al., 1994). Nhiều quốc gia ghi nhận mức ô nhiễm nghiêm trọng: Thái Lan có 49% mẫu lạc nhiễm aflatoxin với hàm lượng trung bình 1.530 µg/kg (Mehan et al., 1991); Nigeria có 94/98 mẫu nhiễm (Mehan et al., 1991); Kenya có mẫu vượt quá 10 µg/kg (Mutegi et al., 2012); Đài Loan ghi nhận 32,7% mẫu nông sản lạc nhiễm độc tố (Chen et al., 2013).
Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Mehan (1994), Nguyễn Thị Ly (1996), Ngô Bích Hảo (1996, 2007) và Đậu Ngọc Hào (2003) xác định A. flavus phân bố rộng khắp các vùng đất trồng lạc với mật độ cao, trong đó mẫu đất Nghệ An có mật độ mầm bệnh lớn nhất (437–8.250 mầm bệnh/g đất). Ngay sau thu hoạch, 66% số mẫu lạc đã nhiễm nấm và sau bảo quản tăng lên 82% (Nguyễn Thị Ly, 1996). Mức độ tích lũy aflatoxin B1 tại miền Bắc dao động từ 12,5 đến 150 µg/kg và miền Nam từ 5,0 đến 125 µg/kg (Mehan và cs., 1996).
Về các biện pháp phòng trừ và tác nhân sinh học:
- Biện pháp canh tác và giống: Bón vôi làm giảm tỷ lệ xâm nhiễm (Fernandez et al., 1997; Nguyễn Thị Hiên, 2008); luân canh cây trồng giúp giảm tích lũy nguồn nấm trong đất (Ortiz et al., 2002). Các chương trình chọn tạo giống của ICRISAT (Waliyar et al., 2003, 2005) tuyển chọn được các dòng ICGV kháng nấm; tại Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo giống L17 (dòng D8) kháng nấm với tỷ lệ nhiễm 16% (Nguyễn Văn Thắng, 2010).
- Biện pháp sinh học bằng vi sinh vật: Hoa Kỳ ứng dụng chủng A. flavus AF36 không sinh độc tố để cạnh tranh vị trí xâm nhiễm (Cotty, 1994; United States, 2002); Argentina sử dụng các chủng không độc tương tự (Alaniz et al., 2003). Tại Việt Nam, Nguyễn Thị Xuân Sâm và cs. (2011) nghiên cứu chủng A. flavus TH97; Lê Thiên Minh và Nguyễn Thùy Châu (2010) khảo nghiệm chủng A. flavus DA2; Nguyễn Thùy Châu (2000) khai thác hoạt chất Iturin A từ Bacillus subtilis 61s.
- Ứng dụng chi Trichoderma: Các công trình thế giới chỉ rõ nấm Trichoderma đối kháng qua cơ chế cạnh tranh, ký sinh trực tiếp, tiết enzyme phân giải vách tế bào (chitinase, β-1,3-glucanase) và sản sinh kháng sinh bay hơi (Saba et al., 2012; Qualhato et al., 2013; Siddiquee et al., 2012; Rekha et al., 2012). Đối với A. flavus, các nghiên cứu của Calistru et al. (1997), Srilakshmi et al. (2001), Thakur et al. (2003), Anjaiah et al. (2006) và Nyasha et al. (2015) ghi nhận hiệu lực ức chế sợi nấm và giảm lượng aflatoxin. Riêng loài Trichoderma asperellum (được Samuels xác lập danh pháp năm 1999) thể hiện hoạt tính enzyme và khả năng kiểm soát nấm bệnh phổ rộng (Sriram et al., 2013; Lin et al., 2014; El_Komy, 2015). Tại Việt Nam, các chế phẩm Trichoderma đã được phát triển như TRiB1, TRICÔ-ĐHCT, Vi-ĐK, NLU-Tri (Trần Thị Thuần, 1997, 2000; Dương Minh và cs., 2005, 2008; Trần Kim Loang và cs., 2008; Phạm Ngọc Dung và cs., 2012).
Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Hầu hết các công trình nghiên cứu và chế phẩm thương mại Trichoderma tại Việt Nam chỉ tập trung phòng trừ nấm lở cổ rễ, thối rễ, héo vàng (Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophthora spp., Sclerotium rolfsii). Chưa có công trình nào nghiên cứu toàn diện, có hệ thống từ khâu phân lập nguồn nấm Trichoderma asperellum bản địa trong đất trồng lạc tại Nghệ An, đánh giá khả năng đối kháng với A. flavus, giải trình tự gen định danh, xây dựng quy trình nhân nuôi sinh khối rắn, cho tới khảo nghiệm đồng ruộng nhằm giảm tỷ lệ bệnh mốc vàng và hạ thấp hàm lượng độc tố aflatoxin trong bảo quản.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết của đề tài dựa trên nguyên lý kiểm soát sinh học nấm bệnh vùng rễ thông qua tác nhân đối kháng vi nấm. Nấm Trichoderma spp. khống chế vi nấm gây hại qua các cơ chế: (1) Cạnh tranh không gian sinh sống và nguồn dinh dưỡng; (2) Ký sinh trực tiếp trên hệ sợi nấm đích nhờ tổng hợp các enzyme lytic ngoại bào như chitinase và β-1,3-glucanase làm thủy phân vách tế bào; (3) Sinh tổng hợp các chất kháng sinh bay hơi và không bay hơi ức chế sự nảy mầm của bào tử và tăng trưởng sợi nấm; (4) Kích thích phản ứng tự vệ chủ động của cây chủ. Về phân loại học, luận án kết hợp khóa phân loại hình thái truyền thống với công nghệ sinh học phân tử hiện đại: phân tích trình tự vùng gen ITS-rDNA (Internal Transcribed Spacer) và sử dụng công cụ chuyên dụng TrichOKEY để định danh chính xác đến loài.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế kết hợp định tính và định lượng:
- Phương pháp điều tra, lấy mẫu: Tuân thủ quy chuẩn lấy mẫu của Hiệp hội Kiểm nghiệm Hạt giống Quốc tế (ISTA, 1986). Thu thập 450 mẫu hạt lạc bảo quản tại nông hộ thuộc 6 huyện của Nghệ An (Nghi Lộc, Diễn Châu, Nam Đàn, Hưng Nguyên, Yên Thành, Anh Sơn; mỗi xã lấy 45 mẫu). Thu thập 245 mẫu hạt lạc tại 7 chợ đầu mối thuộc TP. Vinh (Ga, Vinh, Quán Lau, Quang Trung) và huyện Nghi Lộc (Nghi Ân, Sơn, Mới; mỗi chợ 35 mẫu). Mẫu đất được lấy tại vùng rễ cây lạc ở các địa bàn điều tra của Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh.
- Phương pháp phân lập và xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin: Phân lập A. flavus trên môi trường PDA và WA 0,01%. Đánh giá khả năng sinh aflatoxin bằng môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut Agar Medium - CAM) theo phương pháp của Lin et al. (1976) và Abbas et al. (2004), ghi nhận huỳnh quang màu xanh da trời/xanh lá cây dưới ánh sáng đèn cực tím (UV bước sóng 365 nm) và sắc tố vàng cam mặt đáy khuẩn lạc.
- Phương pháp phân lập và tuyển chọn nấm đối kháng Trichoderma: Sử dụng môi trường chọn lọc TSM (Trichoderma Specific Medium). Đánh giá khả năng đối kháng in vitro bằng phương pháp nuôi kép (dual culture) xác định chỉ số ức chế sinh trưởng bán kính PIRG (%) sau 7 ngày nuôi cấy. Đánh giá tác động của chất kháng sinh bay hơi bằng phương pháp nuôi hai đĩa thạch úp đối diện nhau sau 5 ngày nuôi cấy.
- Phương pháp sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số của 15 chủng Trichoderma có hoạt tính đối kháng cao nhất, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ vùng gen ITS-rDNA, giải trình tự tại Trung tâm BIOTEC (Thái Lan), đối chiếu cơ sở dữ liệu quốc tế bằng phần mềm TrichOKEY v.2.0 và thiết lập cây phả hệ di truyền.
- Phương pháp công nghệ vi sinh sản xuất chế phẩm: Khảo sát môi trường nhân giống cấp 1 (nguồn cacbon glucose, dịch chiết giá đỗ trong môi trường lỏng sau 72 giờ ở 30°C); xác định thời điểm thu hồi sinh khối giống cấp 2; tối ưu hóa cơ chất lên men rắn (thóc, cám, tỷ lệ thóc/nước, điều kiện túi bọc kín hoặc để hở, chế độ đảo trộn và thời gian chiếu sáng) sau 10 ngày nuôi cấy.
- Đánh giá an toàn sinh học: Cho chuột bạch thí nghiệm uống dịch chế phẩm và theo dõi biến động khối lượng cơ thể cùng các biểu hiện bệnh lý sau 7 ngày.
- Phương pháp khảo nghiệm hiệu lực phòng trừ: Khảo sát trong điều kiện nhà lưới (đánh giá mật độ, thời điểm, phương pháp xử lý) và bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB) với 3 lần nhắc lại trên giống lạc L14 tại Nghi Lộc trong hai vụ xuân liên tiếp (2014 và 2015). Đánh giá mật độ quần thể Trichoderma, tần suất xuất hiện trên rễ, mật độ mầm bệnh A. flavus trong đất, tỷ lệ bệnh trên vỏ quả và nhân hạt lúc thu hoạch, tỷ lệ nhiễm nấm sau bảo quản 12 tháng và hiệu quả kinh tế trên mô hình sản xuất 1 ha vụ xuân 2015.
- Xử lý số liệu thống kê: Phân tích phương sai (ANOVA), so sánh các giá trị trung bình bằng phép thử sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa (LSD ở mức α = 0,05) và hệ số biến thiên (CV%) thông qua các phần mềm thống kê chuyên ngành.
| Nhóm dữ liệu / Chỉ tiêu theo dõi |
Nguồn mẫu / Quy mô thực nghiệm |
Phương pháp phân tích / Đánh giá |
| Mẫu hạt lạc nông hộ |
450 mẫu (6 huyện tại Nghệ An) |
Tiêu chuẩn ISTA (1986), giám định hình thái vi nấm |
| Mẫu hạt lạc từ chợ |
245 mẫu (7 chợ tại Vinh và Nghi Lộc) |
Giám định nấm mốc trên đĩa thạch PDA |
| Khả năng sinh độc tố aflatoxin |
Các chủng A. flavus phân lập từ hạt và đất |
Môi trường CAM, soi đèn cực tím (UV 365 nm) |
| Tuyển chọn Trichoderma |
Mẫu đất Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh |
Nuôi cấy kép tính PIRG (%), đĩa úp kháng sinh bay hơi |
| Định danh loài vi nấm |
15 nguồn Trichoderma triển vọng cao |
Giải trình tự gen ITS-rDNA, phần mềm TrichOKEY |
| Tối ưu hóa sản xuất chế phẩm |
Chủng T. asperellum (Tri.NC) |
Lên men lỏng và lên men xốp trên cơ chất thóc |
| Khảo nghiệm nhà lưới & đồng ruộng |
Giống lạc L14 tại Nghi Lộc (xuân 2014–2015) |
Bố trí khối ngẫu nhiên (RCB), phân tích ANOVA/LSD |
Nội dung chính theo từng chương
Chương I. Tổng quan tài liệu
Chương I tổng thuật chi tiết bức tranh toàn cảnh về sản xuất lạc, dịch tễ bệnh mốc vàng, độc tính của aflatoxin và các biện pháp kiểm soát sinh học. Về số liệu sản xuất, tài liệu dẫn chứng diện tích lạc thế giới tăng từ 23,260 triệu ha (năm 2000) lên 26,542 triệu ha (năm 2014), năng suất đạt 1,82 tấn/ha và sản lượng đạt 43,915 triệu tấn (Bảng 1.1). Tại Việt Nam, diện tích dao động từ 263,7 nghìn ha (2004) xuống 208,7 nghìn ha (2014), nhưng năng suất tăng từ 17,8 tạ/ha lên 21,7 tạ/ha (Bảng 1.2). Nghệ An có diện tích giảm từ 24,1 nghìn ha (2004) xuống 18,0 nghìn ha (2014) với sản lượng 36,5 nghìn tấn (Bảng 1.3). Tình trạng ô nhiễm nấm A. flavus và aflatoxin được tổng hợp qua khảo sát của Mehan và cs. (1996) tại miền Bắc và miền Nam (Bảng 1.4). Nguyễn Thị Ly (1996) xác lập tương quan giữa tỷ lệ nhiễm nấm và hàm lượng độc tố (Bảng 1.5): mẫu hạt nhiễm nấm dưới 8% chỉ có 10% mẫu chứa aflatoxin, nhưng mẫu nhiễm trên 8% có tới 91,6% mẫu chứa aflatoxin với hàm lượng lên tới 500 µg/kg. Về tác nhân sinh học, chương I tập trung phân tích đặc tính của chi Trichoderma, đặc biệt là loài T. asperellum, khả năng sản sinh enzyme lytic chitinase, β-glucanase và các hợp chất kháng sinh bay hơi; phân tích cơ chế cạnh tranh và các công trình sản xuất chế phẩm sinh học trên cơ chất hữu cơ.
| Chỉ tiêu / Năm |
2004 |
2007 |
2010 |
2014 |
| Diện tích lạc Việt Nam (nghìn ha) |
263,7 |
254,5 |
231,4 |
208,7 |
| Năng suất lạc Việt Nam (tạ/ha) |
17,8 |
20,0 |
21,1 |
21,7 |
| Sản lượng lạc Việt Nam (nghìn tấn) |
469,0 |
510,0 |
487,2 |
453,3 |
| Diện tích lạc Nghệ An (nghìn ha) |
24,1 |
24,4 |
21,9 |
18,0 |
| Năng suất lạc Nghệ An (tạ/ha) |
20,2 |
21,7 |
21,1 |
20,3 |
| Sản lượng lạc Nghệ An (nghìn tấn) |
48,7 |
53,0 |
46,1 |
36,5 |
Chương II. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương II mô tả toàn bộ hệ thống vật liệu, thiết bị, quy trình lấy mẫu và các kỹ thuật thực nghiệm. Luận án sử dụng các mẫu đất thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh; mẫu hạt lạc từ các hộ dân và các chợ; giống lạc L14; chủng nấm Trichoderma asperellum (Tri.NC); các môi trường nuôi cấy PDA, CAM, WA 0,01%, TSM. Trang thiết bị gồm nồi hấp Hirayama HV-50, tủ sấy Memmert UNB500, tủ định ôn Binder BD 53, máy lắc NB 101-MH. Nội dung nghiên cứu gồm 4 phần: điều tra thực trạng nhiễm A. flavus; phân lập, tuyển chọn và định danh Trichoderma; nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học; nghiên cứu kỹ thuật sử dụng chế phẩm ngoài đồng ruộng. Phương pháp nuôi kép trên đĩa petri được chuẩn hóa để đo đường kính tản nấm, tính hiệu lực ức chế PIRG (Hình 2.1). Phương pháp đánh giá chất kháng sinh bay hơi sử dụng hai đáy đĩa petri đối nhau gắn kín bằng parafilm (Hình 2.2). Kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên phản ứng PCR vùng gen ITS-rDNA thực hiện tại Trung tâm BIOTEC (Thái Lan). Quy trình bố trí thí nghiệm đồng ruộng theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB) 3 lần nhắc lại, theo dõi các chỉ tiêu sinh học và phân tích phương sai thống kê.
Chương III. Kết quả và thảo luận
Chương III trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được qua 5 nội dung chính:
- Thực trạng nhiễm nấm A. flavus và độc tố aflatoxin:
- Thành phần nấm hại trên hạt lạc và trong đất tại Nghệ An năm 2012 ghi nhận sự xuất hiện của nhiều chi nấm bệnh, trong đó A. flavus chiếm tỷ lệ ưu thế (Bảng 3.1 và Bảng 3.4).
- Tỷ lệ nhiễm A. flavus trên hạt lạc thu từ các chợ thuộc huyện Nghi Lộc và TP. Vinh dao động từ 15,2% đến 38,5% (Bảng 3.2). Mẫu lạc tại nông hộ có tỷ lệ nhiễm bình quân từ 12,4% đến 29,8%, cao nhất tại các vùng chuyên canh huyện Nghi Lộc và Diễn Châu (Bảng 3.3).
- Tỷ lệ nhiễm A. flavus trong đất trồng lạc tại các điểm điều tra năm 2012 biến động mạnh, ghi nhận mật độ mầm bệnh cao tại các chân đất cát pha và đất bãi chuyên màu (Bảng 3.5).
- Khả năng sinh độc tố aflatoxin trên môi trường CAM dưới ánh sáng UV cho thấy phần lớn các chủng A. flavus phân lập từ chợ, nông hộ và đất trồng lạc đều phát huỳnh quang dương tính và đổi màu môi trường thành vàng cam (Bảng 3.6, Bảng 3.7, Bảng 3.8).
- Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm đối kháng Trichoderma:
- Tần suất xuất hiện Trichoderma trong đất trồng lạc tại các điểm thu mẫu giai đoạn 2011–2013 đạt tỷ lệ cao (Bảng 3.9). Khảo sát khả năng đối kháng của các nguồn nấm phân lập từ Nghệ An (Bảng 3.10), Thanh Hóa (Bảng 3.11) và Hà Tĩnh (Bảng 3.12) đối với chủng nấm A. flavus (A.011NA) sau 7 ngày nuôi cấy đã sàng lọc được nhiều chủng có chỉ số PIRG vượt trên 70%.
- Thử nghiệm hiệu lực ức chế bằng chất kháng sinh bay hơi sau 5 ngày nuôi cấy ghi nhận nhiều chủng có khả năng kìm hãm đường kính tản nấm A. flavus rõ rệt (Bảng 3.13).
- Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen ITS-rDNA của 15 nguồn nấm đối kháng xuất sắc nhất qua phần mềm TrichOKEY v.2.0 và phân tích phả hệ (Hình 3.1, Hình 3.2) xác định các chủng này thuộc loài Trichoderma asperellum (Bảng 3.14). Đặc điểm hình thái của chủng tuyển chọn Tri.NC được mô tả chi tiết: khuẩn lạc màu xanh lục đậm, cấu trúc sinh bào tử phân nhánh đặc trưng (Bảng 3.15, Hình 3.3).
- Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất chế phẩm sinh học:
- Nghiên cứu môi trường lỏng cấp 1: Loại môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sinh khối sợi nấm (Bảng 3.16). Khối lượng đường glucose bổ sung tối ưu đạt ở nồng độ thích hợp (Bảng 3.17); dịch chiết giá đỗ đóng vai trò nguồn dinh dưỡng hữu cơ kích thích nấm phát triển mạnh sau 72 giờ ở 30°C (Bảng 3.18, Hình 3.4).
- Thời gian thu hồi sinh khối nhân giống cấp 2 thích hợp nhất được xác lập để đảm bảo mật độ tế bào hữu hiệu (Bảng 3.19, Hình 3.5).
- Cơ chất rắn lên men nhân sinh khối: Đánh giá sự phát triển của chủng Tri.NC trên các loại phụ phẩm nông nghiệp sau 10 ngày cho thấy hạt thóc là giá thể ưu việt nhất (Bảng 3.20). Tỷ lệ phối trộn thóc/nước đạt tối ưu ở mức ẩm độ thích hợp (Bảng 3.21). Thử nghiệm túi bọc kín kết hợp đảo trộn định kỳ (Bảng 3.22) so với túi để hở (Bảng 3.23) khẳng định chế độ đảo trộn và độ thoáng khí vừa phải giúp nấm hình thành bào tử đồng đều. Thời gian chiếu sáng thích hợp kích thích sự tạo bào tử mạnh (Bảng 3.24). Quy trình sản xuất hoàn chỉnh (Hình 3.6) tạo ra chế phẩm sinh học đạt mật độ bào tử 5,3 × 10^9 bt/g.
- Kiểm tra an toàn sinh học: Chế phẩm không làm suy giảm khối lượng hay gây triệu chứng nhiễm độc trên chuột thí nghiệm sau 7 ngày theo dõi (Bảng 3.25).
- Nghiên cứu kỹ thuật sử dụng chế phẩm T. asperellum phòng trừ A. flavus:
- Thí nghiệm nhà lưới sau 4 tuần gieo: Nấm T. asperellum thể hiện khả năng ức chế mật độ mầm bệnh A. flavus rõ rệt ở các công thức mật độ xử lý khác nhau (Bảng 3.26); thời điểm xử lý trước khi gieo cho hiệu lực cao nhất (Bảng 3.27); phương pháp kết hợp xử lý hạt giống và bón đất rãnh giảm số lượng mầm bệnh sâu nhất (Bảng 3.28, Hình 3.7).
- Thí nghiệm đồng ruộng vụ xuân 2014 và 2015 tại Nghi Lộc:
- Chế phẩm giúp T. asperellum thiết lập và duy trì quần thể ổn định trong đất vùng rễ cây lạc đến giai đoạn thu hoạch (Bảng 3.29).
- Tần suất xuất hiện của T. asperellum trên rễ lạc đạt tỷ lệ cao ở các công thức bón đất kết hợp xử lý hạt giống (Bảng 3.30, Hình 3.8).
- Mật độ mầm bệnh A. flavus trong đất vùng rễ giảm mạnh so với đối chứng không xử lý (Bảng 3.31).
- Năng suất lạc thương phẩm của các công thức sử dụng chế phẩm tăng rõ rệt so với đối chứng (Bảng 3.32).
- Tỷ lệ quả lạc nhiễm nấm A. flavus lúc thu hoạch giảm đáng kể (Bảng 3.33); tỷ lệ hạt nhiễm nấm khi thu hoạch cũng giảm sâu (Bảng 3.34).
- Đặc biệt, sau 12 tháng bảo quản, tỷ lệ hạt lạc nhiễm A. flavus ở các lô xử lý chế phẩm duy trì ở mức rất thấp so với đối chứng nhiễm nặng (Bảng 3.35).
- Xây dựng mô hình thực nghiệm diện rộng:
- Mô hình sử dụng chế phẩm T. asperellum trên giống lạc L14 vụ xuân 2015 tại Nghi Lộc cho thấy hiệu lực phòng trừ nấm mốc A. flavus ngoài đồng ruộng đạt hiệu quả kỹ thuật vượt trội (Bảng 3.36).
- Phân tích hiệu quả kinh tế trên 1 ha mô hình khẳng định việc ứng dụng chế phẩm làm tăng năng suất thực thu, giảm thất thoát sau thu hoạch và nâng cao giá trị lợi nhuận thuần cho người sản xuất lạc (Bảng 3.37).
Kết quả và những đóng góp mới
Luận án đã đạt được các kết quả khoa học và đóng góp mới sau:
- Đóng góp về mặt khoa học:
- Là công trình nghiên cứu toàn diện, có hệ thống đầu tiên tại Việt Nam về việc phân lập, tuyển chọn và ứng dụng nấm đối kháng bản địa Trichoderma asperellum chuyên dùng để kiểm soát nấm mốc Aspergillus flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc tại Nghệ An.
- Ứng dụng thành công kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên giải trình tự toàn bộ vùng gen ITS-rDNA kết hợp với phần mềm chuyên dụng TrichOKEY để định danh chính xác 15 nguồn nấm Trichoderma có hoạt tính đối kháng cao, xác nhận chúng thuộc loài Trichoderma asperellum.
- Làm rõ cơ chế đối kháng của chủng T. asperellum (Tri.NC) đối với A. flavus thông qua khả năng ký sinh, ức chế sinh trưởng khuẩn lạc và sinh tổng hợp các hợp chất kháng sinh bay hơi.
- Đóng góp về mặt thực tiễn:
- Đề xuất và hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học Trichoderma asperellum bằng phương pháp lên men rắn trên cơ chất hạt thóc, đạt mật độ bào tử cao 5,3 × 10^9 bào tử/gam, an toàn đối với động vật máu nóng (chuột thí nghiệm).
- Xác lập biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm sinh học hiệu quả ngoài đồng ruộng (kết hợp xử lý hạt giống và bón vào đất vùng rễ), giúp duy trì mật độ nấm có ích, ức chế mầm bệnh A. flavus, làm giảm tỷ lệ hạt nhiễm nấm và giảm lượng độc tố aflatoxin trong quá trình bảo quản 12 tháng đạt 92,08%.
- Xây dựng thành công mô hình sản xuất 1 ha lạc vụ xuân tại huyện Nghi Lộc, chứng minh hiệu quả kỹ thuật, bảo vệ phẩm chất nông sản và nâng cao hiệu quả kinh tế.
Kiến nghị và giải pháp đề xuất của tác giả:
- Cho phép mở rộng ứng dụng quy trình sản xuất và sử dụng chế phẩm T. asperellum tại các vùng chuyên canh lạc khác của Nghệ An và các tỉnh Bắc Trung Bộ.
- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện dạng chế phẩm thương mại (như dạng bột thấm nước hoặc dạng hạt) nhằm kéo dài thời hạn bảo quản chế phẩm và thuận tiện cho vận chuyển, cơ giới hóa canh tác.
- Kết hợp sử dụng chế phẩm sinh học Trichoderma với các biện pháp quản lý cây trồng tổng hợp (ICM), sử dụng giống kháng và kỹ thuật làm khô nhanh sau thu hoạch để bảo đảm an toàn thực phẩm.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của luận án:
- Phạm vi nghiên cứu thực địa và xây dựng mô hình sản xuất tập trung chủ yếu tại địa bàn huyện Nghi Lộc và một số huyện thuộc tỉnh Nghệ An; các địa phương lân cận như Thanh Hóa, Hà Tĩnh mới dừng lại ở mức độ thu thập mẫu đất để so sánh hoạt tính đối kháng.
- Thử nghiệm đồng ruộng và mô hình sản xuất quy mô lớn mới tập trung đánh giá trên giống lạc chủ lực L14 trong vụ xuân, chưa tiến hành khảo nghiệm mở rộng trên nhiều bộ giống khác nhau hoặc trên các trà lạc thu đông.
- Luận án tập trung vào công nghệ lên men rắn trên cơ chất thóc truyền thống ở quy mô phòng thí nghiệm và xưởng nhỏ; chưa khảo nghiệm công nghệ bào chế dạng lỏng hay bổ sung chất mang để kéo dài tuổi thọ bào tử trong điều kiện bảo quản nhiệt độ phòng trên 12 tháng.
Hướng nghiên cứu tiếp theo được văn bản đề xuất:
- Mở rộng khảo nghiệm hiệu lực phòng trừ của chế phẩm nấm T. asperellum trên các giống lạc khác nhau và các vùng sinh thái trồng lạc khác trên phạm vi toàn quốc.
- Nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính và cơ chế tác động của các enzyme ngoại bào (chitinase, glucanase) cũng như nhận diện bản chất hóa học các hợp chất kháng sinh bay hơi do chủng T. asperellum (Tri.NC) tiết ra.
- Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm quy mô công nghiệp, tối ưu hóa chất phụ gia bảo quản và đăng ký danh mục thuốc bảo vệ thực vật sinh học phục vụ sản xuất an toàn.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho nhiều nhóm đối tượng:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Bảo vệ thực vật, Nông học, Vi sinh vật học ứng dụng và Công nghệ sinh học: Cung cấp phương pháp luận chặt chẽ trong phân lập vi nấm đất, kỹ thuật đánh giá đối kháng in vitro, kỹ thuật giải trình tự gen ITS-rDNA định danh Trichoderma bằng TrichOKEY và phương pháp sàng lọc vi nấm sinh độc tố aflatoxin bằng môi trường CAM dưới tia UV.
- Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Nguồn tư liệu toàn diện với hệ thống số liệu dịch tễ học về A. flavus, mức độ ô nhiễm aflatoxin trên nông sản và cơ sở dữ liệu vi sinh vật bản địa vùng Bắc Trung Bộ.
- Cán bộ khuyến nông và nhà hoạch định chính sách nông nghiệp: Cung cấp giải pháp kỹ thuật cụ thể về liều lượng, phương pháp xử lý chế phẩm sinh học để kiểm soát mốc vàng từ ngoài đồng ruộng đến kho bảo quản, hỗ trợ định hướng phát triển sản xuất lạc an toàn, bền vững.
- Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học: Tham khảo trực tiếp quy trình nhân nuôi hai pha (lên men lỏng cấp 1, cấp 2 và lên men rắn trên thóc) để sản xuất chế phẩm vi sinh đạt chuẩn độ 5,3 × 10^9 bt/g.
Câu hỏi thường gặp
1. Luận án sử dụng phương pháp nào để phát hiện nhanh các chủng Aspergillus flavus có khả năng sinh độc tố aflatoxin?
Luận án sử dụng môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut Agar Medium - CAM) dựa trên phương pháp của Lin et al. (1976) và Abbas et al. (2004). Khi nuôi cấy các chủng A. flavus phân lập được trên môi trường CAM, chủng nào có khả năng sinh aflatoxin sẽ phát huỳnh quang màu xanh da trời hoặc xanh lá cây dưới ánh sáng đèn cực tím (UV bước sóng 365 nm) sau 32–72 giờ nuôi cấy, đồng thời mặt đáy khuẩn lạc xuất hiện màu trắng chuyển dần sang vàng cam.
2. Chủng nấm Trichoderma nào được lựa chọn để sản xuất chế phẩm và được định danh bằng kỹ thuật gì?
Chủng nấm được lựa chọn là nguồn Trichoderma ký hiệu Tri.NC, phân lập từ mẫu đất trồng lạc tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An. Chủng này được định danh chính xác là loài Trichoderma asperellum bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự toàn bộ vùng gen ITS-rDNA (thực hiện tại Trung tâm BIOTEC, Thái Lan), sau đó đối chiếu cơ sở dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng TrichOKEY v.2.0 kết hợp xây dựng cây phả hệ di truyền.
3. Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm T. asperellum sử dụng cơ chất gì và đạt mật độ bào tử bao nhiêu?
Quy trình sản xuất gồm nhân giống cấp 1 và cấp 2 trong môi trường lỏng có bổ sung đường glucose và dịch chiết giá đỗ ở nhiệt độ 30°C trong 72 giờ, sau đó cấy vào cơ chất lên men rắn là hạt thóc đã hấp khử trùng. Môi trường thóc được điều chỉnh tỷ lệ nước thích hợp, đóng túi kín có đảo trộn định kỳ và chiếu sáng theo chu kỳ. Sau 10 ngày nuôi cấy, chế phẩm thu được đạt mật độ bào tử 5,3 × 10^9 bào tử/gam và vượt qua thử nghiệm an toàn sinh học trên chuột bạch.
4. Hiệu quả của chế phẩm T. asperellum đối với việc hạn chế độc tố aflatoxin trong bảo quản lạc đạt kết quả như thế nào?
Kết quả khảo nghiệm theo dõi hạt lạc sau thu hoạch từ các công thức có xử lý chế phẩm T. asperellum tại Nghi Lộc cho thấy: sau 12 tháng bảo quản, tỷ lệ hạt lạc nhiễm nấm A. flavus giảm rõ rệt so với đối chứng không xử lý, làm giảm hàm lượng độc tố aflatoxin tích lũy trong quá trình bảo quản lên tới 92,08%.
5. Biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm ngoài đồng ruộng được khuyến cáo như thế nào để đạt hiệu quả cao nhất?
Hiệu quả phòng trừ cao nhất đạt được khi áp dụng biện pháp phối hợp: vừa xử lý hạt giống lạc bằng chế phẩm T. asperellum trước khi gieo, vừa bón chế phẩm vào đất theo rãnh trước khi đặt hạt giống. Phương pháp kết hợp này giúp nấm T. asperellum nhanh chóng thiết lập quần thể dày đặc tại vùng rễ cây lạc, ức chế trực tiếp mầm bệnh A. flavus trong đất suốt chu kỳ sinh trưởng của cây cho đến tận khi thu hoạch.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Hồ Thị Nhung là công trình nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp chuyên sâu, giải quyết thành công bài toán kiểm soát sinh học nấm Aspergillus flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc tại Nghệ An. Thông qua việc phân lập, tuyển chọn và định danh phân tử vùng gen ITS-rDNA, luận án đã xác định loài nấm đối kháng bản địa Trichoderma asperellum (Tri.NC) có hoạt tính ức chế nấm bệnh vượt trội qua cơ chế cạnh tranh và kháng sinh bay hơi. Đề tài đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân nuôi bán rắn trên cơ chất thóc đạt mật độ bào tử 5,3 × 10^9 bào tử/gam, chứng minh tính an toàn sinh học và hiệu quả thực địa trong việc giảm thiểu 92,08% độc tố aflatoxin sau 12 tháng bảo quản. Các kết quả và mô hình thực nghiệm 1 ha tại Nghi Lộc cung cấp luận cứ khoa học vững chắc và giải pháp kỹ thuật có tính ứng dụng cao cho ngành sản xuất lạc bền vững.
